Ni 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲包囊反應(yīng)的影響

夏 嬙，孫虹霞，劉宏宇

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海 519041;2.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275)

昆蟲雖然缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，不能合成脊椎動物的免疫球蛋白(Lavine and Strand，2002)，但這種相對簡單的免疫系統(tǒng)可使其成為環(huán)境污染的有效指示生物(Galloway and Depledge，2001)。隨著重金屬污染的日益嚴(yán)重，近年來國內(nèi)外關(guān)于重金屬污染對昆蟲免疫反應(yīng)影響得到極大關(guān)注。如Cd2+脅迫48-72 h 使棕尾別麻蠅Boettcherisca peregrina 幼蟲血細(xì)胞包囊作用顯著低于對照，Cd2+處理濃度達(dá)到150μg/g 時蛹的包囊率與對照相比顯著降低(李艷敏等，2010);而Ni 濃度達(dá)50μg/g 時即可使大蠟螟Galleria mellonella 產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答，并顯著抑制其酚氧化酶的活性(Dubovskiy et al.，2011);重金屬脅迫亦可使木蟻Formica aquilonia 及秋尺蠖Epirrita autumnata 產(chǎn)生免疫反應(yīng)(Sorvari et al.，2007;van Ooik et al.，2007)。重金屬對昆蟲免疫反應(yīng)影響與重金屬的特性、脅迫時間、生物體的發(fā)育程度、基因型、性別及所選用的免疫參數(shù)有關(guān)(van Ooik et al.，2007)。包囊反應(yīng)作為昆蟲免疫反應(yīng)的一個重要指標(biāo)，在昆蟲免疫學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。

由于工業(yè)生產(chǎn)中鎳(Ni)的不合理排放、污水灌溉及含Ni 肥料的過量施用，越來越多的Ni 及其化合物進(jìn)入農(nóng)業(yè)土壤(羅丹等，2010;Amin et al.，2013)，造成土壤Ni 含量的超標(biāo)(Cai et al.，2010;Li et al.，2012)。據(jù)廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所2005年的報(bào)道，Ni 是珠江三角洲近40%農(nóng)田土壤重金屬污染的第二大污染物，其超標(biāo)值最高可達(dá)59.3%。土壤中過量的Ni2+可在蔬菜中積累，對蔬菜產(chǎn)生毒害作用(Garrido et al.，2005)，從而對植食性昆蟲產(chǎn)生影響。

斜紋夜蛾Spodoptera litura Fabricius 是農(nóng)田重要的植食性害蟲，對多種作物尤其是蔬菜產(chǎn)生嚴(yán)重危害。前期研究表明，飼料中Ni2+可在斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)積累(孫虹霞等，2008)，并對其血淋巴中能源物質(zhì)(孫虹霞等，2010)、生長發(fā)育產(chǎn)生影響(Sun et al.，2007)。根據(jù)能量代謝、生長發(fā)育和免疫反應(yīng)之間的“trade-off”原則，幼蟲體內(nèi)積累的Ni2+是否會對斜紋夜蛾幼蟲的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響?基于此，本文研究了斜紋夜蛾5、6 齡幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率在120 h 內(nèi)的變化情況，為研究重金屬Ni 對斜紋夜蛾免疫功能的影響提供理論依據(jù)，并為全面研究Ni 脅迫對斜紋夜蛾的影響提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 斜紋夜蛾幼蟲的飼養(yǎng)與Ni2+脅迫

斜紋夜蛾系中山大學(xué)昆蟲學(xué)研究所養(yǎng)蟲室提供，飼養(yǎng)條件為(26±1)℃，L∶D=16∶8，RH(75±5)%。在人工飼料中添加不同劑量Ni2+，并以此連續(xù)3 代飼喂斜紋夜蛾幼蟲。以第1 代幼蟲化蛹后羽化成蟲所產(chǎn)的卵作為第2 代蟲源，第3 代依此類推，每天更換飼料并連續(xù)脅迫3 代。

根據(jù)Cai 等(2010)的報(bào)道，珠三角地區(qū)如東莞農(nóng)業(yè)土壤Ni 含量范圍為2.29-57.46 mg/kg，Macnicol and Beckett(1985)及 Garridoe 等(2005)的研究表明蔬菜中Ni 含量可達(dá)30 mg/kg;而斜紋夜蛾寄主之一Raphanus sativus L.中積累的Ni 含量在3.28-66.67 mg/kg 之間(Xu et al.，2008)。此外，我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)飼料中的Ni2+濃度高于50 mg/kg 時，第4 代成蟲所產(chǎn)卵的孵化率極低。因此，根據(jù)上述研究基礎(chǔ)，通過在人工飼料中添加不同濃度的NiCl26H2O，使飼料中Ni2+終濃度分別為1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg。以不添加Ni2+飼料飼養(yǎng)的斜紋夜蛾幼蟲為對照(記為0 mg/kg)。

1.2 包囊反應(yīng)的檢測

1.2.1 Sephadex G-25 葡聚糖凝膠珠的注射

Sephadex G-25 葡聚糖凝膠珠購于Pharmacia公司。芐基青霉素和鏈霉素購于Amersco 公司。參照文獻(xiàn)Richardsand Parkinson(2000)方法，用0.1%的堿性品紅將Sephadex G-25 葡聚糖凝膠珠染色過夜并置于紫外燈下自然晾干。使用時將凝膠珠溶于Pringle's 生理鹽水中(芐基青霉素和鏈霉素的終濃度分別為1000 U/mL 和1 mg/mL)。

待幼蟲進(jìn)入5 齡后，每隔24 h 隨機(jī)挑選各個處理長勢均一的10 頭幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直至幼蟲發(fā)育至6 齡末，分別記為0-24 h、24-48 h、48-72 h、72-96 h 及96-120 h 幼蟲。注射前將幼蟲冰上麻醉，然后用酒精棉球消毒蟲體。微量毛細(xì)管從第三腹足將凝膠珠注射入蟲體內(nèi)。0-24 h 幼蟲約注射20-25個凝膠珠，隨著蟲體的增大，注射的凝膠珠數(shù)目也逐漸增加，每次約增加8-12個凝膠珠，以保證不同發(fā)育期蟲體包囊作用的穩(wěn)定性。注射24 h 后解剖蟲體，相差顯微鏡(Carl Zeiss)下觀察凝膠珠的包囊情況。

1.2.2 包囊程度的分級

根據(jù)包囊的厚度對血細(xì)胞的包囊程度進(jìn)行劃分，每一類分別用漸次增加的數(shù)字表示。0 級:沒有血細(xì)胞黏附或只有數(shù)個血細(xì)胞黏附;1 級:包囊厚度小于凝膠珠半徑的1/2;2 級:包囊厚度大于凝膠珠半徑的1/2，小于半徑;3 級:包囊厚度大于凝膠珠半徑。根據(jù)凝膠珠被包囊的面積對血細(xì)胞的包囊程度進(jìn)行劃分，每一類也分別用漸次增加的數(shù)字表示。0 級:沒有血細(xì)胞黏附或只有數(shù)個血細(xì)胞黏附;1 級:包囊面積小于凝膠珠表面的1/2;2 級:包囊面積大于凝膠珠表面的1/2(Hu et al.，2003)。

每一時間點(diǎn)的包囊率為被包囊凝膠珠數(shù)占總凝膠珠數(shù)的比例。將2種分級方法中包囊類別均大于或等于2 的凝膠珠計(jì)為已包囊，其它的計(jì)為未包囊。

1.3 數(shù)據(jù)分析

不同發(fā)育階段的5、6 齡幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率經(jīng)arcsin 轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，若差異顯著再經(jīng)post hoc 多重分析(SAS8.1)，以闡明各處理間差異的顯著性。同時，采用了兩因素方差分析的PROC GLM 檢驗(yàn)飼料中Ni2+劑量和脅迫世代數(shù)雙因素對血細(xì)胞包囊率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞對Sephadex G-25 凝膠珠的包囊反應(yīng)

不同Ni2+脅迫下斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞對Sephadex G-25 凝膠珠的包囊情況見圖1。圖1 中A、B 為0 級;C、D 為1 級;E、F 為2 級;G、H為3 級。

圖1 斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞對Sephadex G-25 凝膠珠的包囊反應(yīng)Fig.1 Encapsulation hemocytes of Sephadex G-25 beads in Spodoptera litura larvae.

2.2 Ni2+ 脅迫對斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

2.2.1 Ni2+脅迫對0-24 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

連續(xù)3 代0-24 h 幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠包囊率均在1 mg/kg 和5 mg/kg 脅迫濃度下高于對照(除1 mg/kg Ni2+脅迫下第2 代幼蟲外，均顯著高于對照);10 mg/kg 和20 mg/kg Ni2+脅迫的第2、3 代幼蟲血細(xì)胞的包囊率均低于對照，但僅第3 代幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率顯著低于對照;40 mg/kg Ni2+脅迫下血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率在各個世代均低于對照(圖2)。說明此濃度已對斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞的免疫功能產(chǎn)生影響。

圖2 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾0-24 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.2 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 0-24 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.2 Ni2+脅迫對24-48 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

24-48 h 幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率與0-24 h 的變化規(guī)律類似，但各處理幼蟲與對照的差異性有所不同。經(jīng)過連續(xù)3 代1 mg/kg 及5 mg/kg Ni2+脅迫幼蟲血細(xì)胞的包囊率均顯著高于對照，而在20 mg/kg 及以上處理濃度Ni2+脅迫的第2、3 代幼蟲血細(xì)胞的包囊率則顯著低于對照(圖3)。這表明隨脅迫時間增加，Ni2+對幼蟲免疫抑制作用增強(qiáng)。

圖3 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾24-48 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.3 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 24-48 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.3 Ni2+脅迫對48-72 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

在48-72 h 內(nèi)，第1、2、3 代1 mg/kg 和5 mg/kgNi2+脅迫下幼蟲血細(xì)胞的包囊率均高于對照，第1、3 代在此處理濃度下包囊率與對照相比顯著增加;20 mg/kg 以上Ni2+脅迫下連續(xù)3 代幼蟲的包囊率均顯著低于對照及5 mg/kg 以下Ni2+脅迫幼蟲血細(xì)胞的包囊率(圖4)。

圖4 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾48-72 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.4 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 48-72 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.4 Ni2+脅迫對72-96 h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

72-96 h 時間段內(nèi)1 mg/kg Ni2+脅迫下3個世代幼蟲血細(xì)胞的包囊率與對照相比均增加，且第1、3 代顯著增加;5 mg/kg 及以上Ni2+脅迫的第2、3代幼蟲血細(xì)胞的包囊率均顯著低于對照(圖5)。

圖5 取食含不同劑量Ni2+人工飼料的斜紋夜蛾72-96 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.5 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 72-96 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.5 Ni2+脅迫對96-120h 幼蟲血細(xì)胞包囊率的影響

在96-120 h 時間段內(nèi)，第1 代幼蟲血細(xì)胞的包囊率在1 mg/kg 及5 mg/kg 處理濃度下升高，處理濃度達(dá)到10 mg/kg 及以上時包囊率下降;第2、3 代各處理幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率均顯著低于對照，并隨脅迫濃度的增加呈遞減趨勢，存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系(圖6)。這可能是隨脅迫時間增加，Ni2+對斜紋夜蛾幼蟲的免疫損壞程度增加，導(dǎo)致其免疫應(yīng)答減弱。

圖6 取食含不同劑量Ni2+飼料的斜紋夜蛾96-120 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率Fig.6 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 96-120 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.6 Ni2+劑量和脅迫世代數(shù)對幼蟲血細(xì)胞包囊率的交互影響

不同時間段幼蟲對凝膠珠包囊率的兩因素方差分析結(jié)果如表1 所示。結(jié)果表明，飼料中不同劑量的Ni2+與脅迫世代數(shù)對不同時間段幼蟲的包囊率均產(chǎn)生顯著影響。但是，飼料中不同Ni2+劑量以及脅迫世代數(shù)兩因素未對24-48 h 以及48-72 h 幼蟲的包囊率產(chǎn)生顯著的交互影響，這說明幼蟲包囊的形成是與脅迫時間長短及脅迫劑量雙因素密切相關(guān)的。

表1 飼料中Ni2+劑量和脅迫世代數(shù)對斜紋夜蛾5 齡幼蟲120 h 內(nèi)包囊率交互影響的顯著性檢驗(yàn)P 值Table 1 P-values of effects of nickel doses in diet and stressing generations on encapsulation rate of the 5th instar larvae of Spodoptera litura exposed to different doses of nickel for 120 h

3 結(jié)論與討論

昆蟲通過包囊反應(yīng)來清除血腔內(nèi)的寄生蜂和外源寄生物，因此，包囊反應(yīng)多與昆蟲的免疫反應(yīng)呈正相關(guān)性(Dubovskiy et al.，2011)。本研究結(jié)果顯示，飼料中Ni2+的短期脅迫對斜紋夜蛾幼蟲包囊反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在低劑量(1 mg/kg、5 mg/kg)Ni2+促進(jìn)而高劑量(40 mg/kg)Ni2+抑制的現(xiàn)象，這與Sorvari 等(2007)研究木蟻F.aquilonia 的免疫反應(yīng)相類似，木蟻對重金屬脅迫的免疫反應(yīng)也存在低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的現(xiàn)象;而E.Autumnata 及G.mellonella 的免疫反應(yīng)則隨重金屬處理濃度增加而增加(van Ooik et al.，2007;Dubovskiy et al.，2011)。

Ni2+對斜紋夜蛾幼蟲免疫反應(yīng)的影響與飼料中Ni2+的劑量、脅迫時間及幼蟲的發(fā)育階段相關(guān)聯(lián)。對5 齡初幼蟲而言，幼蟲攝入的Ni2+含量較低，對體內(nèi)Ni2+含量增加的敏感性較強(qiáng)，可迅速增加血細(xì)胞對凝膠珠的包囊率，以抵御過量Ni2+的危害;而隨脅迫時間延長Ni2+的免疫毒性增強(qiáng)，血細(xì)胞的包囊形成能力降低。

第1 代各發(fā)育階段幼蟲及第2、3 代0-96 h幼蟲的包囊反應(yīng)均存在低劑量Ni2+脅迫下促進(jìn)而高劑量脅迫下抑制的現(xiàn)象，但李艷梅等(2010)研究結(jié)果則表明，Cd2+脅迫導(dǎo)致棕尾別麻蠅幼蟲血細(xì)胞包囊反應(yīng)在48-72 h 內(nèi)下降，96 h 后作用不明顯。這可能是不同種類昆蟲對不同重金屬的脅迫表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答。我們在研究中還發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞的凋亡在高劑量Ni2+的長期脅迫下也受到抑制(Sun et al.，2011)。因此，我們推測Ni2+脅迫對血細(xì)胞功能的影響可能是包囊反應(yīng)受到影響的原因之一。

本文研究表明，5 mg/kg 及以下處理濃度Ni2+的1 代脅迫可提高0-120 h 幼蟲血細(xì)胞對凝膠珠的包囊反應(yīng)，但2-3 代的脅迫只增加發(fā)育初期0-72 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊反應(yīng);10-20 mg/kg 處理濃度Ni2+的1 代脅迫僅增加0-24 h 幼蟲血細(xì)胞的包囊率，但可降低2-3 代幼蟲血細(xì)胞各發(fā)育時間的包囊率;40 mg/kg Ni2+脅迫可降低連續(xù)3個世代各個發(fā)育階段幼蟲血細(xì)胞的包囊率;飼料中Ni2+劑量、脅迫世代數(shù)以及兩者的交互作用均對幼蟲血細(xì)胞的包囊率產(chǎn)生了顯著影響。

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