骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合吡菲尼酮治療肺間質(zhì)纖維化的研究

陳侃

【摘要】 目的 探討吡菲尼酮（PFD）聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植入博來霉素（BLM）誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的療效。方法 36只健康清潔級體重200 g雄性SD大鼠， 隨機分為6組， A組為陰性對照組、B組陽性對照組、C組單純激素治療組、D組單純MSCs移植組、E組單純PFD治療組、F組PFD聯(lián)合MSCs移植組， 各6只。 SD大鼠體外培養(yǎng)MSCs， 注入BLM制備肺纖維化模型， 觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化， 測定轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）的蛋白表達。結(jié)果 造模7 d后， C、D、E、F組大鼠出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤比B組減少， 肺纖維化程度明顯減輕， F組較C、D、E組的病理改變更輕， 肺纖維化不明顯。肺系數(shù)中B組下降明顯， 與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。B、C、D、E、F組肺纖維化評分高于A組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子膠原表達的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少， F組較B、C、D、E組數(shù)量減少和強度減弱更加明顯， A組與B、C、D、E、F組比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， C、D、E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合吡菲尼酮對肺纖維化有一定的抑制作用， 能夠降低肺組織轉(zhuǎn)化生長因子的表達， 有修復(fù)和再生作用， 治療肺纖維化效果明顯。

【關(guān)鍵詞】 吡菲尼酮；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠；肺間質(zhì)纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.01.213

特發(fā)性肺纖維化（IPF）是由于肺泡上皮的損傷及纖維細(xì)胞增殖， 最終形成成纖維細(xì)胞灶， 是一種嚴(yán)重的彌漫性肺間質(zhì)疾病， 發(fā)病率和死亡率均較高， 對患者家庭及社會造成嚴(yán)重影響。IPF發(fā)病機理不明， 臨床癥狀不明顯， 無特效藥物治療， 不能治愈與逆轉(zhuǎn)[1]。傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素等藥物治療作用有限， 尋找一種安全有效、新型低毒抗肺纖維化藥物已經(jīng)迫在眉睫。隨著醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展， 以MSCs移植治療肺纖維化中有積極的效果， 同時吡啶酮類化合物也能夠預(yù)防和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生， 防治纖維化效果良好。本實驗就PFD聯(lián)合MSCs移植對大鼠肺纖維化模型進行干預(yù)， 為防治肺纖維化提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 動物 選取36只健康清潔級體重200 g雄性SD大鼠， 室溫 27℃， 濕度70%， 墊料干燥， 由北京維通利華動物公司提供[動物合格證號：scxk（京）2007-0001]。隨機分為6組， A組為陰性對照組、B組陽性對照組、C組單純激素治療組、D組單純MSCs移植組、E組單純PFD治療組、F組PFD聯(lián)合MSCs移植組， 各6只。

1. 1. 2 試劑與儀器 低糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco， 免疫組化試劑盒購自南昌長城生物工程公司， 轉(zhuǎn)化生長因子購自武漢博士德生物工程有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 大鼠MSCs的分離、培養(yǎng)及標(biāo)記 SD大鼠斷頸處死， 無菌分離股骨和脛骨， 暴露骨髓腔， 低糖DMEM培養(yǎng)基沖洗， 收集混濁液即骨髓細(xì)胞， 低溫離心后棄去上清液， 制成細(xì)胞懸液， 計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶， 消化傳代， 收集第四代細(xì)胞用于實驗。

1. 2. 2 體內(nèi)細(xì)胞移植 A組， 第1天氣管內(nèi)注射生理鹽水2 ml/kg 0.3 ml；B組， 第1天氣管內(nèi)注射0.3 ml BLM 5 mg/kg；C組， 第1天同B組， 第2天， 給予地塞米松 0.5 mg/kg， 連續(xù)3 d；D組， 第1天注射BLM 5 mg/kg， MSCs （5×105/200 μl PBS）移植；E組， 第1天注射BLM 5 mg/kg， 0.3 ml， 第2天， 給予吡菲尼酮 0.5 mg/kg， 共7 d；F組：第1天注射BLM 5 mg/kg， MSCs移植， 第2天， 給予吡菲尼酮 0.5 mg/kg， 共7 d。

1. 2. 3 肺纖維化模型制備 使用BLM誘導(dǎo)建立模型， 腹腔麻醉后， 取出肺組織， 稱肺濕重， 加入固定液使肺復(fù)張， 脫水、透明、固定、包埋， 4 μm厚連續(xù)切片， 分為組織診斷學(xué)和免疫組化染色使用。

1. 2. 4 肺組織形態(tài)學(xué)檢測 HE染色， 封片， 顯微鏡下觀察肺纖維化修復(fù)效果。

1. 2. 5 免疫組織化學(xué)法檢測 TGF-βl呈顆粒狀分布于胞漿中， 以棕色為陽性表達， 顏色越深表達越強。每只大鼠采用3張切片， 15個視野， 測定陽性細(xì)胞數(shù)。

1. 3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

1. 3. 1 觀察指標(biāo) 觀察大鼠的體重、肺濕重， 計算肺系數(shù)（肺濕重 mg/體重g）。

1. 3. 2 評價標(biāo)準(zhǔn) 肺纖維化程度采用Szapiel評分法：無肺泡炎計0分；輕度肺間質(zhì)纖維化， 面積<20% 計1分；中度纖維化， 面積>30% 計2分；重度纖維化， 面積>50% 計3分。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗；計量資料采用等級計數(shù)資料， 1級計1分。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 病理學(xué)表現(xiàn) A組肺泡結(jié)構(gòu)清晰， 氣道上皮光滑， 氣道周圍無炎性細(xì)胞浸潤， B、C、D、E、F組肺間質(zhì)浸潤， 肺泡間隔增寬。B組第7天病變程度明顯加重， 大量炎癥細(xì)胞滲出， 肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重， 第14天炎癥細(xì)胞滲出減輕， 纖維化程度較輕， 第21天成纖維細(xì)胞大量聚集， 肺纖維化廣泛出現(xiàn)。C、D、E、F組較B組炎癥相對減輕， 第7天出現(xiàn)肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞， 炎癥細(xì)胞滲出， 部分肺泡不張， 第14天多數(shù)肺泡復(fù)張， 第21天成纖維細(xì)胞聚集， 出現(xiàn)輕度肺纖維化。F組較C、D、E組的病理改變更輕， 肺泡基本復(fù)張， 肺纖維化不明顯。

2. 2 肺系數(shù)變化 B、C、D、E、F組體重比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與A組比較， B組肺系數(shù)第7天后均明顯下降， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2. 3 肺纖維化程度 B、C、D、E、F組第7天開始高于A組（P<0.05）；B組高于C、D、E、F組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；C、D、E、F組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。F組肺纖維化嚴(yán)重度分?jǐn)?shù)最低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 4 免疫組化檢測結(jié)果 TGF-βl表達在B、C、D、E、F組顯著高于A組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與B組比， C、D、E、F組陽性細(xì)胞數(shù)均減少， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E、F組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。F組較B、C、D、E組數(shù)量減少和強度減弱更加明顯， 以單個肺泡巨噬細(xì)胞出現(xiàn)（P<0.05）。C、D、E組數(shù)量略減少， 表達強度略降低（P>0.05）， B、C、D、F組的陽性肺泡巨噬細(xì)胞有逐漸減少趨勢。見表3。

3 討論

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化中最常見的是IPF， 預(yù)后差， 死亡率高， 至今尚無明確有效的治療方法[2]。通過建立肺纖維化動物模型， 通過觀察肺纖維化發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等規(guī)律， 有效診斷肺間質(zhì)性疾病。SD大鼠種系純， 體形小、適應(yīng)性強， 成本低， 易于操作， 是理想的造模選擇[3]。IPF主要機制由于肺泡I型細(xì)胞廣泛損傷， 炎癥細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子相互作用， 造成成纖維細(xì)胞大量聚集， 肺泡Ⅱ型細(xì)胞不能及時分化， 修復(fù)正常肺組織結(jié)構(gòu)， 最終形成肺纖維化。TGF-βl作用于膠原的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程， 促進膠原蛋白的形成沉積， 增加抗蛋白酶活性， 致ECM在肺內(nèi)積聚， 肺泡壁增厚， 最終引起肺纖維化和呼吸功能障礙。

成體干細(xì)胞在組織受到損傷后， 被激活并分化為所需的細(xì)胞， 實現(xiàn)組織修復(fù)和再生功能。來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞， 可感知損傷信號， 發(fā)揮修復(fù)和再生的能力；免疫調(diào)節(jié)功能強大， 能夠避免排斥反應(yīng)；可生成多種細(xì)胞因子， 促進血管再生及損傷修復(fù)， 分化為心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和上皮細(xì)胞等 [4]， 抗心肌纖維化， 降低肝纖維化等。MSCs能夠減輕膠原沉積， 防治靶器官纖維化， 修復(fù)器官損傷上具有較高的應(yīng)用價值。PFD是一種新型抗纖維化藥物， 抑制脂質(zhì)過氧化， 不良反應(yīng)較低， 毒性小， 減少生長因子、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長因子的生成， 促進炎癥反應(yīng)降低， 抑制纖維化靶基因轉(zhuǎn)錄， 為治療纖維化疾病意義深遠(yuǎn) [5]。

本研究注入生理鹽水后， 大鼠氣道上皮光滑， 無炎性細(xì)胞浸潤， 表明建模成功[6]。B組病變程度加重， 出現(xiàn)廣泛的肺纖維化；C、D、E、F組炎癥及肺纖維化結(jié)果較B組減輕， 出現(xiàn)輕度纖維化；F組較C、D、E組的病理改變更輕， 肺纖維化不明顯。說明吡菲尼酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可減緩肺纖維化的病理進程， 推測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分化， 恢復(fù)和重建肺泡上皮細(xì)胞， 不斷替代已破壞的細(xì)胞， 抑制炎癥細(xì)胞的增殖、活化和分泌功能， 具有抗炎作用、免疫抑制作用， 抑制肺纖維化。

免疫組化檢測TGF-βl的表達， B、C、D、E、F組陽性表達顯著高于A組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E、F組比B組陽性細(xì)胞數(shù)均減少， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。C、D、E、F組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。F組數(shù)量減少和強度減弱更加明顯（P<0.05）。從B、C、D、E、F組， 有逐漸減少趨勢。提示在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展中， TGF-βl蛋白的表達可能起重要的作用， 纖維化的減輕與細(xì)胞因子水平的升高， 對上皮細(xì)胞生長有抑制活性， 在低濃度時促進平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞的生長， 高濃度時抑制生長， 說明了TGF-βl在慢性纖維化過程中具有促進作用， 清除透明質(zhì)酸， 增殖肺內(nèi)成纖維細(xì)胞， 抑制肺纖維化也有重要作用。

在肺纖維化評分中， B、C、D、E、F組高于A組（P<0.05）；B組分?jǐn)?shù)最高， F組最低， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 說明吡菲尼酮聯(lián)合MSCs移植修復(fù)肺纖維化的效果最佳。B組比A組陰性對照組肺系數(shù)明顯下降（P<0.05）， 說明MSCs移植聯(lián)合吡非尼酮注射后， 可在損傷部位聚集， 修復(fù)損傷的肺上皮細(xì)胞， 減弱纖維化的程度。吡菲尼酮聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的抗炎、抗維化作用與阻止TGF-βl水平的升高有關(guān)[7]。

綜上所述， 通過使用PFD聯(lián)合MSCs移植治療特發(fā)性纖維化的試驗， 證實了PFD聯(lián)合MSCs移植能夠抑制膠原沉積， 逆轉(zhuǎn)肺部分纖維化病理狀態(tài)， 抑制發(fā)生拮抗纖維化， 緩解炎癥反應(yīng)， 促進肺組織修復(fù)重建。為飽受惡性肺病困擾的患者帶來福音， 具有十分廣闊的應(yīng)用前景， 對有效預(yù)防及治療肺纖維化具有重要的經(jīng)濟和社會意義。

參考文獻

[1] 夏誠誠， 宋宇哲， 唐鳳嬌.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在放射性肺損傷中的應(yīng)用前景.中國老年學(xué)雜志， 2014， 7（34）：4103-4105.

[2] 黃慧， 李紅杰， 徐作軍.特發(fā)性肺纖維化的藥物治療.臨床藥物治療雜志， 2011， 9（6）：40-43.

[3] 宋小蓮.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對慢性阻塞性肺病氣道及肺實質(zhì)損傷的修復(fù)作用. 第二軍醫(yī)大學(xué)， 2009.

[4] 都凌杰， 李冉， 趙曼曼， 等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠硅沉著病纖維化形成的影響.解剖學(xué)報， 2013， 44（1）：62-65.

[5] 李萍， 楊秋輝， 王俊嶺， 等.吡菲尼酮對牛血清蛋白誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝損害的保護作用.觀察實用肝臟病雜志， 2015， 18（1）：63-66.

[6] 曾省都.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠肺纖維化及相關(guān)機制的實驗. 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 2008.

[7] 朱會興， 高俊玲， 趙曼曼， 等.不同時間骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠矽肺纖維化形成的影響.中國免疫學(xué)雜志， 2015（31）： 193-196.

[收稿日期：2015-06-23]