反相高效液相色譜法在補骨脂提取物3種主要成分含量測定中的應(yīng)用

李建梅　周凡　希爾艾力·吐爾遜

[摘要] 目的 采用反相高效液相色譜法，建立同時測定補骨脂提取物中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚含量的方法。 方法 采用Epic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：甲醇-水，梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長250 nm。 結(jié)果 該法測定補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚分別在0.0563～0.3379、0.0523～0.3139、0.1280～0.7680 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.9999。平均加樣回收率分別為100.66%（n=6）、RSD=1.77%，100.43%（n=6）、RSD=1.45%和99.41%（n=6）、RSD=1.63%。 結(jié)論 本方法簡便、準確、靈敏、重復(fù)性好，可作為補骨脂提取物中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的含量控制方法。

[關(guān)鍵詞] 補骨脂；補骨脂素；異補骨脂素；補骨脂酚；反相高效液相色譜

[中圖分類號] R969 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0012-04

[Abstract] Objective To determine psoralen， isopsoralen and bakuchiol from the extract of Psoralea corylifolia by RP-HPLC. Methods The contents of paoralen， isopsoralen and bakuchiol were determined on the Epic C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column， with methanol： water in gradient elution manner. The flow rate was 1.0 mL/min， the column temperature was maintained at 30℃， and the detection wavelength was set up at 250 nm. Results The linear ranges of paoralen， isopsoralen and bakuchiol were 0.0563-0.3379， 0.0523-0.3139 and 0.1280-0.7680 μg （r=0.9999）. The average recovery of paoralen， isopsoralen and bakuchiol were 100.66%， 100.43% and 99.41%， RSD were 1.77%， 1.45% and 1.63% （n=6）. Conclusion The method is convenient， accurate sensitive and repeatable， and can be used in the content control method of psoralen， isopsoralen and bakuchiol in extract of Psoralea corylifolia.

[Key words] Psoralea corylifolia L.； Psoralen； Isopsoralen； Bakuchiol； RP-HPLC

補骨脂是中醫(yī)、維吾爾醫(yī)常用藥材，臨床應(yīng)用廣泛。補骨脂為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實。維吾爾醫(yī)認為本品性二級干熱，味辛、苦。功能生干生熱，清除異常黏液質(zhì)，赤膚發(fā)泡，增加色素，凈血解毒，祛風(fēng)止癢，燥濕除疹，殺驅(qū)腸蟲等。主治濕寒性或黏液質(zhì)性疾病，如白癜風(fēng)，麻風(fēng)，皮膚瘙癢，各類濕疹，腸道生蟲等。中醫(yī)認為補骨脂味辛、苦、溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽，納氣平喘，溫脾止瀉之功效；外用消風(fēng)祛斑。用于腎陽不足，陽痿遺精，遺尿尿頻，腰膝疼痛，腎虛作喘，五更泄瀉；外治用于皮膚病和白癜風(fēng)，斑禿等[1-2]?！吨袊幍洹罚?015版）中收載的含補骨脂的中成藥就有40種，臨床醫(yī)師處方中應(yīng)用補骨脂更廣泛，《衛(wèi)生部藥品標準-維吾爾藥分冊》收載的含補骨脂的白癜風(fēng)治療制劑有9種[2]。

補骨脂酚含量約占補骨脂藥材的5%，是含量最多的成分，補骨脂素和異補骨脂素是補骨脂藥材的主要活性成分，因此，建立簡便、快速、準確、重現(xiàn)性好，且同時能夠測定補骨脂中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚含量的方法，可用于補骨脂藥材及制劑的質(zhì)量控制。成藥制劑和臨床處方中補骨脂常采用乙醇提取或水提取[3-8]，本實驗采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對補骨脂乙醇提取和水提取物中的補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚3種主要成分同時進行定量檢測[9-13]，為補骨脂藥材及提取物質(zhì)量的綜合評價提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Waters e2695高效液相色譜儀及化學(xué)工作站（美國沃特斯公司）；Waters 2996二極管陣列檢測器，Empower數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（18 MΩ，Millipore公司）；SGT7200HBT型超聲清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；Sartorius LA120s電子天平（德國賽多利斯）；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；PTHW調(diào)溫電熱套（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；600 g搖擺式告訴萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；DHG09140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；SB-1000數(shù)顯恒溫水浴鍋（東京理化器械株式會社）；N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；DLSB-5/10低溫冷卻循環(huán)泵（鞏義市京華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

補骨脂素對照品（南京景竹生物科技有限公司，HPLC>98%，批號：JZ16010702）；異補骨脂素對照品（南京景竹生物科技有限公司，HPLC>98%，批號：JZ16011401）；補骨脂酚對照品（南京景竹生物科技有限公司，HPLC>98%，批號：JZ16030702）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水；磷酸、甲酸（分析純）；補骨脂藥材（新疆奇康哈博維藥有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)地陜西，批號：20151027），經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院藥劑科艾尼瓦爾主任藥師鑒定，為豆科植物補骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實。endprint

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚對照品適量，置于25 mL棕色容量瓶中，分別加甲醇制成0.3520、0.5030和0.8000 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚對照品儲備液各2.0、1.3和2.0 mL，同時置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，制成每毫升溶液含28.16 μg補骨脂素、26.16 μg異補骨脂素和64.00 μg補骨脂酚的混合對照品溶液。

2.2 補骨脂提取物的制備

取補骨脂，加10倍量水，回流提取3次，1 h/次，合并提取液，60℃減壓濃縮至相對密度為1.12～1.15的稠浸膏，于60℃真空干燥箱內(nèi)減壓干燥，制成干浸膏，粉碎過100目篩，備用（批號：170119）；同法制備補骨脂乙醇提取物，備用（批號：170208）。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取補骨脂水提取物約0.10 g，置于25 mL的棕色量瓶中，加甲醇溶液20 mL，超聲處理（59 kHz）30 min，定容至刻度，搖勻，過濾。

精密稱取補骨脂醇提取物約0.10 g，置于50 mL的棕色量瓶中，加甲醇溶液45 mL，超聲處理（59 kHz）30 min，定容至刻度，搖勻，再精密吸取1～10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，搖勻，過濾[1-4]。

2.4 色譜條件

色譜柱：Epic C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B）梯度洗脫：0～10 min（58%～61%A），10～11 min（61%～95%A），11～21 min（95%～95%A）；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.5 系統(tǒng)適用性實驗

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按“2.4”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在此色譜條件下，補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚均與樣品中其他組分色譜峰基線分離，理論塔板數(shù)均大于4000。

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取“2.1”項下補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚混合對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μL，分別注入液相色譜儀，以進樣量（μg）為橫坐標，對照品峰面積為縱坐標進行回歸，得回歸方程：y=6 333 902.19x-38 403.13，r=0.999 9；y=7 210 706.64x-38 048.93，r=0.999 9；y = 2 624 543.75 x-60 488.60，r=0.999 9。結(jié)果表明，補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚分別在0.05630～0.3379、0.0523～0.3139和0.1280～0.7680 μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取濃度為28.16 μg/L的補骨脂素、26.16 μg/L的異補骨脂素和64.00 μg/L的補骨脂酚混合對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6次，記錄各自峰面積，補骨脂素RSD為0.9600%，異補骨脂素RSD為0.58%，補骨脂酚RSD為1.06%。表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗

取補骨脂水提取物（批號：170119），精密稱取約0.10 g，按上述“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，照供試品測定方法測定補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚的含量，結(jié)果6份樣品進樣補骨脂素平均含量為3.01 mg/g，RSD=0.65%，異補骨脂素平均含量為2.25 mg/g，RSD=0.82%（n=6），補骨脂酚平均含量為14.65 mg/g，RSD=1.59%（n=6）。表明本法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取補骨脂水提取物（批號：170119），精密稱取約0.10 g，按上述“2.3”項下方法制備供試品溶液，在相同的色譜條件下分別于0、2、4、6、12、24 h進樣10 μL進行測定，測定補骨脂素峰面積RSD為0.85%，異補骨脂素峰面積RSD為1.19%，補骨脂酚峰面積RSD為1.46%（n=6）。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗

采用標準添加法測定回收率。精密稱取補骨脂水提物（批號：170119）6份，每份約0.05 g，放入25 mL容量瓶中，分別加入濃度為0.352 mg/mL的補骨脂素對照品溶液0.4 mL，0.503 mg/mL的異補骨脂素對照品溶液0.2 mL，0.800 mg/mL的補骨脂酚照品溶液0.8 mL，加甲醇溶液適量超聲提取30 min后定容，平行制備6份供試品溶液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，測定，補骨脂素平均回收率分別為100.66%（n=6），RSD=1.77%，異補骨脂素平均回收率分別為100.43%（n=6），RSD=1.45%，補骨脂酚平均回收率分別為99.41%（n=6），RSD=1.63%，結(jié)果見表1。本方法具有良好的準確性。

2.11 樣品測定結(jié)果

準確稱取補骨脂水提物（批號：170119）和醇提物（批號：170208）各約0.10 g，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，進樣測定分析并計算含量，結(jié)果見表2。

3 討論

補骨脂中化學(xué)成分較多，補骨脂酚是補骨脂藥材中含量最多的成分，補骨脂素和異補骨脂素是補骨脂藥材的主要活性成分，而這些成分主要存在于醇提部位中。研究報道對補骨脂的含量測定研究多為對原藥材或成方制劑中補骨脂素和異補骨脂素進行的檢測，鮮見采用RP-HPLC對補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚進行同時測定的研究，而本實驗為首次對補骨脂水提和醇提物中該3種成分進行測定。本實驗采用RP-HPLC，建立補骨脂藥材中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚3種主要成分同時測定的方法，并比較兩種提取物中3種成分的含量差異，為后期臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為補骨脂藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供簡便、快速、準確、重現(xiàn)性好的測定方法。endprint

利用二極管陣列檢測器在線采集3個成分200～400 nm的紫外光譜，綜合考慮在250 nm處3個成分均有較好的吸收，并且極限平穩(wěn)，響應(yīng)值相對較高，最終選擇250 nm作為補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚同時測定的檢測波長。在流動相的選擇上，參考《中國藥典》2015年版一部中補骨脂含量測定項[1]所使用的流動相，并在此基礎(chǔ)上加以調(diào)整，以甲醇-水梯度洗脫的條件進行分析，達到分離測定的目的。樣品處理方法分別考察了回流法和超聲提取法，同時對甲醇、乙醇、50%甲醇等提取溶劑與提取時間進行考察，綜合考察結(jié)果以甲醇超聲處理30 min所得樣品出峰數(shù)目始終，干擾峰少，分離度好，響應(yīng)值較高。

補骨脂素與異補骨脂素在常溫狀態(tài)下為針狀結(jié)晶，而補骨脂酚為油狀液體，三者均可溶于乙醇。文獻報道不同提取或炮制方式對補骨脂的成分和藥效有影響[14-18]。本研究通過實驗對比發(fā)現(xiàn)，補骨脂醇提物中補骨脂素、異補骨脂素和補骨脂酚含量均高于水提物中含量，其中補骨脂酚在醇提物中含量是水提物中含量的近15倍。補骨脂及其復(fù)方制劑長期超劑量服用存在一定的毒性，包括肝毒性和視網(wǎng)膜毒性，且有動物實驗表明補骨脂酚對小鼠腎臟損害有較強的選擇性[19-20]。本課題組前期對補骨脂水提取物的急性毒性實驗結(jié)果顯示，其對小鼠血液學(xué)有一定影響，其中高劑量組干細胞出現(xiàn)水腫，主要在中央靜脈周圍，說明對小鼠具有一定的肝毒性[17]。鑒于以上文獻和實驗研究，本課題組將在后期毒性試驗結(jié)果中進一步研究比較補骨脂藥材兩種提取物的差異性。

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（收稿日期：2017-06-25 本文編輯：李亞聰）endprint