水蛭通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路對(duì)早期動(dòng)脈粥樣硬化大鼠VSMCs的影響

吳晶魁+楊喬 李洋洋

[摘要]為了探究中藥水蛭干預(yù)作用下p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)早期動(dòng)脈粥樣硬化（AS）大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖與凋亡的影響及其可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)通過(guò)生化分析儀檢測(cè)中藥水蛭對(duì)大鼠血脂（TG，TC，LDLC，HDLC）水平的調(diào)控；ELISA檢測(cè)血清中TGFβ1的水平；免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測(cè)VSMCs的PCNA，Caspase3表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)中藥水蛭對(duì)VSMCs中MKK3，p38及Cmyc蛋白表達(dá)的影響；HE染色觀察大鼠胸主動(dòng)脈形態(tài)變化。結(jié)果顯示，中藥水蛭可使TC，LDLC明顯降低，HDLC升高，TGFβ1，PCNA的表達(dá)水平明顯下降，Caspase3表達(dá)上調(diào)，MKK3，p38及Cmyc蛋白表達(dá)水平下降，以及抑制內(nèi)膜增厚、減少斑塊形成。以上結(jié)果表明中藥水蛭可能通過(guò)調(diào)降血脂，降低TGFβ1水平，影響p38MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)，從而抑制VSMCs的增殖、促進(jìn)其凋亡，抑制內(nèi)膜增厚、減少斑塊形成等環(huán)節(jié)，進(jìn)而干預(yù)早期AS進(jìn)程。

[關(guān)鍵詞]水蛭；動(dòng)脈粥樣硬化；p38MAPK信號(hào)通路；血管平滑肌細(xì)胞；增殖與凋亡

Effect of leech on VSMCs in early atherosclerosis rats via

p38MAPK signaling pathway

WU Jingkui1， YANG Qiao1*， LI Yangyang2， XIE Dongjie1

（1Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China；

2The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China）

[Abstract]To explore the effect of leech on proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells（VSMCs） in early atherosclerosis rats via p38MAPK signaling pathway and investigate its possible mechanism Biochemical analyzer was used to examine the regulation of leech on levels of triglycerides（TG）， total cholesterol（TC）， lowdensity lipoprotein（LDLC）， and highdensity lipoprotein（HDLC） in blood lipid of rats The expression of transforming growth factorbeta 1（TGFβ1） in serum was detected by ELISA Immunological histological chemistry （IHC） was taken to measure the expression levels of proliferating cell nucleus antigen（PCNA） and cell apoptosis proteinase3（Caspase3）， while the protein expression levels of MKK3， p38 and Cmyc were detected by Western blot In addition， hematoxylin and eosin（HE） staining was used to observe the morphological change of thoracic aortas The results showed that leech decreased the levels of TC， LDLC obviously and increased HDLC， suppressed the expression levels of TGFβ1 and PCNA， upregulated Caspase3， downregulated the expression levels of MKK3， p38， and Cmyc protein HE staining indicated that it could inhibit intimal thickening and reduce plaque formation The above results indicated that leech may affect the protein expression of the p38MAPK signaling pathway to inhibit proliferation and promote the apoptosis of VSMCs via reducing blood lipid levels and suppressing TGFβ1， aiming at inhibiting intimal thickening and reducing plaque formation， tand then slowing down the process of early atherosclerosis

[Key words]leech； atherosclerosis； p38MAPK signaling pathway； vascular smooth muscle cells； proliferation and apoptosisendprint

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的激活、遷移與增殖是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生的重要病理過(guò)程[1]。一般情況下，VSMCs保持靜止，即處于不增殖的狀態(tài)[2]，但是在血管損傷后VSMCs將會(huì)異常增殖，同時(shí)引起早期AS病理改變[3]。有研究指出，VSMCs增殖與凋亡的失衡是AS發(fā)生過(guò)程中斑塊形成的的重要環(huán)節(jié)[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorbeta1，TGFβ1）具有激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的作用[5]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）是調(diào)控細(xì)胞增殖與死亡的重要通路，可參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過(guò)程[6]，TGFβ1作為外在刺激因子，對(duì)p38MAPK信號(hào)通路的激活具有重要作用[7]。血管壁的組成細(xì)胞主要包括VSMCs和內(nèi)皮細(xì)胞，成熟的內(nèi)皮細(xì)胞不具有增殖活性，因此在早期AS的發(fā)生主要為VSMCs增殖所致；增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）[8]是細(xì)胞基因復(fù)制、修復(fù)及細(xì)胞周期控制的基本蛋白，為細(xì)胞增殖的一種可靠標(biāo)志物，所以在早期AS過(guò)程中PCNA含量的變化與VSMCs異常增殖保持一致。AS發(fā)生過(guò)程中也存在VSMCs的凋亡，而細(xì)胞凋亡蛋白3（Caspase3）是細(xì)胞凋亡通路中一種關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有重要的作用，胞漿中活化后的Caspase3能夠裂解相應(yīng)的胞漿及胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。

中藥水蛭（leech）最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主逐惡血、瘀血、月閉、破血瘕積聚……利水道”，水蛭味咸、苦、平，有破血逐瘀，通經(jīng)消癥的功效。對(duì)不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、高脂血癥、冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病具有較好的臨床療效[10]。

本課題組對(duì)脈血康膠囊（內(nèi)容物為單藥水蛭粉）的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中藥水蛭具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕氧化損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制炎癥反應(yīng)等作用[1112]，同時(shí)可抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化、增殖和遷移[13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察中藥水蛭干預(yù)早期AS大鼠，檢測(cè)VSMCs增殖與凋亡及p38MAPK信號(hào)通路蛋白等指標(biāo)，探究中藥水蛭干預(yù)下p38MAPK信號(hào)通路對(duì)VSMCs增殖與凋亡的影響及抗AS的作用機(jī)制。

1材料

11動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（175±20） g，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK（軍）20160001。

12藥物及試劑本實(shí)驗(yàn)所用中藥水蛭為脈血康膠囊內(nèi)容物（貴州信邦制藥股份有限公司提供，批號(hào)20160406）；高脂飼料[配方：729%普通飼料，2%膽固醇，01%膽鹽，5%蔗糖，10%豬油，10%蛋黃粉，合格證號(hào)SCXK（京）20140008，批號(hào)20160410]及普通飼料（合格證號(hào)SCXK（京）20060006，批號(hào)20160310）訂購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司；維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)130107）；醫(yī)用水合氯醛（批號(hào)20160426）由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院提供；TGFβ1酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)EK0514）、大鼠抗PCNA（貨號(hào)BM0104）、Caspase3單克隆抗體（貨號(hào)BA2142）及鏈霉親和素生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABCPOD）免疫組化試劑盒（貨號(hào)SAl020）與DAB顯色試劑盒棕黃（貨號(hào)AR1022）購(gòu)于武漢博士德生物公司；血脂試劑盒（德國(guó)羅氏診斷有限公司）；兔抗MKK3、抗p38（D13E1）、抗Cmyc（D3N8F）單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)分別為5674s，8690s，13987s）；βactin抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，貨號(hào)SC47778）。

13儀器TL18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所）；Modular P全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)羅氏診斷有限公司）；Tecan Safire酶標(biāo)儀（瑞士）；TU1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Olympus BX51正置熒光顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本）；Research plus移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf）；EPS300電泳/電轉(zhuǎn)裝置（上海天能科技有限公司）；Chemi Scope 6300化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；TS100搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）。

2方法

21動(dòng)物分組及處理40只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠分為4組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、水蛭粉低、高（06，12 g·kg-1）劑量組，每組各10只。隨即對(duì)模型組、水蛭高、低劑量組大鼠一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬(wàn)IU·kg-1，同時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)；對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，給予普通飼料喂養(yǎng)。第2天將配好的中藥水蛭藥液按照規(guī)定劑量（10 mL·kg-1）分別對(duì)水蛭干預(yù)組進(jìn)行灌胃，同時(shí)對(duì)照組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃8周。每周末稱大鼠體質(zhì)量1次以調(diào)整灌胃量。

22血清指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)?，各組大鼠禁食不禁水12 h，次日清晨腹腔注射10%水合氯醛（3 mL·kg-1）進(jìn)行麻醉，麻醉滿意固定好后剖開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈取血6 mL，迅速4 ℃下以3 000 r·min-1離心10 min，用移液槍將上層血清分裝于凍存管中放入-20 ℃冰箱中保存待檢測(cè)。①取部分血清復(fù)溫，于全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）；②另取各組大鼠部分血清復(fù)溫，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定血清TGFβ1含量。endprint

23主動(dòng)脈病理學(xué)觀察取血后，分離出主動(dòng)脈弓并剪取05 cm，生理鹽水洗凈血跡后放入10%中性福爾馬林溶液固定，以備制作石蠟切片（4～5 μm）。每組隨機(jī)選取7個(gè)大鼠主動(dòng)脈弓標(biāo)本，每一標(biāo)本取一張石蠟切片進(jìn)行蘇木精和伊紅（HE）染色，200倍光鏡下觀察主動(dòng)脈的形態(tài)。

24免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PCNA，Caspase3的表達(dá)選取已制作好的石蠟切片（每組各7個(gè)標(biāo)本），每一標(biāo)本PCNA，Caspase3指標(biāo)各染2張片；按SABC免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，大鼠PCNA，Caspase3對(duì)應(yīng)抗體分別按1∶100及1∶150稀釋作為一抗，顯二管DAB顯色，封片。免疫組化完成后，將各指標(biāo)染色切片于400倍光鏡下觀察5個(gè)不重疊視野并拍照。使用ImagePro Plus 60軟件測(cè)量分析VSMCs分布區(qū)域面積（area）和其所在范圍內(nèi)PCNA，Caspase3陽(yáng)性染色積分光吸收度（A），最后用每個(gè)標(biāo)本的平均光密度值（A/area）進(jìn)行半定量分析。

25Western blot檢測(cè)MKK3，p38，Cmyc蛋白的表達(dá)剪取剩余胸主動(dòng)脈，分段放入凍存管于液氮中迅速冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待檢測(cè)。各組隨機(jī)取7個(gè)冷凍標(biāo)本，復(fù)溫后用預(yù)生理鹽水漂洗去除血跡，超聲破碎，取裂解液，加入上樣緩沖液，混勻，取離心后的樣本上樣，按照電泳程序進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下膜，浸沒(méi)在5%牛奶中封閉1 h，之后按照說(shuō)明書(shū)使用要求加一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌，孵育二抗，室溫孵育1 h。洗滌3次顯色，曝光。使用Image J軟件對(duì)MKK3，p38，Cmyc蛋白條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算，與內(nèi)參比較，分析相對(duì)蛋白表達(dá)量。

26統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 220統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，先對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示；多組資料組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）：方差齊時(shí)，組間比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane′s T2檢驗(yàn)；P<005或P<001為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31中藥水蛭對(duì)早期AS大鼠血脂水平的影響各組TG差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，模型組TC和LDLC顯著升高，HDLC降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；與模型組比較，水蛭各干預(yù)組的TC和LDLC明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001），水蛭低劑量組較高劑量組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；水蛭2個(gè)干預(yù)組較模型組HDLC有升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001），2組間HDLC無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

32中藥水蛭對(duì)早期AS大鼠血清TGFβ1表達(dá)水平的影響模型組TGFβ1較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；水蛭各干預(yù)組TGFβ1明顯較模型組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；2個(gè)水蛭干預(yù)組組間差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

33中藥水蛭對(duì)早期AS大鼠VSMCs的PCNA，Caspase3表達(dá)影響模型組的PCNA較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001），Caspase3輕度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；水蛭各干預(yù)組額PCNA較模型組明顯降低，Caspase3明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；與水蛭低劑量組相比，水蛭高劑量組PCNA有所升高，Caspase3有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3，見(jiàn)圖1，2。

34中藥水蛭對(duì)早期 AS大鼠VSMCs中MKK3，p38，Cmyc蛋白表達(dá)影響的Western blot檢測(cè)與對(duì)照組相比較，模型組的p38和Cmyc蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001），MKK3表達(dá)水平差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；水蛭各干預(yù)組的MKK3，p38，Cmyc蛋白表達(dá)明顯較模型組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；與水蛭低劑量組比較，水蛭高劑量組的MKK3及Cmyc蛋白表達(dá)輕度增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），p38表達(dá)水平差異不明顯，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4，圖3。

35胸主動(dòng)脈HE染色光鏡下觀察胸主動(dòng)脈HE染色切片（200倍視野），可見(jiàn)對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜完整、光滑，VSMCs排列整齊，未見(jiàn)明顯膽固醇結(jié)晶沉積及斑塊形成；模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜不平整，可見(jiàn)明顯向腔內(nèi)凸起的斑塊，內(nèi)、中膜明顯增厚，VSMCs增生、排列紊亂，可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶沉積，明顯斑塊形成；水蛭各干預(yù)組主動(dòng)脈病理改變較模型組均有不同程度減輕，可見(jiàn)水蛭低劑量組主動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚較輕，內(nèi)膜下少量斑塊形成，斑塊內(nèi)有少量膽固醇結(jié)晶，VSMCs排列較整齊，水蛭高劑量組可見(jiàn)少量斑塊及膽固醇結(jié)晶沉積，VSMCs排列較為整齊，斑塊較少，見(jiàn)圖4。

4討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飼料飼養(yǎng)及腹腔注射維生素D3建立早期AS大鼠模型，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血脂指標(biāo)明顯升高，HE染色觀察胸主動(dòng)脈血管壁形態(tài)，可見(jiàn)主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，凸向管腔的斑塊，膽固醇結(jié)晶明顯，表明建立早期AS大鼠模型成功。本實(shí)驗(yàn)中，各組TG水平無(wú)明顯差異，可能與大鼠禁食12 h有關(guān)；模型組大鼠TC，LDLC較對(duì)照組明顯升高，HDLC有降低趨勢(shì)，表明中藥水蛭可降低各干預(yù)組大鼠與AS發(fā)生相關(guān)的危險(xiǎn)因素血清TC，LDLC水平，升高HDLC水平，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。TC，LDLC增高及HDLC的降低是AS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，LDLC可進(jìn)入動(dòng)脈壁，并刺激VSMCs增生，促使AS的發(fā)生，HDLC具有轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)的作用，是影響AS發(fā)生的保護(hù)因素；因此，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥水蛭可能通過(guò)調(diào)降早期AS大鼠的血脂水平，升高HDLC來(lái)影響AS進(jìn)程。

VSMCs的增殖、分化受多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)影響[14]，如血小板源性生長(zhǎng)因子（plateletderived growth factor，PDGF），TGFβ1，表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF），腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNFα）等。AS的病理過(guò)程在于高血脂等危險(xiǎn)因素引起血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)炎癥，脂質(zhì)沉著，VSMCs增殖參與損傷修復(fù)致內(nèi)膜增厚，泡沫細(xì)胞聚集形成斑塊[15]；TGFβ1是一種具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)作用的多功能通道蛋白，有促進(jìn)VSMCs增殖與分化的作用，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VSMCs在生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)刺激下，可發(fā)生從靜止、收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變到增殖狀態(tài)的血管病理改變[16]。通過(guò)HE染色切片觀察模型組大鼠血管形態(tài)時(shí)可見(jiàn)血管內(nèi)膜增厚，斑塊形成明顯，表明VSMCs增殖明顯，同時(shí)模型組大鼠的血清TGFβ1較對(duì)照及中藥水蛭各干預(yù)組明顯升高，說(shuō)明TGFβ1促進(jìn)了VSMCs增殖。PCNA為細(xì)胞增殖的一種可靠標(biāo)志物，在增殖活躍的細(xì)胞中表達(dá)明顯，因此PCNA含量的變化與VSMCs增殖保持一致[8]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的PCNA表達(dá)水平明顯較中藥水蛭干預(yù)組高，表明模型組的VSMCs增殖程度較2個(gè)干預(yù)組高，因此可證實(shí)HE染色觀察到的模型組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚及斑塊形成明顯與VSMCs增殖有關(guān)。早期AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在VSMCs增殖的同時(shí)還伴隨著VSMCs的凋亡，研究[4]指出VSMCs增殖與凋亡的失衡是AS斑塊形成的關(guān)鍵。Caspase家族包含眾多成員（如Caspase2，Caspase3，Caspase4，Caspase8，Caspase9等），其中，Caspase3是細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵激活因子，其以酶原的形式存在于胞漿中，被Caspase9激活后能夠裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。本實(shí)驗(yàn)中，中藥水蛭各干預(yù)組Caspase3表達(dá)水平較模型組增高，模型組與對(duì)照組差異不大，表明中藥水蛭各干預(yù)組VSMCs凋亡程度較模型組高；2個(gè)中藥水蛭干預(yù)組的PCNA及Caspase3表達(dá)水平差異不明顯，考慮為中藥水蛭高低劑量的干預(yù)療效差異不大，后期實(shí)驗(yàn)可調(diào)整給藥量觀察。從以上結(jié)果可推測(cè)，中藥水蛭可能能夠在一定程度上降低TGFβ1的表達(dá)而抑制VSMCs增殖，增加Caspase3的表達(dá)而促進(jìn)VSMCs的凋亡，進(jìn)而減輕血管內(nèi)膜的增厚、減少膽固醇結(jié)晶沉積及斑塊形成，從而起到減緩早期AS進(jìn)展的作用。endprint

絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程中，MAPK包含3種基本通路，即p38，ERK（extracellular regulated kinase），JNK（cJun Nterminal kinase ）[18]；其中，p38MAPK在炎癥、應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)的多種生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用[19]。MKK3/MKK6為p38MAPK信號(hào)通路公認(rèn)的上游激酶[20]，通過(guò)直接磷酸化酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸殘基激活p38，然后作用于下游的靶基因Cmyc等[21]，通過(guò)Cmyc調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡的過(guò)程[22]。本實(shí)驗(yàn)從p38MAPK信號(hào)通路上游激酶MKK3、中間蛋白p38以及下游靶基因（原癌基因Cmyc）出發(fā)，研究p38MAPK信號(hào)通路在對(duì)早期AS大鼠VSMCs的增殖與凋亡的調(diào)控作用，以及中藥水蛭干預(yù)后相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，模型組的p38及Cmyc蛋白表達(dá)較對(duì)照組高，MKK3表達(dá)無(wú)明顯差異，而中藥水蛭各干預(yù)組的MKK3，p38及Cmyc蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組，同時(shí)，水蛭高劑量組MKK3及Cmyc蛋白表達(dá)水平較水蛭低劑量組輕度增高，但差異無(wú)顯著性。從以上結(jié)果可知，中藥水蛭可能能夠降低p38MAPK信號(hào)通路中上游激酶MKK3、中間蛋白p38及下游原癌基因Cmyc蛋白表達(dá)水平。同時(shí)，TGFβ1可影響p38信號(hào)通路的激活[23]，進(jìn)而影響VSMCs的增殖與凋亡等。從Wu H等[24]的研究中可知，VSMCs的增殖與遷移受到抑制時(shí)，伴隨著p38蛋白表達(dá)水平的下降，表明p38蛋白表達(dá)與VSMCs增殖有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明p38信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平與TGFβ1及VSMCs的增殖與凋亡指標(biāo)呈一致性，因此推測(cè)中藥水蛭可能通過(guò)干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，調(diào)控VSMCs的增殖與凋亡來(lái)影響AS進(jìn)程，從而起到抗AS的作用。

綜上所述，AS的發(fā)生同VSMCs的增殖與凋亡失衡密切相關(guān)，中藥水蛭可能能夠調(diào)降血脂，降低TGFβ1表達(dá)、增加Caspase3的表達(dá)，通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控抑制VSMCs增殖、促進(jìn)其凋亡，減少血管內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)浸潤(rùn)及斑塊形成，進(jìn)而減緩AS的進(jìn)程。然而對(duì)于中藥水蛭干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究闡明。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint