骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對動脈粥樣硬化大鼠外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量的影響

張園　張泉　孟春

[摘要] 目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前后對動脈粥樣硬化大鼠外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量的影響，以及對相關(guān)炎癥因子及動脈粥樣硬化（AS）的影響。 方法 90只雄性Wistar大鼠分正常飲食組（30只）和高脂飲食組（60只），并將高脂飲食組大鼠分對照組（30只）和移植組（30只），移植組經(jīng)尾靜脈注射MSCs懸液（細(xì)胞1×106溶于200 μL PBS中），對照組給予200 μL PBS，采用全自動生化儀分析總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），ELISA法測定外周血血清中水平，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3 Treg細(xì)胞水平，采用蘇木精-伊紅染色觀察組織學(xué)變化。 結(jié)果 組織學(xué)分析表明成功建立了動脈粥樣硬化模型。對照組大鼠血脂、炎癥因子較正常飲食組的水平升高（P < 0.05），移植組第4周血脂、血漿炎癥因子水平降低（P < 0.05），CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3數(shù)目增多（P < 0.05）。 結(jié)論 對AS大鼠進(jìn)行BMMSCs移植可以上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞，促進(jìn)Foxp3表達(dá)，并可以降低血脂和炎癥因子，為抑制AS的發(fā)生發(fā)展及穩(wěn)定斑塊提供一種新思路。

[關(guān)鍵詞] 動脈粥樣硬化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；炎癥因子；CD4+CD25+Treg細(xì)胞

[中圖分類號] R543.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0029-05

[Abstract] Objective To explore the effect on the number of CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood of the rats with AS after the mesenchymal stem cells transplanted into them and the effects of the two cells on the related inflammatory factors and AS. Methods 90 male Wistar rats were divideinto two groups： the normal diet group （30 rats） and the high-fat diet group （60 rats）， and the high-fat diet group were divide into the control group （30 rats） and the transplanted group （30 rats）. MSCS suspension （1×106 cells dissolved in 200 μL PBS） were injected into the transplanted group via the tail vein， while the control group were given 200 μL PBS. TC， TG， HDL-C， and LDL-C were analyze by automatic biochemical analyzer， the levels of hs-CRP and IL-6 in peripheral blood serum were measurated by ELISA and the level of CD4+CD25+Foxp3 Treg cells were observed by flow cytometry and the histological changes were observed by hematoxyli eosin stain. Results The histological analysis showed that the model of atherosclerosis was formed sucessfully. The blood lipid and inflammatory factors of control group were than the normal diet group（P < 0.05）. The levels of blood lipid and inflammatory factors the transplanted group decreased after 4 weeks （P < 0.05）， and the number of CD4+CD25+ regulatory T cells and CD4+CD25+Foxp3 increased（P < 0.05）. Conclusion The transplantation of BMMSCs to Wistar rats with AS can increase the number of CD4+CD25+regulatory T cells， promote the expression of Foxp3， and decline blood lipid and inflammatory factors， thus providing a new idea to restrain the occurrence and development of AS and stabilize the plaques.

[Key words] Atherosclerosis； Bone marrow mesenchymal stem cells； Inflammatory factors； CD4+CD25+Treg cells

動脈粥樣硬化（AS）是心腦血管病的發(fā)病基礎(chǔ)，心腦血管病是成人死亡和發(fā)病的最主要原因[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC）可以上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞[2]，促進(jìn)其細(xì)胞因子的分泌，抑制免疫和炎性反應(yīng)，成為許多疾病治療的種子細(xì)胞。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)具有免疫負(fù)性作用的T細(xì)胞，在許多免疫反應(yīng)疾病中起免疫無反應(yīng)和免疫抑制的功能。AS是一種慢性炎性反應(yīng)過程，整個過程都有免疫反應(yīng)參與。BMMSC與CD4+CD25+Treg細(xì)胞都與AS有關(guān)，那么BMMSCs是否通過提高CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平而達(dá)到抑制AS的作用，本文就二者對AS發(fā)生發(fā)展的影響展開討論。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級Wistar大鼠購自山東魯抗醫(yī)藥公司實驗動物中心，合格證號：ScXK（魯）2008002；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀、TGL-16B高速臺式離心機(jī)、Leiea DM400oB光學(xué)顯微鏡和Leiea Qwinv 3圖像分析軟件、Olympus AU2700全自動生化分析儀、標(biāo)準(zhǔn)飼料等由濰坊醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供；維生素D3注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司，ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，胰蛋白酶消化液購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及AS模型制備 90只8周齡、體重約250 g的大鼠隨機(jī)分正常飲食組（n = 30）和高脂飲食組（n = 60），高脂組隨機(jī)分對照組（n = 30）和移植組（n = 30）；高脂組給予高脂飲食（3%膽固醇、0.7%膽酸鈉、13%豬油、7%白糖、0.3%丙基硫氧嘧啶、76%標(biāo)準(zhǔn)飼料），并給予維生素D3 60 0000 U/kg腹腔注射，喂養(yǎng)開始時1次，后每4周1次，共4次；正常飲食組標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，并同等劑量生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 BMMSCs的獲取 BMMSCs形態(tài)學(xué)上一般表現(xiàn)為細(xì)胞體積較大，呈長梭形或紡錘形，可以聚集形成集落。本實驗通過全骨髓培養(yǎng)法獲得BMMSCs[3]。4周齡體重約120 g大鼠4只，頸椎脫臼處死，無菌條件下分離股骨及脛骨，反復(fù)沖洗骨髓腔。將沖出的骨髓收集至無菌離心管中，選用全骨髓貼壁法分離BMMSCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞融合80%～90%時按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳到4～5代后-150°C冷凍保存，使用時將其放于37℃水浴中快速振搖解凍復(fù)蘇。

1.2.3 BMMSCs的移植 移植組大鼠自尾靜脈注入MSCs懸液（細(xì)胞1×106溶于200 μL PBS中），對照組經(jīng)尾靜脈注入200 μL PBS，高脂組繼續(xù)高脂飲食。

1.2.4 病理切片制備 隨機(jī)選取12周后的正常飲食組和對照組、MSCs移植組大鼠各2只，處死解剖游離其主動脈瓣上起始段至髂總動脈分叉處的胸腹主動脈全長，放入10%甲醛內(nèi)浸泡固定，將固定好的病理組織用清水沖洗，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后切片機(jī)以5 μm連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色[4]。

1.2.5 血脂及炎癥因子測定 隨機(jī)選取12周后的正常飲食組和對照組大鼠、MSCs移植組第1、2、4周大鼠各8只，自大鼠尾靜脈各抽取6 mL血液用于實驗。各取2 mL血液用Olympus AU2700全自動生化分析儀檢測血脂[包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）]；另各取2 mL用ELISA雙抗夾心法檢測超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和白介素-6（IL-6）濃度。

1.2.6 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞測定 將“1.2.5”中留取的靜脈血2 mL，儲存于肝素抗凝管中。加全血50 μL至檢測管和對照管中，分別加入Anti-Rat CD4 FITC 1μL、Anti-RatCD25 Percp-eFluor710 0.5μL 和Mouse IgG2aK Isotype Control FITC 1 μL、Mouse IgG1k Isotype Control Percp-eFluor710 0.5 μL。1500 r/min離心5 min，重復(fù)2次；分別加Anti-Mouse/Rat Foxp 3-PE和Rat IgG2ak Isotype control PE 5μL混勻，4℃冰箱放置30 min；加1 mL1×破膜液1500 r/min離心5 min棄上清；上流式細(xì)胞儀檢測獲取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病理情況

高脂飲食組與正常飲食組比較出現(xiàn)AS改變，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，可見大量泡沫樣細(xì)胞并形成脂核，平滑肌細(xì)胞排列紊亂、斷裂，BMMSCs移植后1、2、4周，動脈內(nèi)膜逐漸平滑、規(guī)整、連接，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞逐漸減少，脂質(zhì)核變小，斑塊穩(wěn)定。見圖1。

2.2 各組大鼠血脂水平

對照組與正常組比較，對照組TG、TC、LDL-C水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；移植后第1、2周與對照組比較，血脂有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；移植第4周與對照組比較，移植組血脂明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 各組炎癥因子水平

對照組與正常組比較，對照組CRP、IL-6水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；移植后第1、2周與對照組比較，兩者有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；移植第4周與對照組比較，移植組兩者水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 各組CD4+CD25+Treg細(xì)胞及Fox3表達(dá)

對照組與正常組比較，對照組CD4+CD25+Treg細(xì)胞及Foxp3水平降低（P < 0.05）；移植第1、2周組與對照組比較，兩者有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計意義（P > 0.05）；移植第4周組與對照組比較，兩者水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3、圖2～3。

2.5 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

接種后細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中散在分布，呈圓形。原代培養(yǎng)：24 h后開始貼壁，72 h后貼壁細(xì)胞表現(xiàn)為多角形、不規(guī)則或圓形，單個生長，5～7 d逐漸形成集落，形態(tài)呈長線形、不規(guī)則或多角形，仍能見圓形細(xì)胞夾雜，10 d后細(xì)胞集落快速增殖，細(xì)胞開始聚集生長，逐漸形成“漩渦狀”，部分大的集落開始融合，14 d時大的集落相互重疊融合。傳代培養(yǎng)：傳代6 h后細(xì)胞慢慢貼壁呈長梭形伸展，均勻生長并逐漸形成大的集落，大約4～5 d圓形、未貼壁細(xì)胞顯著減少，傳至第3、4代的BMMSC形態(tài)基本呈長梭形，沒有圓形的雜細(xì)胞。見圖4。endprint

3 討論

AS是高血壓、冠心病、心肌梗死等多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)，其中氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)是重要的病理機(jī)制[5-8]。導(dǎo)致AS發(fā)病的因素非常多，比如高血脂、內(nèi)皮損傷、炎癥、慢性應(yīng)激[9]；AS被認(rèn)為是一種慢性炎癥，炎性反應(yīng)可以通過多種途徑促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展[10]。CRP和IL-6在炎癥斑塊中起重要作用，不僅參與AS的行成，也是斑塊不穩(wěn)定的觸發(fā)因素[11]。

免疫系統(tǒng)是參與AS炎性反應(yīng)的重要組成部分，在炎性反應(yīng)初始階段起核心作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，CD4+CD25+Treg是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的亞群之一，是成熟全面功能的T細(xì)胞亞群[12-13]，具有免疫抑制與免疫無能性作用[14]，在慢性炎性反應(yīng)中起重要作用。CD4+CD25+Treg主要通過免疫負(fù)性調(diào)節(jié)來減少自身免疫性疾病的發(fā)生，在機(jī)體維持自身免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用[15]。Foxp3是Treg細(xì)胞的特征性核轉(zhuǎn)錄因子，在維持Treg細(xì)胞特征性基因表達(dá)、分化和發(fā)育以及Treg細(xì)胞的抑制性功能方面不可或缺[16-17]。BMMSCs具有再生能力和一定的免疫調(diào)節(jié)作用[18-19]，本實驗中BMMSCs通過上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)，使血CRP、IL-6水平降低，從而抑制AS的炎性反應(yīng)，抑制AS形成，這一點(diǎn)體現(xiàn)在本實驗中所做的病理切片上。BMMSCs移植后，上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞，并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。CD4+CD25+Treg細(xì)胞發(fā)揮其抑制免疫反應(yīng)的作用，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮抗炎、抗脂質(zhì)氧化等作用，二者共同抑制冠狀動脈粥樣硬化形成，延緩AS進(jìn)展。

本實驗顯示，對照組較正常組大鼠血脂、hs-CRP、IL-6水平明顯升高，CD4+CD25+Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3水平明顯下降，反映了CD4+CD25+Treg細(xì)胞在AS過程中的免疫反應(yīng)過程。動脈內(nèi)皮損傷后，分泌許多活性因子，募集更多的炎癥細(xì)胞到達(dá)局部后分泌更多的活性物質(zhì)和炎癥因子，其可抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)。在BMMSCs移植后2周，血脂，炎癥因子開始下降，CD4+CD25+Treg細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)開始上調(diào)，第4周后出現(xiàn)顯著改變，反映BMMSCs移植對CD4+CD25+Treg細(xì)胞及其產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)產(chǎn)生了有益的影響。其可能不僅有利于維護(hù)動脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，更有利于其功能的恢復(fù)，從而有利于調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)，在抑制AS發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

目前對CD4+CD25+Treg細(xì)胞在冠心病治療中的研究尚不成熟，本研究雖能夠觀察到BMMSCs移植對大鼠動脈粥樣硬化模型有益的影響，但畢竟其與人類動脈硬化還有很大差異，此方法應(yīng)用于人類還有待考究。

綜上所述，AS過程中CD4+CD25+Treg細(xì)胞及Foxp3+的表達(dá)受到抑制，使炎癥因子CRP和IL-6升高；BMMSC移植后可以上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞及Foxp3+的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，使hs-CRP和IL-6降低，起到抑制動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及穩(wěn)定斑塊的作用。

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（收稿日期：2017-06-12 本文編輯：蘇 暢）endprint