葛花中異黃酮含量及其酸水解轉(zhuǎn)化率的檢測

王金鳳，楊翠燕，王國玉，王 芳，魏 穎，張艷萍

（解放軍第208醫(yī)院心血管內(nèi)二科，長春 130062）

葛花中異黃酮含量及其酸水解轉(zhuǎn)化率的檢測

王金鳳＊，楊翠燕，王國玉，王 芳，魏 穎，張艷萍

（解放軍第208醫(yī)院心血管內(nèi)二科，長春 130062）

目的：建立檢測葛花中異黃酮含量及其酸水解轉(zhuǎn)化率的方法。方法：以葛花為原料，采用乙醇提取、乙酸乙酯萃取、乙醇重結(jié)晶純化制備以鳶尾苷為主要成分的葛花異黃酮，經(jīng)鹽酸水解轉(zhuǎn)化為鳶尾苷元。通過篩選溶劑和波長建立測定鳶尾苷與苷元的紫外分光光度（UV）法，計算葛花異黃酮含量及鳶尾苷酸水解轉(zhuǎn)化率（以鳶尾苷元的相對百分含量表示），并與高效液相色譜法（HPLC）檢測結(jié)果進(jìn)行比較，評價UV法的準(zhǔn)確性。結(jié)果：UV法溶劑選擇含有1%三乙胺的70%乙醇溶液，波長選擇339、274 nm，鳶尾苷元在8.80～29.33 nmol/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 9）；精密度（n＝6）、穩(wěn)定性（n＝5）、重復(fù)性（n＝6）試驗的RSD均小于1.94%，平均加樣回收率為99.7%（RSD＝1.77%，n＝9）。UV法與HPLC法比較，總黃酮含量（17.64～25.55 nmol/mL vs.17.39～24.40 nmol/mL）、鳶尾苷元的相對百分含量（57.65%～87.59%vs.55.62%～91.14%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：本研究建立的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于鳶尾苷酸水解轉(zhuǎn)化率的快速檢測。

葛花；異黃酮；鳶尾苷；鳶尾苷元；紫外分光光度法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for the decoction of isoflavone content and its acid hydrolysis conversion rate in the flower of Pueraria lobata.METHODS：Using the flowers of Pueraria lobata as raw material，the isoflavone with main component of tectoridin in the flower of P.lobata was prepared with ethanol，ethyl acetate extracted，ethanol recrystallized and purified，and it was converted to tectorigenin with hydrolysis in hydrochloric acid.By screening the solvent and wavelength，UV spectrophotometry was established to determine tectovidin and tectorigenin，and calculate the isoflavone content and acid hydrolysis con-version rate of tectoridin（expressed by the relative percentage of tectorigenin）.It was compared with HPLC detection results，the accuracy of UV method was evaluated.RESULTS：The solvent was 70%ethanol solution containing 1%triethylamine，and the isoflavone content was detected at wavelength of 339，274 nm.The linear range of tectoridin was 8.80-29.33 nmol/mL（r＝0.999 9）.RSDs of precision（n＝6），stability（n＝5）and reproducibility（n＝6）tests were lower than 1.94%；average recovery was 99.7%（RSD＝1.77%，n＝9）.There were no statistical significances in the contents of total flavonoids（UV：17.64-25.55 nmol/mL vs.HPLC：17.39-24.40 nmol/mL）and the relative percentage of tectorigenin（UV：57.65%-87.59%vs.HPLC：55.62%-91.14%）.CONCLUSIONS：The established method is accurate，reliable，and can be used for the rapid determination of acid hydrolysis conversion rate of tectoridin.

KEYWORDSFlowers of Pueraria lobata；Isoflavone；Tectoridin；Tectorigenin；UV spectrophotometry

葛花（Flos Puerariae）為豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]或甘葛藤（P.thomsonii Benth）的花，研究發(fā)現(xiàn)葛花中含有多種異黃酮類化合物[1-3]，具有抗氧化損傷、降脂、保肝、抗菌、抗病毒、預(yù)防和治療心血管疾病等多種功效。葛花異黃酮中以糖苷為其主要成分[4]，由于糖苷需經(jīng)腸道細(xì)菌作用轉(zhuǎn)換為苷元方能吸收入血，故其生物利用度低[5-6]。將糖苷水解為苷元是提高黃酮類化合物生理活性的有效手段。異黃酮藥用時需通過酸或酶水解將糖苷轉(zhuǎn)化為苷元。其中酸水解較酶水解經(jīng)濟(jì)、方便，應(yīng)用更廣泛。酸水解即是將異黃酮糖苷溶液置于一定濃度的鹽酸或硫酸溶液中加熱，將葡萄糖苷基水解為羥基而轉(zhuǎn)化為苷元。一定條件下糖苷轉(zhuǎn)化率與加熱時間成正比，時間短則轉(zhuǎn)化不完全，但時間過長又可導(dǎo)致異黃酮被破壞。因此，酸水解過程中糖苷轉(zhuǎn)化率的監(jiān)測十分重要。檢測糖苷水解轉(zhuǎn)化率常采用高效液相色譜（HPLC）法或薄層層析法，而能否采用操作更簡單、更快速的紫外分光光度（UV）法檢測其轉(zhuǎn)化率尚未見文獻(xiàn)報道。因此，作者在本研究中以HPLC法測定結(jié)果為參照，以鳶尾苷元為對照品，評價UV法測定鳶尾苷酸水解轉(zhuǎn)化率（以鳶尾苷元相對百分含量表示）的可行性，為鳶尾苷酸水解轉(zhuǎn)化率的快速檢測提供試驗基礎(chǔ)。鳶尾苷和鳶尾苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 鳶尾苷和鳶尾苷元的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of tectoridin and tectorigenin

1 材料

1.1 儀器

LC-10AVT型HPLC儀，包括SPD-10AV型紫外檢測器（日本島津公司）；N-2000型色譜數(shù)據(jù)工作站（浙江大學(xué)智能信息工程有限公司）；UV-3200S型UV儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；CPA2P-F型電子天平（德國賽多利斯股份公司）。

1.2 藥品與試劑

葛花藥材（河南廣安堂貿(mào)易有限公司，批號：20140817），經(jīng)我院藥劑科孫國才主任藥師鑒定為真品；鳶尾苷和鳶尾苷元對照品（我院自制，批號：20140611，20140708，經(jīng)質(zhì)譜、氫譜和碳譜鑒定，純度均大于99.0%）；水為雙蒸水；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取鳶尾苷和鳶尾苷元對照品各11.0 mg，用70%乙醇定容于50 mL量瓶中，即得鳶尾苷和鳶尾苷元質(zhì)量濃度均為220 μg/mL的對照品貯備液。取貯備液適量置于50 mL量瓶中，用含或不含1%三乙胺（TEA）的70%乙醇溶液定容，即得鳶尾苷95.24 nmol/mL、鳶尾苷元146.67 nmol/mL的對照品檢測液。精密量取不同體積的鳶尾苷和鳶尾苷元對照品檢測液，制成含鳶尾苷元相對百分含量（即苷元占苷與苷元總量的百分比，mol/mol）分別為40%、50%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、100%（鳶尾苷相對百分含量則相應(yīng)為60%、50%、40%、35%、30%、20%、15%、10%、0）的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取葛花藥材500 g制成粗粉，過50目篩，70%乙醇回流提取，減壓回收乙醇。以乙酸乙酯萃取、乙醇重結(jié)晶純化，制得葛花異黃酮。取葛花異黃酮500 mg加入70%乙醇500 mL溶解后，加入濃鹽酸25 mL，搖勻，80℃水浴加熱不同時間后取樣用于測定。

2.2 溶劑及測定波長的選擇

取鳶尾苷與鳶尾苷元對照品貯備液適量，分別置于10 mL量瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為35%、50%、60%、70%、含1%TEA的乙醇溶液中，搖勻，室溫放置5 min；以相應(yīng)的溶劑作空白，于200～400 nm波長區(qū)間內(nèi)掃描，波長間隔1 nm，測其最大吸收峰。結(jié)果，在70%乙醇溶液中，鳶尾苷和鳶尾苷元的最大吸收峰（帶Ⅱ）分別在264、265 nm波長處，鳶尾苷有一小肩峰（帶Ⅰ），在334 nm波長處，鳶尾苷元則無帶Ⅰ；而在含1%TEA的70%乙醇溶劑中，兩者帶Ⅱ均紅移約10 nm至274 nm，鳶尾苷帶Ⅰ消失，鳶尾苷元帶Ⅰ吸收明顯增強(qiáng)并紅移至339 nm。因此，可通過檢測274、339 nm波長處的吸光度（A）值，以A339/A274對鳶尾苷元的百分含量進(jìn)行計算。鳶尾苷與鳶尾苷元的紫外光譜測定結(jié)果見圖2～圖4。

由圖2～圖4可見，溶劑不含TEA時，鳶尾苷元帶Ⅰ消失，無法滿足測定需要；含1%TEA的溶劑中，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，鳶尾苷元帶Ⅰ峰升高幅度增大，含1%TEA的70%乙醇溶液中鳶尾苷元帶Ⅰ峰升高幅度最明顯。因此，選擇含1%TEA的70%乙醇溶液為溶劑。

圖3 鳶尾苷元紫外光譜Fig 3 UA spectrum of tectorigenin

圖2 鳶尾苷紫外光譜Fig 2 UA spectrum of tectoridin

圖4 鳶尾苷元在不同溶劑中的紫外光譜Fig 4 UA spectrum of tectorigenin in different solvents

取鳶尾苷與鳶尾苷元對照品貯備液適量，分別置于10 mL量瓶中，制得的10 nmol/mL等濃度的鳶尾苷和鳶尾苷元的帶Ⅱ峰高相近，因此可于274 nm波長處準(zhǔn)確檢測葛花異黃酮鳶尾苷和鳶尾苷元的濃度，詳見圖5。

圖5 等濃度鳶尾苷和鳶尾苷元在含1%%TEA的70%%乙醇中的紫外光譜Fig 5 UA spectrum of tectoridin and tectorigenin with equal concentration in 70%%ethanol containing 1%%TEA

2.3 線性關(guān)系考察

2.3.1 鳶尾苷元濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取鳶尾苷元對照品檢測液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL置于10 mL量瓶中，加入含1%TEA的70%乙醇定容，混勻，于274 nm波長處測定A值。以鳶尾苷元對照品檢測液濃度（nmol/mL）為橫坐標(biāo)（x）、A為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 y＝0.029 6x+0.030 1（r＝0.999 9）。結(jié)果表明鳶尾苷元在8.80～29.33 nmol/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 鳶尾苷元相對百分含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取“2.1.1”項下混合對照品溶液1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入含1%TEA的70%乙醇定容，搖勻，以對應(yīng)溶劑作為空白參比，在274、339 nm波長處測定A值，計算A339/A274。以鳶尾苷元相對百分含量為橫坐標(biāo)（x）、A339/A274為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝0.002 1x+0.232 3（r＝0.999 5）。鳶尾苷元相對百分含量小于50%時，帶Ⅰ不明顯，故其相對百分含量在50%～100%內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度和穩(wěn)定性考察

以含1%TEA的70%乙醇溶液為溶劑，精密量取鳶尾苷元對照品貯備液1.0、1.4、1.8 mL置于10 mL量瓶中制備低、中、高濃度（14.67、20.53、26.40 nmol/mL）鳶尾苷元對照品溶液；另取含有鳶尾苷元相對百分含量為60%、70%、90%的混合對照品溶液，各6份，分別于室溫放置0、2、4、6、8 h時，于274、339 nm波長處測定A值，計算A339/A274比值，考察日內(nèi)精密度和溶液中鳶尾苷和苷元的穩(wěn)定性。結(jié)果，鳶尾苷元及其相對百分含量的日內(nèi)精密度RSD分別小于1.72%、1.83%（n＝6），表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性RSD分別小于0.81%、0.86%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性考察

分別取5、7、9 h 3個酸解時間點的供試品溶液，各6份，按“2.3.2”項下方法操作后，分別在274、339 nm波長處測定其A值，計算A339/A274。結(jié)果，重復(fù)性試驗RSD均小于1.94%（n＝6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.6 加樣回收率考察

取已知含量的葛花異黃酮5.0 mg，置于50 mL量瓶中，加入含1%TEA的70%乙醇溶解定容。精密量取2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL量瓶中，各3份，分別精密加入鳶尾苷元相對百分含量為80%的對照品混合液0.8、1.0、1.2 mL，用含1%TEA的70%乙醇定容至刻度，按“2.3.2”項下方法測定。結(jié)果，3個水平溶液的加樣回收率分別為98.6%、101.0%、99.5%（RSD分別為0.94%、1.90%、1.92%，n＝3），平均加樣回收率為99.7%（RSD＝1.77%，n＝9）。

2.7 含量測定

2.7.1 HPLC法檢測 HPLC法檢測及方法學(xué)考察參考文獻(xiàn)[7]。色譜條件：色譜柱為Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-乙腈-水（2∶1∶2，V/V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為264 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL。精密量取“2.1.2”項下供試品溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入流動相超聲（功率：250 W；頻率：40 kHz）10 min，混勻，稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖6。總異黃酮含量及鳶尾苷元相對百分含量測定結(jié)果見表1。

圖6 高效液相色譜圖Fig 6 HPLC chromatograms

表1 HPLC法與UV法測定葛花中總異黃酮含量及鳶尾苷元相對百分含量的結(jié)果Tab 1 Determination results of total flavonoids content and relative tectorigenin percentage content in flower of Pueraria lobata by HPLC and UV

2.7.2 UV法檢測 精密量取“2.1.2”項下供試品溶液1.0 mL，共6份，分別置于10 mL量瓶中，加入含1%TEA的70%乙醇定容，搖勻，分別于274、339 nm波長處測定A值。根據(jù)“2.3.1”“2.3.2”項下結(jié)果計算總異黃酮含量和鳶尾苷元相對百分含量，結(jié)果見表1。以HPLC測定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，使用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用配對t檢驗對所得結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明UV法可用于葛花總異黃酮含量及鳶尾苷元相對百分含量的快速檢測，并以此監(jiān)測鳶尾苷水解轉(zhuǎn)化率。

3 討論

異黃酮作為天然活性成分，其分離提取工藝步驟繁多、影響因素復(fù)雜，對其分離純化方法的合理選擇尤為重要。尤其是分析樣品量較大時，尋求操作簡便、快速準(zhǔn)確的評價方法具有重要的現(xiàn)實意義。薄層色譜法可進(jìn)行異黃酮的定性和半定量分析[8]，不適合提取條件的研究。HPLC法具有準(zhǔn)確、靈敏、快速的特點，但分析時間長、費用高。異黃酮在紫外區(qū)有特征吸收，峰的數(shù)目少，以帶Ⅱ為主，多數(shù)異黃酮有一小的肩峰即帶Ⅰ，這使紫外吸收作為分析方法成為可能[9]。

分子中取代基的性質(zhì)、位置和數(shù)目決定吸收帶的波長、強(qiáng)度和峰形。當(dāng)羥基位于A環(huán)（見圖1）時，使帶Ⅱ紅移、強(qiáng)度增強(qiáng)，并隨羥基數(shù)目的增多而增強(qiáng)，但是7-羥基取代則對光譜影響不大[10]。鳶尾苷元的7-羥基被葡萄糖取代成為鳶尾苷，本研究亦顯示兩者的紫外光譜極其相近，證明7位羥基或是糖基對波峰波幅的影響甚微，但是糖的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于羥基。試驗結(jié)果表明，吸收帶的強(qiáng)度與鳶尾苷和鳶尾苷元的總濃度具有良好的線性關(guān)系（r＝0.999 9），因此用濃度可以準(zhǔn)確測得總異黃酮的含量。

UV法可以測定總異黃酮含量，但不能區(qū)分糖苷和苷元。本研究發(fā)現(xiàn)，葛花異黃酮在含TEA的介質(zhì)中苷元的帶Ⅰ峰明顯升高并紅移，而糖苷的帶Ⅰ消失。苷元的含量與其帶Ⅰ的A值在一定范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，但因波幅小，在有糖苷存在時，準(zhǔn)確性差，因此不宜直接用于苷元的定量檢測。此外，帶Ⅰ與帶Ⅱ吸光度之比與苷元的相對百分含量在50%～100%區(qū)間內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 5）。本研究所制備的葛花異黃酮主要成分為鳶尾苷和鳶尾苷元，可通過UV法檢測苷元的相對百分含量，與HPLC法比較無顯著差異，為糖苷水解制備苷元提供了簡便、可靠的監(jiān)測手段。

異黃酮的酚羥基在堿性介質(zhì)中發(fā)生解離，生色作用增強(qiáng)，導(dǎo)致吸收紅移。本研究以TEA為位移試劑，克服了在強(qiáng)堿條件下顯色溶液穩(wěn)定性差的弊端[11]。本研究建立的方法用于葛花總異黃酮和苷元相對百分含量的檢測，操作方便快捷、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，為葛花異黃酮的研究提供了有力的手段。

[1] Mosihuzzman M，Naheed S，Hareem S.Studies on α-glucosidase inhibition and anti-glycation potential of Iris loczyi and Iris unguicularis[J].Life Sci，2013，92（3）：187-192.

[2] Zhang H，Liu XF，Chen S.Tectorigenin inhibits the in vitro proliferation and enhances miR-338 expression of pulmonary fibroblasts in rats with idiopathic pulmonary fibrosis[J].J Ethnopharmacol，2010，131（1）：165-173.

[3] 陳可，燕憲亮.葛根素注射液治療老年女性骨質(zhì)疏松癥合并不穩(wěn)定型心絞痛的療效分析[J].中國藥房，2017，28（12）：1644-1647.

[4] 張杰，常義生，曾鋮，等.葛花化學(xué)成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（23）：65-67.

[5] Thilakarathna SH，Rupasinghe HP.Flavonoid bioavailability and attempts for bioavailability enhancement[J].Nutrents，2013，5（9）：3367-3387.

[6] 何佳珂，于洋，陳西敬，等.黃酮類化合物的藥物代謝研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2010，35（21）：2789-2794.

[7] 王金鳳，魏穎，王芳，等.HPLC法快速測定葛花提取物中4種異黃酮類化合物的含量[J].中國藥師，2014，17（9）：1496-1498.

[8] 裴香萍，裴妙榮，張淑榮.葛花中鳶尾苷元定性定量方法研究[J].藥物分析雜志，2009，29（6）：1004-1006.

[9] 張海軍，王英，王慶鈺.大豆異黃酮檢測方法研究概述[J].糧食與油脂，2011（3）：39-42.

[10] 陳曉青，蔣新宇，劉佳佳，等.中草藥成分分離分析技術(shù)與方法[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：74-89.

[11] 池玉梅，居羚，鄧海山，等.分光光度測定總黃酮法的適用性[J].分析化學(xué)，2010，38（6）：893-896.

Decoction of Isoflavone Content and Its Acid Hydrolysis Conversion Rate in the Flower of Pueraria lobata

WANG Jinfeng，YANG Cuiyan，WANG Guoyu，WANG Fang，WEI Ying，ZHANG Yanping
（Second Division，Dept.of Internal Medicine，No.208 Hospital of PLA，Changchun 130062，China）

R917

A

1001-0408（2017）25-3490-04

2016-12-13

2017-06-13）

（編輯：劉明偉）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.25.10

吉林省科技發(fā)展計劃項目（No.20140204040YY）

＊主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：血管疾病的新藥研發(fā)。電話：0431-86988951。E-mail：13944927368@139.com