基于DNA條形碼技術(shù)的維吾爾藥材桑葚基原鑒定研究

樊叢照 徐建國 李亞偉 李曉瑾

[摘要]該研究通過分析多途徑來源的新疆桑屬植物及藥材樣本的ITS2，psbAtrnH序列，為藥材分子鑒定提供依據(jù)。以51個(gè)新疆桑屬植物及藥材為樣本，對(duì)其ITS2，psbAtrnH序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，用MEGA 60計(jì)算其種內(nèi)、種間Kimura 2parameter（K2P）距離，分析變異位點(diǎn)，并構(gòu)建NJ鑒別樹。ITS2序列分析結(jié)果顯示，桑Morus alba、韃靼桑M alba var tatarica、黑桑M nigra種內(nèi)無變異；桑與韃靼桑種間無變異；桑與黑桑種間存在13個(gè)變異位點(diǎn)，種間平均KP2遺傳距離為004；桑與藥材樣本間無信息變異位點(diǎn)，NJ鑒別樹可將桑及韃靼桑與黑桑區(qū)分。psbAtrnH序列分析結(jié)果顯示，桑與黑桑種內(nèi)各有1個(gè)變異位點(diǎn)，3種植物種間存在插入/缺失變異，可相互區(qū)分；種間變異與藥材樣本內(nèi)變異一致。因此，ITS2序列可將來源于桑、韃靼桑的藥材樣本與黑桑區(qū)分，psbAtrnH序列可將來源于三者的藥材樣本區(qū)分，為維吾爾藥材真?zhèn)舞b別及市場監(jiān)管提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]維吾爾藥； 桑； DNA條形碼； ITS2； psbAtrnH

Identification of origin plant of Uygur medicine mulberry

based on DNA barcode

FAN Congzhao1， XU Jianguo1， LI Yawei2， LI Xiaojin1*

（1Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnical Materia State Administration of Traditional Chinese

Medicine， Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine Resources， Urumqi 830002， China；

2 Testing Center of Xinjiang Entry Exit Inspection and Quarantine Portal， Urumqi 830063， China）

[Abstract]To provide molecular evidence for medical material identification， we analyzed the nucleotide sequence of ITS2， psbAtrnH gene in Morus genus plants and commercial products which were obtained from different places in Xinjiang The sequence of ITS2 and psbAtrnH in fiftyone samples were amplified and sequenced， MEGA 60 was used to analyze the intra and interspecific K2P distances， neighborjoining （NJ） tree was used to constructing clustering tree ITS2 sequence analyzed results showed that there is no intraspecific variation among Morus alba， M alba var tatarica and M nigra， but 13 variations sites were exist between M alba and M nigra and their interspecific K2P distances was 004， which indicated that there had significant variation in them We didn′t find informative variation sites between Morus genus plants and commercial products， and we also found that M nigra can be distinguished from other two species by NJ Tree PsbAtrnH analysis results showed there was only one variation site between M alba and M nigra， but insertion or deletion variation were remarkable evidence among M alba， M alba var tatarica and M Nigra Interspecific variation was accordance with intraspecific variation of commercial products So ITS2 and psbAtrnH gene were important marker for M alba， M alba var tatarica and M nigra identification This study provided important evidence for Uygur medicine identification and market supervision

[Key words]Uygur medicine； mulberry； DNA barcode； ITS2； psbAtrnHendprint

與漢民族“前不栽桑，后不栽柳”的習(xí)俗不同，維吾爾族民居具有庭院中栽種桑樹的傳統(tǒng)[1]，新疆桑樹種質(zhì)資源豐富，不同產(chǎn)地性狀存在差異，種和品種之間的劃分界限模糊不清。新疆民間通常以桑椹的顏色或?；ǖ男詣e為依據(jù)，把桑樹分為黑桑、白桑、粉桑及公桑、藥桑5個(gè)類型[2]，《新疆植物志》將其分為白桑Morus alba、黑桑M nigra及變種韃靼桑M alba var tatarica[3]。桑屬植物具有重要的藥用價(jià)值，《中國藥典》及《新疆維吾爾自治區(qū)中藥維吾爾藥飲片炮制規(guī)范》均收載桑M alba為基原植物[45]，其藥性為一級(jí)濕熱，主治干寒性或黑膽質(zhì)性疾病，黑桑雖未載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亦作為維吾爾常用藥材使用，但其藥性為一級(jí)干二級(jí)寒，主治熱性或血液質(zhì)性和膽液質(zhì)性疾病，藥性與功能均與白桑存在一定的差異[67]，因此二者不能混用。

正確的藥材基原是保證藥材質(zhì)量及療效的前提，維吾爾藥材質(zhì)量控制水平整體較低，市售藥材基原不明極為常見[8]。維吾爾藥材桑葚多來源于民間貿(mào)易，不同植物來源的桑葚藥材形態(tài)特征相近，臨床應(yīng)用時(shí)不易區(qū)分，具有潛在的隱患。利用傳統(tǒng)的基原鑒定和性狀鑒定難以準(zhǔn)確快速地進(jìn)行鑒別。DNA條形碼技術(shù)具有通用性強(qiáng)、鑒定結(jié)果可靠、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥民族藥材鑒定中[9]?！吨袊幍洹?015 年版已將DNA條形碼ITS2及psbAtrnH序列作為候選序列收載[10]。本研究擬采用ITS2及psbAtrnH序列，通過分析多途徑來源的桑屬植物及藥材樣品，建立維吾爾醫(yī)常用藥材桑及其近緣種的鑒定方法，為維藥桑葚的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)的依據(jù)，為正確合理利用維吾爾藥材資源提供理論基礎(chǔ)。

1材料

51份實(shí)驗(yàn)樣品包括葉片30份、藥材樣品21份，基原植物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員及新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所王果平副研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本館（新疆XTNM），實(shí)驗(yàn)所獲得基原植物的單倍型序列已提交至GenBank，見表1。

PCR擴(kuò)增所用引物ITS2序列由上海生工生物工程合成，ITS2正向序列：5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′，反向：5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT3′；DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生物；psbAtrnH正向序列：5′GTTATGCATGAACGTAATGCTC3′，反向：5′CGCGCATGGTGGATTCACAATCC3′[11]。DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生物（Tiangen Biotech Co）。

DNA提取研磨儀GT100（GRINDER，中國），Anker TGL16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器）； PCR擴(kuò)增儀為070851（An Analytik Jena company，德國）。

2方法

21DNA提取及檢測(cè)稱取干燥葉片或果實(shí)30 mg，DNA提取研磨儀1 000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

22PCR擴(kuò)增及測(cè)序PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、序列拼接、序列注釋及分析對(duì)比參照Chen等研究結(jié)果[12]；使用MEGA 60分析序列，計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離，用NJ法構(gòu)建聚類樹[13]。

3結(jié)果與分析

31序列信息ITS2序列分析結(jié)果顯示，桑為1個(gè)單倍型，長度236 bp，GC量631%；韃靼桑序列信息與桑一致，黑桑單倍型數(shù)為1，長度為236 bp，GC量為610%；藥材樣本有2個(gè)單倍型，序列長度為236 bp，GC量為610%，631%。PsbAtrnH序列分析結(jié)果表明，桑有2個(gè)單倍型，長度為452 bp，GC量為239%，241%；韃靼桑為1個(gè)單倍型，序列長度為470 bp，GC量234%；黑桑單倍型數(shù)為2，序列長度458 bp，GC量236%，234%；藥材樣本有3個(gè)單倍型，序列長度分別為452，458，470 bp，GC量分別為234%，236%，239%，見表2。

32種內(nèi)及種間K2P遺傳距離在ITS2序列中，桑、韃靼桑及黑桑種內(nèi)K2P遺傳距離均為0，藥材樣本內(nèi)K2P遺傳距離為004；桑與韃靼桑種間無變異，兩者與黑桑種間K2P遺傳距離為004；桑、韃靼桑、黑桑與藥材樣本之間的K2P遺傳距離均為0～004，藥材與植物種內(nèi)種間K2P遺傳距離差異不顯著。根據(jù)psbAtrnH序列分析結(jié)果，韃靼桑種內(nèi)K2P遺傳距離為0，桑、黑桑種內(nèi)K2P遺傳距離均為0002，藥材樣本內(nèi)K2P遺傳距離為0～0002；桑、韃靼桑、黑桑種間K2P遺傳距離變化范圍為0001～0002，三者與藥材之間K2P遺傳距離變化范圍0～0004，種內(nèi)種間K2P遺傳距離無顯著差異，見表3。

33種內(nèi)及種間變異位點(diǎn)分析新疆桑屬植物及其藥材ITS2序列比較后，共有13個(gè)變異位點(diǎn)，見表4。包括9個(gè)轉(zhuǎn)換/顛換突變和4個(gè)插入/缺失變異，13個(gè)變異位點(diǎn)的堿基差異均可以將桑與黑桑區(qū)分開；藥材樣本中變異位點(diǎn)包括了桑與黑桑2種類型。

PsbAtrnH序列總變異位點(diǎn)數(shù)為27，見表5。包括3個(gè)轉(zhuǎn)換/顛換突變和24個(gè)插入/缺失變異，桑種內(nèi)474位點(diǎn)存在A/C變異，黑桑種內(nèi)73 bp位點(diǎn)存在G/T變異。66～71 bp位點(diǎn)的AATATT插入/缺失變異可將黑桑與其桑、韃靼桑區(qū)分，425～442 bp位點(diǎn)的插入缺失變異能將韃靼桑與桑、黑桑區(qū)分。

34桑屬植物NJ樹鑒別采用NJ樹法鑒定，基于ITS2序列，桑、韃靼桑可以與黑桑區(qū)分，但桑與韃靼桑無法區(qū)分，與編號(hào)YC125006為相同序列類型的藥材均與桑、韃靼桑聚在一起，與編號(hào)YC125001為相同序列類型的藥材均與黑桑聚在一起；基于psbAtrnH序列，黑桑單獨(dú)聚為一支，并與編號(hào)為YC125001的藥材聚在一起，見圖1，2。endprint

4討論

41DNA條形碼的選擇桑樹是一種集食用、藥用、生態(tài)保護(hù)等多種經(jīng)濟(jì)價(jià)值為一體的經(jīng)濟(jì)樹種[14]，在中國已經(jīng)具有5 000多年的栽培歷史[15]，長期的栽培和廣泛的地理分布使其種間雜交嚴(yán)重，分類至今存在爭議[16]，因此傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)在區(qū)分不同種植資源存在一定的難度，桑M alba的干燥果實(shí)作為藥材，僅憑外觀性更是狀難以與桑屬其他種類的果實(shí)區(qū)分。諸多研究者通過遺傳多樣性、核糖體序列及葉綠體序列分子標(biāo)記方法對(duì)不同來源的桑樹資源進(jìn)行了鑒定[17]，雖然研究表明ITS序列區(qū)分不同種類的桑樹具有較高的效率，但I(xiàn)TS2序列在藥材樣品擴(kuò)增中效率更高[18]，此外psbAtrnH序列是進(jìn)化速率最快的葉綠體間隔區(qū)之一，作為植物DNA條形碼的候選片段，psbAtrnH序列具有引物通用性較好、擴(kuò)增成功率較高，為單親遺傳，不存在序列雜合的影響[1922]等特點(diǎn)，因此本研究將ITS2及psbAtrnH序列作為候選DNA條形碼對(duì)不同來源的桑屬植物樣本和藥材進(jìn)行鑒定。

42DNA條形碼可成功鑒定不同來源的藥材桑葚本研究選擇DNA條形碼ITS2，psbAtrnH等2條序列對(duì)不同來源的新疆桑屬植物樣本和藥材桑葚進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，無論從葉片還是從藥材桑葚中均可成功提取基因組DNA，擴(kuò)增效率均為100%。種間變異及NJ樹鑒定結(jié)果表明，ITS2序列可以鑒定藥材桑與黑桑，但不能將桑與韃靼桑區(qū)分開，作為變種其是否可以與桑同等入藥還未見此類報(bào)道；psbAtrnH序列中的插入/缺失變異能成功鑒定來源于桑、韃靼桑及黑桑的藥材，但插入缺失變異無法在NJ鑒別樹種表現(xiàn)出來。因此，ITS2與psbAtrnH片段結(jié)合使用，可成功鑒定來源于桑、韃靼桑和黑桑的藥材。

43DNA條形碼可為維吾爾藥材桑葚的正確應(yīng)用提供依據(jù)相比中藥材，維吾爾藥材來源更為復(fù)雜，在長期的用藥過程中由于翻譯錯(cuò)誤、鑒定錯(cuò)誤、代用混用等原因，藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)整體偏低，藥材監(jiān)管難度大[8]，諸多維吾爾藥材的來源無法追溯，考證難度較大。本研究所收集的藥材桑葚主要來源于維吾爾醫(yī)藥市場，鑒定結(jié)果表明，市場中的藥材包括桑、韃靼桑和黑桑，黑桑與桑屬于不同的藥材種類，藥效藥性也存在差異，長期誤用混用不僅影響了維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)威性，也造成了潛在的用藥安全隱患。DNA條形碼技術(shù)可以追溯藥材的基原，快速準(zhǔn)確的鑒定維吾爾藥材，在今后藥材來源、標(biāo)準(zhǔn)制定、藥材流通和市場管理等實(shí)際應(yīng)用中具有重要的價(jià)值。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]endprint