40種中草藥殺滅離體多子小瓜蟲效果研究

王 彬，張其中，陳本亮，付耀武

（暨南大學(xué)水生生物研究所/熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心/廣東省高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632）

40種中草藥殺滅離體多子小瓜蟲效果研究

王 彬，張其中，陳本亮，付耀武

（暨南大學(xué)水生生物研究所/熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心/廣東省高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632）

研究了40種中草藥不同濃度水提物對多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）的離體殺滅效果，結(jié)果表明：夏枯草、仙鶴草和三七等18種中草藥在濃度為50 g/L時(shí)才能在4 h內(nèi)殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體；藥物濃度為10 g/L時(shí)，槐花、皂角刺和毛冬青等13種中草藥可殺滅滋養(yǎng)體；藥物濃度為1 g/L時(shí)，紫荊和鵝不食草即可殺滅滋養(yǎng)體；藥物濃度為0.1 g/L時(shí)，只有生姜能殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體。生姜水提物對滋養(yǎng)體和幼蟲的最低致死濃度分別為100、50 mg/L，半數(shù)有效濃度分別為30.3、15.7 mg/L，100 mg/L可完全抑制包囊孵化。由此可見生姜是一種可有效殺滅多子小瓜蟲的中草藥。

中草藥；生姜；殺蟲活性；多子小瓜蟲

多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifiliis）屬纖毛蟲綱（Oligohymenophorea）凹口科（Ophryoglenidae）小瓜蟲屬（Ichthyophthirius），是淡水寄生纖毛原生動(dòng)物，其生活史滋養(yǎng)體（寄生階段）、包囊（離體繁殖階段）和感染性幼蟲（感染階段）3個(gè)階段［1］。該蟲主要寄生在魚鰓和皮膚上，致使魚體分泌大量粘液，造成魚呼吸困難，同時(shí)寄生處上皮細(xì)胞增生，出現(xiàn)許多小白點(diǎn)，因此，小瓜蟲病又稱“白點(diǎn)病”［2-3］。該病主要危害魚苗和魚種，嚴(yán)重時(shí)可引起病魚大批死亡，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的化學(xué)防治藥物（如孔雀石綠、硝酸亞汞、醋酸亞汞）［4-5］由于存在高毒高殘留、污染環(huán)境、致癌致畸性等隱患而被禁用［6］。目前預(yù)防多子小瓜蟲病的疫苗還處于研發(fā)階段［7］。因此，研究安全高效的新型殺小瓜蟲漁藥迫在眉睫。

我國具有豐富的中草藥資源，民間應(yīng)用藥用植物防治水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲病歷史悠久［8］。由于中草藥具有抗病毒、抗菌、抗應(yīng)激、提高免疫及環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)［9］，同時(shí)具有低毒、低殘留等特點(diǎn)，符合無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、生產(chǎn)綠色水產(chǎn)品的病害防治準(zhǔn)則。因此，漁用植物源殺蟲藥受到人們廣泛重視，已成為近年來研究和開發(fā)應(yīng)用的熱點(diǎn)。目前從五倍子、肉桂、桑白皮、白薇、姜黃、博落回、小果博落回中分離純化出五沒食子酰葡萄糖［10］、肉桂醛［11］、桑酮 G［12］、桑酮 O［12］、直立白薇苷 C［13］、姜黃素［14］、血根堿［15］、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿［16］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這些成分都具有良好的殺滅小瓜蟲活性。Yi等［17］選取30種中草藥的甲醇提取物進(jìn)行殺多子小瓜蟲活性實(shí)驗(yàn)，篩選出厚樸（Magnolia officinalis）和苦豆子（Sophora alopecuroides）兩種殺蟲效果最好的中藥，它們對幼蟲的EC50分別為2.45、3.43 mg/L。這為開發(fā)新型綠色環(huán)保藥物防治多子小瓜蟲病提供了新方向。

本研究挑選了40種中草藥，通過試驗(yàn)煎煮水提液的殺多子小瓜蟲滋養(yǎng)體活性，篩選出具有殺蟲活性的中草藥種類，進(jìn)一步研究殺滋養(yǎng)體效果最好的植物種類的殺幼蟲和抑制包囊孵化效果，以評價(jià)其用于防治多子小瓜蟲病的前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

查閱中國藥典（2005年版）一部，并根據(jù)其對中草藥種類和藥效記錄情況，篩選出40種可能具有殺蟲作用的植物（表1），用于殺滅離體小瓜蟲藥效研究。中草藥均購于廣州市石牌東路平價(jià)大藥房。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥液配制 每種中草藥干燥粉碎后各取10 g，用400 mL蒸餾水浸泡8 h，沸水煎煮40 min，抽濾提取液，重復(fù)操作兩次，合并濾液，再次煎煮濃縮至100 mL，使其終濃度為100 g/L。用蒸餾水以梯度稀釋法依次往下稀釋100 g/L中草藥濃縮液至實(shí)驗(yàn)所需濃度，同時(shí)設(shè)置只加蒸餾水的空白對照。

1.2.2 多子小瓜蟲的傳代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)于2016年5月在廣州市水生野生動(dòng)物保護(hù)基地進(jìn)行，選取患多子小瓜蟲病的草魚，飼養(yǎng)于直徑2 m的塑料魚池中，將健康無損、體長13.2（±2.5）cm、體重45.8（±3.4）g的草魚與其混養(yǎng)，每天更換1/3曝氣充分的水，溫度保持在24（±1）℃。當(dāng)草魚體表出現(xiàn)密集小白點(diǎn)時(shí)，收集小瓜蟲用于實(shí)驗(yàn)，在被感染草魚用完之前投入新的健康個(gè)體傳接多子小瓜蟲。

1.2.3 抑殺效果試驗(yàn) （1）滋養(yǎng)體：用吸管將寄生于草魚體表及鰓中成熟的小瓜蟲滋養(yǎng)體沖洗下來，經(jīng)漂洗濾去粘液等雜質(zhì)，收集到培養(yǎng)皿中，取12孔板，各孔吸入1 mL約含200個(gè)滋養(yǎng)體的蟲液，再分別加入1 mL不同濃度的藥液，各藥物濃度3個(gè)重復(fù)，溫度保持在24（±1）℃，4倍物鏡下觀察記錄各孔滋養(yǎng)體全部致死時(shí)間和死亡數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)，觀察以4 h為限，滋養(yǎng)體胞質(zhì)流停止，纖毛停止擺動(dòng)，表明蟲體死亡。

（2）包囊：在24孔板中，于各孔中吸入1 mL約含100個(gè)滋養(yǎng)體的蟲液，靜置4～6 h待其形成包囊后，再分別加入1 mL不同濃度的藥液，各藥物濃度3個(gè)重復(fù)。將24孔板于24℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置16～18 h，4倍物鏡下觀察孵化情況，計(jì)數(shù)各孔孵化幼蟲數(shù)。具體方法為：充分

混勻幼蟲液，用移液器取10 μL幼蟲液，加入等體積1%福爾馬林固定幼蟲，放計(jì)數(shù)框內(nèi)在4倍物鏡下計(jì)數(shù)幼蟲數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3個(gè)樣，求平均數(shù)，并最終計(jì)算平均每個(gè)包囊孵化的幼蟲數(shù)（各孔幼蟲總數(shù)/各孔包囊數(shù)）。包囊在藥物處理后的48 h內(nèi)未分裂，表明包囊死亡。

表1 供試中草藥名錄

（3）幼蟲：將培養(yǎng)皿中收集到的小瓜蟲滋養(yǎng)體在24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～22 h，直到釋放感染性幼蟲，充分混勻幼蟲，調(diào)整蟲液濃度（約1 000個(gè)/mL）。取24孔板，于各孔中吸入1 mL蟲液，再分別加入1 mL不同濃度的藥液，各藥物濃度3個(gè)重復(fù)，4倍物鏡下記錄不同濃度中幼蟲的致死時(shí)間。幼蟲停止游動(dòng)，其纖毛不動(dòng)或僅微微擺動(dòng)，很快變圓或裂解，表明幼蟲死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 軟件計(jì)算平均致死率、平均每個(gè)包囊孵化幼蟲數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差（±SD），用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析不同劑量濃度致死結(jié)果的顯著性差異及計(jì)算半數(shù)有效濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 40種中草藥水提物殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體的致死時(shí)間比較

40種不同濃度的中草藥水提物使全部滋養(yǎng)體死亡所需時(shí)間見表2。藥物濃度為0.1 g/L時(shí)，只有生姜能殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體，且致死時(shí)間為192 min；藥物濃度為1 g/L時(shí)，紫荊和鵝不食草亦可殺滅滋養(yǎng)體，致死時(shí)間分別為21、89 min；藥物濃度為10 g/L時(shí)，槐花、皂角刺和毛冬青等13種中草藥才可在4 h內(nèi)殺滅滋養(yǎng)體；夏枯草、仙鶴草和三七等18種中草藥在濃度為50 g/L時(shí)才能殺滅滋養(yǎng)體；澤蘭、女貞子和草果等6種中草藥對滋養(yǎng)體無明顯殺滅效果。對照組滋養(yǎng)體在4 h內(nèi)沒有死亡，形成包囊并孵化出感染性幼蟲?？梢?，生姜?dú)⒆甜B(yǎng)體效果最好，可進(jìn)一步研究其藥效。

2.2 生姜水提物對多子小瓜蟲滋養(yǎng)體、幼蟲的殺滅效果

不同濃度的生姜水提物處理多子小瓜蟲滋養(yǎng)體和幼蟲的死亡時(shí)間和4 h致死率見表3。使用濃度在100 mg/L時(shí)能100%殺滅滋養(yǎng)體，50 mg/L時(shí)作用4 h滋養(yǎng)體致死率為68.1%；殺滅幼蟲實(shí)驗(yàn)中，作用濃度在50 mg/L以上時(shí)可在4 h內(nèi)將幼蟲全部殺死，25 mg/L作用4 h對幼蟲致死率為76.4%。

表2 40種中草藥水提物殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體的致死時(shí)間（min）

表3 生姜水提物殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體、幼蟲的致死時(shí)間和致死率

用概率單位法（SPSS 22.0）計(jì)算生姜水提物對小瓜蟲滋養(yǎng)體和感染性幼蟲的半數(shù)有效濃度（EC50）分別為30.3、15.7 mg/L，95%置信區(qū)間分別為 19.5～48.1、9.8～24.6。

2.3 生姜水提物抑制多子小瓜蟲包囊孵化活性

由表4可知，100 mg/L生姜水提物能在4 h內(nèi)100%殺滅多子小瓜蟲包囊，完全抑制包囊孵化，稀釋一倍后對包囊的殺滅效果明顯降低，4 h的包囊致死率僅為10.5%，但在隨后的12 h孵化中，50 mg/L生姜水提物能顯著降低每個(gè)存活包囊釋放幼蟲的數(shù)量，與對照組相比，處理組平均每個(gè)包囊僅孵化出76.5個(gè)幼蟲；濃度為25、12.5 mg/L的處理組包囊孵化幼蟲數(shù)與對照組相比差異顯著。

表4 不同濃度生姜水提物抑制多子小瓜蟲包囊孵化活性

3 討論

本試驗(yàn)研究了40種中草藥對多子小瓜蟲的離體殺滅效果，結(jié)果表明，藥物濃度為0.1 g/L時(shí)，只有生姜能夠殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體；藥物濃度為1 g/L時(shí)，鵝不食草與紫荊等對滋養(yǎng)體也有明顯殺滅作用；藥物濃度為10 g/L時(shí)，槐花、皂角刺和毛冬青等13種中草藥可殺滅滋養(yǎng)體；而夏枯草、仙鶴草和三七等18種中草藥在濃度為50 g/L時(shí)才能在4 h內(nèi)殺滅多子小瓜蟲滋養(yǎng)體；澤蘭、女貞子和草果等6種中草藥對滋養(yǎng)體無明顯殺滅效果。殺蟲效果最佳的中草藥是生姜，通過各階段殺蟲活性實(shí)驗(yàn)可知，其對小瓜蟲滋養(yǎng)體、幼蟲、包囊的抑殺效果與藥物濃度呈正相關(guān)，濃度越高效果越好。另外，小瓜蟲生活史各階段蟲體對藥物的敏感度不同，滋養(yǎng)體（寄生階段）比幼蟲（感染階段）難殺滅，100 mg/L時(shí)可將滋養(yǎng)體全部殺死，而殺滅感染性幼蟲的最低有效濃度為50 mg/L，其對小瓜蟲滋養(yǎng)體和感染性幼蟲的半數(shù)有效濃度（EC50）分別為30.3、15.7 mg/L。包囊內(nèi)蟲體因外有包囊壁，藥物難滲透進(jìn)入其內(nèi)，抑殺難度最大［18］。但從表4可以看出，100 mg/L濃度處理包囊即可完全抑制其孵化，包囊內(nèi)蟲體在分裂中途死亡，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與滋養(yǎng)體4 h內(nèi)全部致死的最低濃度（100 mg/L）一致；包囊處理濃度稀釋一倍（50 mg/L）可顯著降低每個(gè)包囊釋放幼蟲的數(shù)量，與對照相比具有顯著的抑制孵化作用。因此，藥物濃度在50 mg/L時(shí)，對預(yù)防小瓜蟲病有一定作用，濃度在100 mg/L以上時(shí)可殺滅各階段蟲體，起到有效的治療效果。

本研究結(jié)果表明，大部分中草藥在高濃度時(shí)都對小瓜蟲均有一定抑殺效果，但高濃度藥物對魚體和水體存在安全隱患，且使用成本過高，因此實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。鉏超等［19］發(fā)現(xiàn)檳榔、烏梅、大黃、黃芩、貫眾、烏藥、枳殼等中草藥對離體小瓜蟲具有殺滅活性，0.1 g/L檳榔和烏梅對各個(gè)階段的蟲體均有殺滅效果，與生姜大致相當(dāng)；0.1 g/L大黃和黃芩1 h內(nèi)對幼蟲有殺滅效果，1 g/L濃度能殺滅成蟲和包囊，殺蟲活性弱于生姜。熱帶植物剌毛黧豆（Mucuna pruriens）的葉粗提液和木瓜（Carica papaya）種子粗提物對多子小瓜蟲的最低致死濃度分別為150、200 mg/L［20］，殺蟲活性亦不如生姜。選擇生姜作為今后開發(fā)新型綠色漁藥的研究對象，不僅因其具有良好的藥效，而且作為衛(wèi)生部首批公布的藥食兼用資源之一，其安全性將得到有效保障［21］。然而，生姜水提物雖具有顯著滅殺多子小瓜蟲的生物活性，但其有效成分和殺蟲機(jī)理有待深入研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究其活性單體，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定、藥效、安全性評價(jià)和穩(wěn)定性等分析，為開發(fā)制劑和進(jìn)行仿生合成提供前期基礎(chǔ)。

本研究證實(shí)生姜水提物對多子小瓜蟲的滋養(yǎng)體（寄生階段）、包囊（離體繁殖階段）和幼蟲（感染階段）均有較強(qiáng)殺滅作用。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物相比，生姜克服了藥物殘留、毒副作用、污染環(huán)境等缺點(diǎn)，具有開發(fā)天然、綠色、環(huán)保型漁藥的潛在價(jià)值。我國是生姜生產(chǎn)大國，資源豐富，其在新型環(huán)保漁藥的開發(fā)和應(yīng)用方面具有廣闊前景［22］。本研究不僅為開發(fā)無公害環(huán)保殺蟲漁藥提供了理論依據(jù)和開發(fā)思路，也為下一步從中草藥中分離純化殺蟲活性化合物提供了備選對象。

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Antiparasitic efficacy of 40 Chinese herbal medicines against Ichthyophthirius multifiliis in vitro

WANG Bin，ZHANG Qi-zhong，CHEN Ben-liang，F(xiàn)U Yao-wu
（Institute of Hydrobiology，Jinan University/ Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering，Ministry of Education/ Key Laboratory of Aquatic Eutrophication and Control of Harmful Algal Blooms of Guangdong Higher Education Institutes，Guangzhou 510632，China）

The present study investigated the in vitro antiparasitical efficacy of 40 Chinese herbal medicines water extracts againstIchthyophthirius multifiliis. The results showed that the water extracts ofPrunella vulgaris，Agrimonia eupatoria，Panax notoginseng，etc，at the concentration of 50 g/L could kill all trophonts within 4 h，the water extracts ofSophora japonica，Gleditsia sinensis，Llex pubescensand so forth at the concentration of 10 g/L could kill all trophonts，the water extracts ofCercis chinensisandHerba hydrocotylisresulted in 100% mortality of trophonts at the concentration of 1 g/L，the water extract ofZingiber officinaleat the concentration of 0.1 g/L resulted in 100% mortality of trophonts. The water extract ofZ. officinalshowed the highest antiprotozoal efficacy against trophonts and theronts，and the lethal concentrations to trophonts and theronts were 100 and 50 mg/L，respectively. The 4-h median effective concentration （EC50） values of water extract ofZ. officinalto trophonts and theronts were 30.3 mg/L and 15.7 mg/L，respectively. The water extract ofZ. officinal at a concentration of 100 mg/L eliminated the reproduction of all encysted tomonts. The results indicate thatZ. officinalis a potential new drug for the control of ichthyophthiriasis.

Chinese herbal medicine；Zingiber officinale；antiparasitic activity；Ichthyophthirius multifiliis

S852.72

A

1004-874X（2017）07-0147-07

王彬，張其中，陳本亮，等.40種中草藥殺滅離體多子小瓜蟲效果研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：147-153.

2017-05-11

廣東省海洋漁業(yè)科技攻關(guān)與研發(fā)項(xiàng)目（A201501B09）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201604020040）

王彬（1985-），男，在讀博士生， E-mail：jnuniversity@163.com

張其中（1962-），男，博士，教授，E-mail：zhangqzdr@126.com

（責(zé)任編輯 崔建勛）