基于3種載體蛋白的萊克多巴胺抗原的合成與檢測

賈愛娟，劉 姚，張 挺，沈 興

（1.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽產(chǎn)品精準(zhǔn)加工與安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東 廣州 510405）

基于3種載體蛋白的萊克多巴胺抗原的合成與檢測

賈愛娟1，劉 姚2，張 挺3，沈 興2

（1.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽產(chǎn)品精準(zhǔn)加工與安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3.廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東 廣州 510405）

為制備高效萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）抗體，將人工合成的RAC-琥珀酸酯半抗原與3種載體蛋白（BSA、OVA和KLH）偶聯(lián)合成人工抗原，采用紫外光譜掃描、測定偶聯(lián)比和ESI-MS進(jìn)行鑒定；通過免疫小鼠獲得抗血清，采用ELISA比較其效價(jià)，對3種人工抗原的免疫原性進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果顯示3種抗血清效價(jià)為4 000～32 000，表明合成的3種人工抗原都具有免疫原性，其中以KLH為載體蛋白的抗原的免疫效果較好，可用于制備高效RAC抗體。

萊克多巴胺；載體蛋白；半抗原；人工抗原；免疫原性

萊克多巴胺（ractopamine，RAC）又稱為雷托巴胺，化學(xué)名4-｛3-〔2-羥基-2-（4-羥基苯基）-乙基〕氨基丁基｝苯酚，分子式為C18H23NO3。RAC屬于β-腎上腺素受體激動(dòng)劑類藥物，能選擇性激動(dòng)支氣管平滑肌的β-受體，臨床上用于治療呼吸道疾病，如支氣管炎、哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫等［1］。然而，一些不法商人將RAC用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)，這是由于當(dāng)RAC的使用量達(dá)到臨床用量的5～10倍時(shí)，具有增加動(dòng)物的日增重、提高飼料利用率、促進(jìn)家禽肌肉的生長、降低脂肪含量等效果［2］。在動(dòng)物養(yǎng)殖中過度使用RAC，會(huì)使其殘留在動(dòng)物性食物中，并通過食物鏈進(jìn)入人體，給消費(fèi)者帶來極大的安全隱患。RAC主要危害人體心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起肌肉震顫、心動(dòng)過速和頭痛［3］。目前，全球超過150個(gè)國家已明確禁止RAC作為飼料添加劑在養(yǎng)殖業(yè)中使用［4］，但RAC非法使用的現(xiàn)象依然存在。因此加強(qiáng)動(dòng)物性食物中RAC的檢測至關(guān)重要。

RAC傳統(tǒng)的儀器檢測方法主要有高效液相（HPLC）［5-6］、液質(zhì)聯(lián)用法（LC–MS/MS）［7-8］、氣質(zhì)聯(lián)用法［9-10］、毛細(xì)管電泳［11-12］、拉曼光譜［13］等。儀器檢測方法具有很好的靈敏度及檢測線，但是樣品前處理復(fù)雜、耗時(shí)長、儀器費(fèi)用昂貴，且不利于大量樣品的篩選。免疫檢測法是基于抗原抗體相互作用發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性高、快速、簡單、高通量檢測、成本低等特點(diǎn)，目前常用于RAC的免疫檢測技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附檢測［14］、免疫層析法［15-18］、熒光免疫檢測［19-23］等，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了一些免疫傳感器，如電化學(xué)［24］、表面等離子共振［3，25］?？贵w作為免疫檢測技術(shù)的核心試劑，對免疫分析的靈敏度、特異性等起著至關(guān)重要的作用，而制備高親和力抗體的關(guān)鍵是抗原的制備。

大多數(shù)藥物分子質(zhì)量小于1 000 u，屬于僅有反應(yīng)原性而無免疫原性的半抗原。RAC分子量為337.85，屬于小分子化合物，其本身沒有免疫原性，因此合成人工抗原是建立免疫檢測方法的第一步。載體蛋白本身的抗原性、溶解性和偶聯(lián)基團(tuán)數(shù)量直接影響免疫過程，由不同的載體蛋白構(gòu)建的人工抗原，其免疫原性存在差異［26］。本研究選取三種蛋白，卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）和匙孔血藍(lán)蛋白（KLH）作為載體蛋白，與RAC-琥珀酸酯偶聯(lián)后合成3種人工抗原，免疫小鼠獲得抗血清之后，采用ELISA測定其效價(jià)和抑制率，并對其免疫原性進(jìn)行了比較和評(píng)價(jià)，為RAC殘留免疫學(xué)檢測方法的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑：萊克多巴胺（RAC）標(biāo)準(zhǔn)品、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、 牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA），Sigma-Aldrich Co. LLC 公司；琥珀酸酐、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），百靈威科技；匙孔血藍(lán)蛋白（KLH），PIERCE公司；HRP-標(biāo)記羊抗鼠抗體，武漢博士德生物公司；薄層層析硅膠板、柱層析硅膠，中國青島海洋化工集團(tuán)公司。試驗(yàn)所用到的其他試劑均為分析純。

主要儀器：U-3010紫外可見光譜掃描儀，日本Hitachi公司；Wallac VICTOR31420多標(biāo)記分析儀，PE公司；LCQDECA液質(zhì)聯(lián)用儀，F(xiàn)innigan公司；6K 15冷凍離心機(jī)，Sigma-Satorius公司；自動(dòng)洗板機(jī)DEM-3型，北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司；透析袋（最大截留分子量6 000 D），進(jìn)口分裝（美國，BIOSHARP）；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，深圳金燦華有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萊克多巴胺半抗原合成 參照文獻(xiàn)［27-28］的琥珀酸酐法合成半抗原（RACSA），如圖1所示。稱取鹽酸萊克多巴胺1 020 mg （約3.0 mmol），加入10 mL無水吡啶中，磁力攪拌器上攪拌溶解，然后加入琥珀酸酐360 mg （約3.0 mmol），再室溫避光攪拌24 h。反應(yīng)完成后，加入等體積的飽和碳酸氫鈉溶液，混勻；用乙酸乙酯萃取5次除去水相中的吡啶和未反應(yīng)的原料；用6 mol/L的鹽酸調(diào)水相pH至5.0左右，用乙酸乙酯萃取5次；取有機(jī)相，用無水硫酸鈉除水，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸干，得到RAC-SA半抗原粗產(chǎn)物，在反應(yīng)過程中對粗產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)點(diǎn)板（薄層色譜（Thin layer chromatography，TLC），V二氯甲烷∶V甲醇∶V氨水=4∶1∶0.1），觀察反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)的位置和形態(tài)。粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化得到較純的半抗原，用ESI-MS進(jìn)行鑒定。

圖1 萊克多巴胺人工抗原的合成路線圖［28］

1.2.2 萊克多巴胺人工抗原的合成 （1）RACSA-OVA的合成：取RAC半抗原40.1 mg（0.1 mmol），溶于300 μL DMF中，加入DCC 24.7 mg、NHS 13.8 mg，攪拌，室溫反應(yīng)8 h，將反應(yīng)物10 000 r/min離心10 min，取上清，記為A液；取OVA 90 mg，溶于9 mL預(yù)冷的0.1 mol/L、pH 8.5的硼酸緩沖液中攪拌使充分溶解，記為B液。將A液加到B液中，在30 min內(nèi)加完，置于4℃攪拌過夜。次日，將反應(yīng)液于4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液裝入透析袋中，用生理鹽水于4℃透析3 d，每天換4次透析液。透析后，將人工抗原分裝于-20℃儲(chǔ)存。

（2）RAC-SA-BSA的合成：取BSA 132 mg，溶于10 mL預(yù)冷的0.1 mol/L、pH 8.5的硼酸緩沖液中（B液）。半抗原活化方法及其他步驟與RAC-SA-OVA合成相同。

（3）RAC-SA-KLH的合成：取2 mL去離子水注射到KLH瓶中（蛋白質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL）緩慢攪拌使其充分溶解，作為B液。半抗原活化方法及其他步驟與RAC-SA-OVA合成相同。

1.2.3 萊克多巴胺人工抗原的鑒定 將萊克多巴胺半抗原、BSA、OVA、KLH 以及3種人工抗原，配制成一定濃度的溶液，使純蛋白濃度與人工抗原濃度相同，用紫外掃描儀對200～400 nm波長掃描，得到它們的紫外吸收光譜，比較人工抗原紫外吸收曲線與游離半抗原、載體蛋白差異。根據(jù)公式：K=OD值/C（K為摩爾消光系數(shù)；C為各物質(zhì)摩爾濃度） ，分別計(jì)算半抗原、BSA、OVA、KLH的摩爾消光系數(shù)。在純蛋白和半抗原的最大波長處檢測人工抗原的光吸收值，計(jì)算半抗原與蛋白在人工抗原中的摩爾濃度比（人工抗原OD值用OD偶表示）即偶聯(lián)比［29］：

式中，Ca、Cb分別為RAC和蛋白質(zhì)的濃度，OD偶280、OD偶274分別為偶聯(lián)產(chǎn)物在蛋白質(zhì)特征吸收峰（280 nm）、RAC特征吸收峰（274 nm）的吸光度，KBSA280、KRAC280分別為載體蛋白BSA和RAC在蛋白質(zhì)特征吸收峰處的消光系數(shù)，KBSA274、KRAC274分別為載體蛋白BSA和RAC在RAC特征吸收峰處的消光系數(shù)。載體蛋白OVA和KLH的偶聯(lián)比計(jì)算公式與此類似。

1.2.4 萊克多巴胺人工抗原免疫原性檢測 將人工抗原用生理鹽水稀釋至1 mg/mL，50 μL的人工抗原與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，在Balb/c小鼠的腹腔和足墊進(jìn)行注射，50 ng/只。2周后加強(qiáng)免疫，免疫劑量同基礎(chǔ)免疫，改用弗氏不完全佐劑，每2周加強(qiáng)免疫1次，從第3次加強(qiáng)免疫開始，免疫后8～10 d尾部采血，所得血樣與37℃恒溫水浴箱中靜止1 h，12 000 r/min離心10 min，取上清即為抗RAC抗血清。

1.2.5 抗血清效價(jià)和抑制檢測 用RAC-SABSA、RAC-SA-OVA抗原作為RAC-SA-KLH抗血清的包被原，用RAC-SA-OVA抗原作為RAC-SA-BSA抗血清的包被原，用RAC-SABSA作為RAC-SA-OVA抗血清的包被原。分別包被適當(dāng)?shù)臐舛?00 μL/孔，4℃過夜，洗板3次；每孔加200 μL封閉液，37℃封閉2 h，洗滌同上。

加樣：最后一行作為空白對照組外，其余各列孔加入 100 μL 溶液、50 μL 從 1∶1 000 開始倍比稀釋的待檢血清、50 μL PBST或50 μL稀釋RAC藥物，其中加入PBST的用于測定抗血清效價(jià)，加入50 μL稀釋藥物的用于測定抗血清抑制，37℃反應(yīng)1 h，洗滌同上；加酶標(biāo)二抗，每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠IgG （1∶10 000倍稀釋），37℃反應(yīng)1 h，洗滌同上。

顯色：每孔加入新鮮配制的底物顯色液（TMB 10 mg/mL 的 100 μL，30% H2O22 μL，溶于10 mL pH 5.0的檸檬酸緩沖液中）100 μL，置于37℃顯色15 min。顯色終止：每孔加入50 μL的終止液（2 mol/L H2SO4）終止反應(yīng)。

測定吸光值：用酶標(biāo)儀測定各孔A450nm的吸光值。在測定抗血清效價(jià)組以A450nm值在1附近時(shí)抗血清稀釋度作為該抗血清效價(jià)。計(jì)算抗體血清抑制率：

式中，A效價(jià)為未加藥物的酶標(biāo)孔在450 nm下的吸光值，A抑制為添加RAC藥物的酶標(biāo)孔在450 nm下的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原鑒定

半抗原RAC-SA合成后，經(jīng)ESI-MS 全掃描質(zhì)譜驗(yàn)證。從圖2可以看出，RAC-SA不純，436.3組分為本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的半抗原。

圖2 RAC-SA半抗原ESI-MS峰圖

2.2 紫外全波長掃描鑒定人工抗原合成

圖3分別為抗原RAC-SA-BSA、半抗原萊克多巴胺-琥珀酸酯和BSA的紫外掃描對照圖。BSA分別在278、212 nm處有2 個(gè)吸收峰，半抗原萊克多巴胺-琥珀酸酯分別在273、266 nm 處有2 個(gè)吸收峰，而RAC-SA-BSA 則在278、219 nm處分別有2個(gè)吸收峰。RAC-SABSA的蛋白濃度與BSA的濃度均為0.5 mg/mL，而RAC-SA-BSA的吸光值明顯高于BSA，偶聯(lián)前BSA在212 nm吸收峰在偶聯(lián)后移至219 nm，兩譜線在可見光區(qū)（300～400 nm） 的差異特別明顯，BSA在可見光區(qū)幾乎沒有吸收，而RACSA-BSA則有明顯的吸收。這可能是萊克多巴胺-琥珀酸酯與BSA偶聯(lián)后相互疊加的結(jié)果。因此可以基本認(rèn)定RAC-SA-BSA的偶聯(lián)是成功的。由此可計(jì)算RAC-SA-BSA的偶聯(lián)比為18∶1。同理，也可推斷出RAC-SA–OVA、RACSA–KLH合成成功，偶聯(lián)比分別為15∶1和50∶1。

圖3 人工抗原紫外掃描圖譜

2.3 抗血清效價(jià)和抑制檢測

成功合成的3個(gè)人工抗原免疫小鼠獲得抗血清后，用ELISA檢測抗血清的效價(jià)和抑制率，結(jié)果見表1。RAC-SA-BSA 第3次免疫后抗血清檢測，包被原為RAC-SA-OVA濃度2.0 μg/mL，抗血清效價(jià)為4 000 ，抑制率達(dá)到69.2%；RAC-SA-OVA 第3次免疫后抗血清檢測，包被原為RAC-SA-BSA濃度2 μg/mL，抗血清效價(jià)為8 000，抑制率達(dá)到35%；RACSA-KLH 第3次免疫后抗血清檢測，包被原為RAC-SA-BSA濃度0.5 μg/mL，抗血清效價(jià)為32 000，抑制率達(dá)到68%。以上結(jié)果說明3種人工抗原免疫小鼠后得到的抗血清中均產(chǎn)生了針對RAC的抗體。

表1 3種人工抗原獲得的抗血清效價(jià)和抑制率

3 結(jié)論

本研究以萊克多巴胺為研究對象，在其酚羥基引入連接臂結(jié)構(gòu)-酯鍵、用于偶聯(lián)載體蛋白的活性基團(tuán)和活性偶聯(lián)基團(tuán)-羧基，得到萊克多巴胺的結(jié)構(gòu)衍生物。采用DCC法將該衍生物分別與OVA、BSA和KLH偶聯(lián)制備3種不同的人工抗原。經(jīng)紫外掃描后，發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)產(chǎn)物具有載體蛋白和RAC的紫外吸收特征峰，表明3種人工抗原制備成功。

3種人工抗原分別免疫Balb/c小鼠，獲得針對RAC的特異性抗血清，ELISA鑒定其效價(jià)均在4 000～32 000范圍內(nèi)，以KLH為載體蛋白的人工抗原的免疫效果最好。其原因可能與載體蛋白來源不同有關(guān)，BAS和OVA來源于哺乳動(dòng)物血清白蛋白，對于小鼠而言，BSA和OVA本身的免疫原性較弱；KLH來源于無脊椎動(dòng)物的血藍(lán)蛋白，對于小鼠而言，KLH本身的免疫原性較強(qiáng)。另外，人工抗原需要與佐劑乳化，注射小鼠之后，載體蛋白會(huì)有一個(gè)復(fù)性過程，復(fù)性后的蛋白在空間結(jié)構(gòu)上可能會(huì)發(fā)生一些變化；在這個(gè)過程中，KLH不存變形-復(fù)性，故能很好的保持原有的天然免疫性［26，30-31］。

為制備抗RAC抗體，建立RAC免疫學(xué)檢測方法，合成具有抗原性的RAC人工抗原至關(guān)重要。本研究獲得了抗RAC特異性較強(qiáng)的抗血清，為進(jìn)一步研究和建立RAC免疫學(xué)分析方法奠定了基礎(chǔ)。

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Synthesis and testing the ractopamine antigens conjugating with three different carrier proteins

JIA Ai-juan1，LIU Yao2，ZHANG Ting3，SHEN Xing2
（1. Guangdong Meiweixian seasoning Food Co.，Ltd.，Zhongshan 528400，China；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety/ National-Local Joint Engineering Research Center for Processing and Safety Control of Livestock and Poultry Products，Guangzhou 510642，China；3. Department of Food，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China）

In order to prepare anti-RAC antibody with high affinity，the synthesized hapten RAC-succinic acid ester was conjugated with three different carrier proteins （BSA，OVA，KLH）. After identified by UV spectroscopy scanning，ESI-MS and conjugation ratio，the successfully synthesized artificial antigens were used to immunize mouse.The titers of the obtained antiserum was detected by ELISA. The titers of the three artificial antigens were 4 000-32 000.The results showed that the three artificial antigens had satisfactory immunogenicity，and the immunogenicity of KLH was better than that of BSA and OVA. Therefore，the antigen can be used to prepare high affinity antibody.

ractopamine；carrier protein；hapten；artificial antigen；immunogenicity

S816.7

A

1004-874X（2017）07-0125-07

賈愛娟，劉姚，張挺，等. 基于3種載體蛋白的萊克多巴胺抗原的合成與檢測［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：125-131.

2017-07-03

國家自然科學(xué)基金（31601555）

賈愛娟（1974-），女，碩士，高級(jí)工程師，E-mail：zlb@mwx.cn

沈興（1987-），女，博士，副教授，E-mail：shenxing325@163.com

（責(zé)任編輯 鄒移光）