基于UPLCQTOF/MS技術(shù)的北青龍衣褐變過程中成分動(dòng)態(tài)變化分析

孫國東++霍金海++謝榮娟++王偉明

[摘要]該文分析不同褐變時(shí)期北青龍衣有效成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。采用UPLCQTOFMS/MS技術(shù)對(duì)13個(gè)褐變時(shí)期26批樣品進(jìn)行測(cè)定，差異性化合物通過Peakview 20/masterview10軟件，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰度比確定分子式，再通過與對(duì)照品及質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的二級(jí)譜圖比對(duì)、裂解規(guī)律分析，并結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，確定結(jié)構(gòu)式。結(jié)果不同褐變時(shí)期化學(xué)成分含量發(fā)生了明顯的變化，鑒定或推斷了北青龍衣中25個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，隨著褐變時(shí)間的變化，13個(gè)萘醌類化合物中，具有胡桃醌相似母核的6個(gè)化合物及3個(gè)萘醌苷類化合物的含量顯著下降，產(chǎn)生胡桃酮等4個(gè)萘醌衍生物；4個(gè)黃酮及2個(gè)酚酸類化合物含量顯著下降；6個(gè)二芳基庚烷類化合物顯著提高。該方法能夠快速、準(zhǔn)確鑒定北青龍衣的化學(xué)成分，并分析動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為揭示褐變對(duì)中藥材及果蔬成分的影響提供一種新的研究策略。

[關(guān)鍵詞]液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜； 北青龍衣； 褐變； 動(dòng)態(tài)變化

Dynamic variation of components in exocarp of Juglans mandshurica with

browning based on UPLCQTOF/MS

SUN Guodong， HUO Jinhai， XIE Rongjuan， WANG Weiming*

（Institute of Chinese Materia Medica， Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences， Harbin 150036， China）

[Abstract]To analyze the dynamic changes in components in exocarp of Juglans mandshurica at different browning periods Twentysix batches of exocarp of J mandshurica samples from thirteen browning periods were assessed by UPLCQTOFMS/MS The formula of different compounds were determined by accurate mass and isotopic abundance ratio from target screening function of Peakview 20/masterview10 software Then their structures were determined by analysis of MS/MS fragment or comparison with standard substances and references The contents of chemical components were changed significantly in different browning periods and twenty five compounds were identified or inferred Of the 13 naphthoquinone compounds， the contents of 6 compounds with similar parent nucleus as juglone and 3 naphthoquinone glycosides compounds were decreased significantly， and 4 naphthoquinone derivatives such as regiolone were produced； the contents of four flavones and two phenolic acids compounds were decreased significantly； and the contents of 6 diarylheptanoids compounds were increased significantly UPLCQTOF/MS method can be used to identify and analyze the chemical constituents from exocarp of J. mandshurica rapidly and accurately， and analyze the rules of dynamic changes， to reveal the browning of Chinese medicinal materials and its effects on compositions of fruits and vegetables.

[Key words]LCQTOF/MS； exocarp of Juglans mandshurica； browning； dynamic variation

北青龍衣為胡桃科胡桃屬植物核桃楸Juglans mandshurica Maxim未成熟果實(shí)的外果皮。民間多年來一直用于治療惡性腫瘤，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了大量的報(bào)道[12]。北青龍衣在鮮切過程中發(fā)生嚴(yán)重的褐變反應(yīng)，由綠色逐漸變?yōu)辄S綠色，干燥后變成棕褐色或黑褐色[34]。目前，關(guān)于褐變對(duì)北青龍衣化學(xué)成分及品質(zhì)的影響研究尚未見報(bào)道。

植物經(jīng)過一系列反應(yīng)產(chǎn)生褐色聚合物的過程稱褐變反應(yīng)，簡稱褐變，分為酶促褐變和非酶促褐變。褐變是中藥材、果蔬食品加工中普遍存在的一種變色現(xiàn)象，并嚴(yán)重影響其外觀、營養(yǎng)價(jià)值及市場(chǎng)價(jià)格。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)百合、枸杞、葛根、山藥、天麻、金銀花、牡丹皮、蘋果、大蒜、蓮藕、荔枝、馬鈴薯等易發(fā)生褐變的藥材、果蔬食品中褐變現(xiàn)象及其多酚氧化酶酶學(xué)特性進(jìn)行了廣泛而深入的研究[56]。endprint

目前，關(guān)于褐變對(duì)中藥材及果蔬品質(zhì)的影響多集中于外觀性狀、折干率、復(fù)水率等指標(biāo)的檢測(cè)，總多糖、總酚、總黃酮以及綠原酸、木犀草苷、沒食子酸等常見化合物的含量測(cè)定，難以全面反映褐變對(duì)中藥材及果蔬化學(xué)成分的整體影響[711]。近年來，將液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度相結(jié)合，尤其是與高分辨質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)合使用的技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于中草藥成分的全面分析[1213]。

本研究采用超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCQTOF/MS）技術(shù)對(duì)不同褐變時(shí)期北青龍衣進(jìn)行在線分離分析研究，確定其主要化學(xué)成分變化。利用UPLC維的保留時(shí)間鎖定化合物，通過二維的精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰度比確定分子式，再通過對(duì)照品比對(duì)或質(zhì)譜裂解規(guī)律分析確定或推斷其結(jié)構(gòu)式，通過有效成分動(dòng)態(tài)變化分析，以期為闡釋褐變對(duì)北青龍衣品質(zhì)的影響提供科學(xué)依據(jù)，亦為研究褐變對(duì)中藥材及果蔬的影響研究提供借鑒和參考。

1材料

11儀器

ACQUITY UPLC（美國Waters 公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱）；AB SCEIX TripleTOFTM 5600+質(zhì)譜儀（AB SCIEX，USA，配有 ESI 源和APCI源），數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF 16 software（AB SCEIX，USA）；數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)：Peakview 20/masterview10 software（AB SCEIX，USA）、Markerview121（AB SCEIX，USA）；Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard PreColumn 預(yù)柱（21 mm×5 mm，17 μm）。

KQ300DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224SCW型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）；LG16W型高速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

12試劑與對(duì)照品

甲醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，Merck，Germany），甲酸（色譜純，F(xiàn)isher，USA），蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。胡桃醌對(duì)照品（供含量測(cè)定用，成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批號(hào)H075131230）。

13藥材

北青龍衣于2015年6月29日采自哈爾濱市方正縣（東經(jīng)128°92′621″，北緯45°62′828″），經(jīng)初東君主任藥師鑒定為胡桃科植物核桃楸J mandshurica的果實(shí)。剝?nèi)⊥夤ぃ陵帥鐾L(fēng)處，分別于0，4，8，12 h，1，2，3，4，5，6，14，21，28 d平行取2份樣品用于供試品溶液制備，同時(shí)測(cè)定水分。

2方法

21對(duì)照品溶液的制備

精密稱取胡桃醌對(duì)照品適量，加甲醇制成約50 mg·L-1的溶液作為對(duì)照品溶液。

22供試品溶液的制備

取不同褐變時(shí)期北青龍衣藥材（0 h～1 d樣品取5 g；2～3 d樣品取2 g；4～28 d樣品取1 g），加甲醇25 mL，精密稱定，超聲處理30 min（功率300 W，頻率40 KHz），放冷，補(bǔ)足甲醇，搖勻，濾過，取續(xù)濾液于-80 ℃凍存，分析前恢復(fù)室溫，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得。

23色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard PreColumn 預(yù)柱（21 mm×5 mm，17 μm），柱溫30 ℃，流動(dòng)相A為01%甲酸水，B為01%甲酸乙腈，梯度洗脫（0～3 min，5%～22% B； 3～15 min，22%～60% B； 15～20 min，60%～70% B； 20～29 min，70%～100% B； 29～30 min，100% B；30～301 min，100%～5% B； 301～35 min，5% B），流速03 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL。

24質(zhì)譜條件

課題組前期研究表明，北青龍衣所含化合物在正離子模式下具有較好的響應(yīng)。因此，采用ESI 離子源，離子化模式為電噴霧正離子模式，離子源電壓為5 500 V，離子源溫度為 550 ℃，裂解電壓（DP）分別為 80 V，碰撞能量（CE）分別為 35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）分別為 15 eV。霧化氣體為氮?dú)猓o助氣Gas1為 55 PSI，輔助氣Gas2 為 55 Psi（1 Psi=6895 kPa），氣簾氣Cur Gas為 35 Psi。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為 m/z 80～1 500，IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps 的 8 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為m/z 50～1 500，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF 16 software（AB SCEIX，USA）；數(shù)據(jù)處理軟件：Peakview 20/masterview10 software（AB SCEIX，USA）。

25數(shù)據(jù)分析

251目標(biāo)性篩查使用peakview20（AB SCEIX，USA）軟件中的MasterView功能載入已選擇的數(shù)據(jù)，利用已建成的胡桃屬植物268種化合物一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，設(shè)置Mass Error（質(zhì)量數(shù)偏差）<5×10-6；權(quán)重30%，Isotope（同位素分布）差異<10%；權(quán)重40%，F(xiàn)ormula Finder score（分子式查找）>70%；權(quán)重40%，利用masterview10軟件目標(biāo)篩查功能對(duì)組分樣本進(jìn)行篩查。系統(tǒng)可以顯示該離子在不同褐變時(shí)期內(nèi)的XIC峰面積變化，便于半定量分析。也可針對(duì)萘醌類、黃酮類、二芳基庚烷、三萜、酚酸等北青龍衣已報(bào)道化合物，在一定的保留時(shí)間區(qū)域范圍，可利用masterview10軟件特征性子離子掃描功能對(duì)不同褐變時(shí)期樣本進(jìn)行篩查，分析不同類成分相對(duì)含量的變化趨勢(shì)。endprint

252非目標(biāo)性篩查將采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerView（AB SCIEX，USA）軟件，通過peak finding options功能將數(shù)據(jù)中所有色譜峰按照設(shè)置參數(shù)母離子強(qiáng)度>3 000 counts，S/N>10；MAX Element C50H200O50提取出來，這類化合物將作為分析的重點(diǎn)目標(biāo)，顯示每個(gè)離子在不同褐變時(shí)期內(nèi)的XIC峰面積變化，分析相對(duì)含量的變化趨勢(shì)。

26結(jié)構(gòu)鑒定

在正離子模式下，大多數(shù)化合物會(huì)產(chǎn)生[M+H]+分子離子，Triple TOFTM 5600+高分辨質(zhì)譜能夠在5×10-6誤差范圍內(nèi)測(cè)定大多數(shù)離子的精確質(zhì)量數(shù)，并準(zhǔn)確測(cè)定同位素豐度比。因此，通過Peakview 20 software軟件的Formula Finder功能，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)及同位素豐度比可確定化合物的分子式。對(duì)于有對(duì)照品的化合物，進(jìn)一步比對(duì)保留時(shí)間及二級(jí)質(zhì)譜信息進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；對(duì)于無法獲得對(duì)照品的化合物，首先，依據(jù)其碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)計(jì)算其碎片組成，對(duì)比chemspider數(shù)據(jù)庫給出的可能結(jié)構(gòu)式，再研究相似結(jié)構(gòu)化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過Peakview 20軟件分析化合物質(zhì)譜裂解特征以及文獻(xiàn)對(duì)比，結(jié)合二級(jí)譜圖相似度，從而推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)。

3結(jié)果

31UPLCQTOF/MS結(jié)果

正離子模式下，各褐變時(shí)期樣品色譜峰均得到了良好的分離，且彼此間存在較大差異，見圖1。

32北青龍衣成分的鑒定

課題組前期已對(duì)北青龍衣成分的裂解規(guī)律及鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[1415]。例如，萘醌類化合物是北青龍衣中主要的抗腫瘤活性物質(zhì)，準(zhǔn)分子離子連續(xù)失去H2O和CO是其典型的質(zhì)譜裂解規(guī)律[1617]。以化合物1為例，其準(zhǔn)分子離子175[M+H]+豐度比較高，易失去CO中性碎片形成豐度最高的147[M+H-CO]+碎片離子，在高能碰撞下發(fā)生開環(huán)反應(yīng)形成133[M+H-CO-CH2]+，121[M+H-CO-C2H2]+ 2個(gè)豐度較小的碎片離子，準(zhǔn)分子離子175[M+H]+亦能丟失1分子H2O形成豐度較小的157[M+H–H2O]+離子，并連續(xù)丟失CO碎片形成129[M+H-H2O-CO]+，101[M+H-H2O-2CO]+ 2個(gè)碎片離子。此裂解途徑與胡桃醌對(duì)照品二級(jí)碎片基本吻合，因此，鑒定化合物1為胡桃醌（juglone），其二級(jí)質(zhì)譜、裂解可能途徑以及離子碎片數(shù)據(jù)計(jì)算分別見圖2，3，表1。

33褐變過程中成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律分析

依據(jù)25項(xiàng)下化合物的篩查與鑒定的方法，共確定了不同褐變時(shí)期北青龍衣中25個(gè)具有明顯變化規(guī)律的化合物結(jié)構(gòu)。其中13個(gè)萘醌類化合物，分別具有胡桃醌結(jié)構(gòu)、萘醌苷類、萘醌衍生物見圖4，6個(gè)黃酮及酚酸類化合物見圖5，6個(gè)二芳基庚烷類化合物見圖6，質(zhì)譜鑒定及對(duì)比信息見表2～4。

具有胡桃醌相似母核的6個(gè)化合物的含量在褐變過程中均表現(xiàn)為明顯下降趨勢(shì)，14 d以后含量降至較低范圍。Premithramycinone H 和3，8，8′三羥基2，2′聯(lián)1，1′，4，4′二萘酮在第28天后完全轉(zhuǎn)化，質(zhì)譜未測(cè)到其準(zhǔn)分子離子。胡桃醌、5羥基2甲氧基1，4萘醌、5羥基3，3′雙胡桃醌、3，3′雙胡桃醌4個(gè)化合物在第28天與第0天比較，分別降低至原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的777%，286%，227%，636%，說明北青龍衣褐變過程中胡桃醌類化合物發(fā)生轉(zhuǎn)化，含量明顯降低。

3個(gè)萘醌苷類化合物的含量在褐變過程中均表現(xiàn)為明顯下降趨勢(shì)。其中1，4，8三羥基萘1OβD吡喃葡萄糖苷在剛剛發(fā)生褐變4 h后，含量迅速下降，并于2 d后降到較低值，保持穩(wěn)定，第28天后降低至原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的490%；4，5，8三羥基α四氫萘酮4OβD吡喃葡糖苷與1，

逐漸下降，并于2 d后降到較低值，保持穩(wěn)定，第28天后降低至原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的760%，952%，推測(cè)核桃青皮切開后，相關(guān)葡萄糖苷水解酶迅速發(fā)揮作用，導(dǎo)致萘醌苷類化合物快速水解，2 d后基本水解完全，酶逐漸失去活性，萘醌苷殘存量均在10%以下。

4個(gè)萘醌衍生物的含量在褐變過程中均表現(xiàn)為明顯增加趨勢(shì)。其中核桃酮、5羥基1，4萘酮、1，5萘二酚為褐變過程中產(chǎn)生的3個(gè)新化合物，并隨著褐變時(shí)間的延長，含量明顯提高；4[（1，4二氫8羥基1，4二氧代2萘基）氨基]丁酸在褐變過程中含量顯著增加，28 d后含量提高389倍。

由圖5可知，兒茶素、槲皮素、槲皮素3OβD葡萄糖苷、澤蘭苷等4個(gè)黃酮類化合物以及綠原酸、咖啡酸2個(gè)酚酸類化合物在褐變過程中均表現(xiàn)為明顯下降趨勢(shì)，在第28天與第0天比較，分別降低至原質(zhì)量分?jǐn)?shù)的180%，890%，967%，2011%，3465%，1806%。

由圖6可知，1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″環(huán)氧3庚酮、1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″環(huán)氧3庚醇、1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″環(huán)氧3庚酮、1 （4′羥基苯基）7（2″羥基3″甲氧基苯基）3′，4″環(huán)氧3庚酮、1 （4′甲氧基苯基）7苯基 3′，4″環(huán)氧3庚醇、茸毛香楊梅酮等6個(gè)二芳基類化合物在褐變過程中均表現(xiàn)為明顯上升趨勢(shì)，在第28天與第0天比較，分別升高2588，401，418，516，1356，243倍。

隨著褐變時(shí)間的變化，13個(gè)萘醌類化合物中，具有胡桃醌相似母核的6個(gè)化合物及3個(gè)萘醌苷類化合物的含量顯著下降，產(chǎn)生胡桃酮等4萘醌衍生物；4個(gè)黃酮及2個(gè)酚酸類化合物含量顯著下降，6個(gè)二芳基庚烷類化合物顯著提高。

4討論

不同褐變時(shí)期樣品含水量存在較大差異，前期測(cè)定表明1 d內(nèi)含水量在80%左右；2～3 d 60%左右；3 d后降低至20%以下。因此，采用同一來源樣本不同取樣量及相同處理方式制備樣品，進(jìn)樣前用甲醇調(diào)整折算至同等取樣量，保證了數(shù)據(jù)齊同可比。endprint

本研究采用目標(biāo)與非目標(biāo)篩查相結(jié)合的方法，能夠最大限度發(fā)現(xiàn)北青龍衣中的有效成分及主成分，并通過XIC峰面積變化快速分析成分的變化規(guī)律。研究過程中發(fā)現(xiàn)，目前，以胡桃醌含量測(cè)定為主的青龍衣質(zhì)量控制方法存在較大缺陷，胡桃醌性質(zhì)不穩(wěn)定，難以準(zhǔn)確反映青龍衣藥材真實(shí)質(zhì)量。因此，課題組前期建立的以轉(zhuǎn)化產(chǎn)物胡桃酮或二者同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值[18]。

目前，褐變現(xiàn)象對(duì)中藥材成分、藥效及毒性的影響尚不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道及課題組前期研究已證實(shí)胡桃醌（5羥基1，4萘醌）是北青龍衣的主要毒性物質(zhì)基礎(chǔ)[1920]，褐變過程中轉(zhuǎn)化可能是減毒重要機(jī)制之一。課題組在新藥研發(fā)過程中，證實(shí)胡桃酮是一種高效低毒的抗腫瘤化合物，為褐變過程中新產(chǎn)生的化合物。二芳基庚烷化合物具有良好的抗腫瘤活性，本文首次發(fā)現(xiàn)了褐變過程中二芳基庚烷化合物的含量顯著提高。這與前期研究表明褐變后的北青龍衣干品抗腫瘤活性略高于鮮品一致[21]。且根據(jù)人工合成二芳基庚烷的途徑和方法也有學(xué)者推測(cè)小分子酚酸類成分是植物體內(nèi)生物合成的關(guān)鍵前提[22]。黃酮及酚酸類成分的含量下降可能與核桃青皮中多種活性酶催化其作為底物合成二芳基庚烷類有關(guān)，為轉(zhuǎn)化提供了前體原料。數(shù)十年來，二芳基庚烷化合物全合成也一直吸引著合成化學(xué)家的密切關(guān)注，但其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成十分困難。因此，筆者認(rèn)為利用酚酸類成分結(jié)合植物體內(nèi)源性酶生物合成二芳基庚烷類化合物較化學(xué)合成更有前途。

總之，本文建立的基于UPLCQTOF/MS技術(shù)的北青龍衣褐變成分動(dòng)態(tài)變化分析策略為理解褐變過程中成分變化提供了新的視角，對(duì)中藥材及果蔬褐變研究具有一定的借鑒作用。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]endprint