通脈方中異黃酮類化合物在人源腸Caco2細(xì)胞模型的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)

王付榮++楊秀偉

[摘要]通脈方是由葛根、丹參和川芎3味藥按質(zhì)量1∶1∶1組成的復(fù)方。該文研究通脈方中異黃酮類化合物大豆苷元、芒柄花素、5羥基芒柄花苷、芒柄花苷、大豆苷、3′甲氧基葛根素、染料木苷、葛根素、芒柄花素8CβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷、芒柄花素7OβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷、澳白檀苷、葛花寧、大豆苷元7，4′二OβD吡喃葡萄糖苷、泰國(guó)野葛根素、3′羥基葛根素、3′甲氧基大豆苷、芒柄花素8CβD吡喃木糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷、染料木素8CβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷、染料木素7OβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷、3′羥基泰國(guó)野葛根素、6″OβD木糖基葛根素、鷹嘴豆芽素A8CβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷、3′甲氧基大豆苷元7，4′二OβD吡喃葡萄糖苷、大豆苷元7OβD吡喃葡萄糖基（1→4）OβD吡喃葡萄糖苷和大豆苷元7OαD吡喃葡萄糖基（1→4）OβD吡喃葡萄糖苷在腸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。采用人源腸Caco2細(xì)胞單層模型，研究通脈方中上述25個(gè)異黃酮類化合物由絨毛面（AP側(cè)）到基底面（BL側(cè)）或從BL側(cè)到AP側(cè)2個(gè)方向的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。應(yīng)用高效液相色譜法分離、紫外檢測(cè)法對(duì)化合物進(jìn)行定量分析，計(jì)算表觀滲透系數(shù)（Papp），并與陽(yáng)性對(duì)照藥普萘洛爾和阿替洛爾比較。大豆苷元和芒柄花素由AP側(cè)到BL側(cè)的Papp分別為（255±003）×10-5，（306±001）×10-5 cm·s-1；由BL側(cè)到AP側(cè)的Papp分別為（262±0）×10-5，（265±011）×10-5 cm·s-1。與本試驗(yàn)中在Caco2細(xì)胞單層模型上呈良好吸收的陽(yáng)性對(duì)照藥普萘洛爾的Papp（266±032）×10-5 cm·s-1和呈難吸收的陽(yáng)性對(duì)照藥阿替洛爾的Papp（234±010）×10-7 cm·s-1比較，大豆苷元和芒柄花素與普萘洛爾在同一數(shù)量級(jí)；其他化合物與阿替洛爾在同一數(shù)量級(jí)。大豆苷元和芒柄花素的Papp AP→BL/Papp BL→AP分別為097，115?？梢灶A(yù)測(cè)，大豆苷元和芒柄花素可以通過(guò)小腸上皮細(xì)胞被動(dòng)吸收進(jìn)入體內(nèi)，屬于良好吸收的化合物；其他化合物屬于吸收不良的化合物。5羥基芒柄花苷、染料木苷、澳白檀苷、葛花寧和染料木素7OβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷的Papp AP→BL/Papp BL→AP分別為018，028，045，038，049，推測(cè)它們?cè)贑aco2細(xì)胞單層模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)可能存在外流機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]Caco2細(xì)胞單層模型；通脈方；異黃酮；大豆苷元；芒柄花素；腸吸收；表觀滲透系數(shù)

Absorption and transport of isoflavonoid compounds from Tongmai

formula across human intestinal epithelial （Caco2） cells in vitro

WANG Furong， YANG Xiuwei*

（State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs， Department of Natural Medicines，

School of Pharmaceutical Sciences， Peking University， Beijing 100191， China）

[Abstract]Tongmai formula （TMF） is a drug combination of three components including Puerariae Lobatae Radix [roots of Pueraria lobata]， Salviae Miltiorrhizae Radix （roots of Salvia miltiorrhiza） and Chuanxiong Rhizoma （rhizomes of Ligusticum chuanxiong） in a weight ratio of 1∶1∶1 The absorption and transport of isoflavonoid compounds from Tongmai formula across human intestinal epithelial （Caco2） cells in vitro were studied in this paper The assay isoflavonoid compounds include daidzein， formononetin， 5hydroxylononin， ononin， daidzin， 3′methoxypuerarin， genistin， puerarin， formononetin8CβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside， formononetin7OβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside， lanceolarin， kakkanin， daidzein7，4′diOβDglucopyranoside， mirificin， 3′hydroxypuerarin， 3′methoxydaidzin， formononetin8CβDxylopyranosyl（1→6）OβDglucopyranoside， genistein8CβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside， genistein7OβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside （ambocin）， 3′hydroxymirificin， 6″OβDxylosylpuerarin， biochanin A8CβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside， 3′methoxydaidzein7，4′diOβDglucopyranoside， daidzein7OβDglucopyranosyl（1→4）OβDglucopyranoside， and daidzein7OαDglucopyranosyl（1→4）OβDglucopyranoside By using human Caco2 monolayer as an intestinal epithelial cell model in vitro， the permeability of abovementioned 25 isoflavonoids in TMF were studied from the apical （AP） side to basolateral （BL） side or from the BL side to AP side The assay compounds were determined by reversed phased highperformance liquid chromatography （HPLC） coupled with UV detector Transport parameters and apparent permeability coefficients （Papp） were then calculated and and compared with those of propranolol and atenolol， which are the transcellular transport marker and as a control substance for high and poor permeability， respectively The Papp values of daidzein and formononetin were （255±003） ×10-5，（306±001） ×10-5 cm·s-1 from AP side to BL side， respectively， and （262±000） ×10-5， （265±011） ×10-5 cm·s-1 from BL side to AP side， respectively Under the condition of this experiment， the Papp value was （266±032） ×10-5 cm·s-1 for propranolol and （234±010） ×10-7 cm·s-1 for atenolol The Papp values of daidzein and formononetin were at a same magnitude with those of propranolol And the Papp values of other 23 isoflavonoid compounds were at a same magnitude with those of atenolol On the other hand， the rats of Papp AP→BL/Papp BL→AP of daidzein and formononetin on the influx transport were 097 and 115， respectively It can be predicted that daidzein and formononetin can be absorbed across intestinal epithelial cells to go to the body circulation by the passive diffusion mechanism and they were assigned to the wellabsorbed compounds Other 23 isoflavonoid compounds were assigned to the poorly absorbed compounds Because of the rats of Papp AP→BL/Papp BL→AP of 5hydroxylononin， genistin， lanceolarin， kakkanin， and genistein7OβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside were 018， 028， 045， 038， 049， they may have been involved in the efflux mechanism in Caco2 cells monolayer model from the BL side to AP side directionendprint

[Key words]Caco2 monolayer model； Tongmai formula； isoflavonoid； daidzein； formononetin； intestinal absorption； apparent permeability coefficient

由傳統(tǒng)中藥葛根Pueraria lobata （Willd） Ohwi的干燥根Puerariae Lobatae Radix，丹參Salvia miltiorrhiza Bge 的干燥根Salviae Miltiorrhizae Radix，川芎Ligusticum chuanxiong Hort 的干燥根莖Chuanxiong Rhizoma，3味中藥按質(zhì)量1∶1∶1組成的“通脈方”，其制劑有《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第4冊(cè)收載的“通脈沖劑”[1]和第20冊(cè)收載的“通脈口服液”[2]等。“通脈方”3味藥配伍能活血、行氣、升陽(yáng)，協(xié)同作用相得益彰，共奏活血通脈之功效。為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)其水提取物進(jìn)行了化學(xué)成分研究[34]和定量分析[5]及人腸內(nèi)菌生物轉(zhuǎn)化[6]?？诜兴?，除了調(diào)節(jié)腸內(nèi)微生態(tài)作用的藥物外，為了使發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的化學(xué)成分能夠到達(dá)靶器官，必須有足夠量的藥物分子從胃腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)。因此，在中藥有效成分[7]和有毒成分[8]研究過(guò)程中，其腸吸收研究是一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。本文采用國(guó)際上公認(rèn)的人腸Caco2細(xì)胞單層模型[9]，研究通脈方中主要成分異黃酮類化合物[5]的腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。

1材料

11藥品和試劑

受試異黃酮類化合物從通脈方中分離純化得到，高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器（HPLCDAD）面積歸一化法測(cè)定純度>98%，分別為大豆苷元（daidzein，1）、芒柄花素（formononetin，2）、5羥基芒柄花苷（5hydroxylononin，3）、芒柄花苷（ononin，4）、大豆苷（daidzin，5）、3′甲氧基葛根素（3′methoxypuerarin，6）、染料木苷（genistin，7）、葛根素（puerarin，8）、芒柄花素8CβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷[formononetin8CβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside，9]、芒柄花素7OβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷[formononetin7OβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside，10]、澳白檀苷（lanceolarin，11）、葛花寧（kakkanin，12）、大豆苷元7，4′二O吡喃葡萄糖苷（daidzein7，4′diOglucopyranoside，13）、泰國(guó)野葛根素（mirificin，14）、3′羥基葛根素（3′hydroxypuerarin，15）、3′甲氧基大豆苷（3′methoxydaidzin，16）、芒柄花素8CβD吡喃木糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷[formononetin8CβDxylopyranosyl（1→6）OβDglucopyranoside，17]、染料木素8CβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷[genistein8CβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside，18]、染料木素7OβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷[genistein7OβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside；ambocin，19]、3′羥基泰國(guó)野葛根素（3′hydroxymirificin，20）、6″OβD木糖基葛根素（6″OβDxylosylpuerarin，21）[4]、鷹嘴豆芽素A8CβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷[biochanin A8CβDapiofuranosyl（1→6）OβDglucopyranoside，22]、3′甲氧基大豆苷元7，4′二OβD吡喃葡萄糖苷（3′methoxydaidzein7，4′diOβDglucopyranoside，23）、大豆苷元7OβD吡喃葡萄糖基（1→4）OβD吡喃葡萄糖苷[daidzein7OβDglucopyranosyl（1→4）OβDglucopyranoside，24]、大豆苷元7OαD吡喃葡萄糖基（1→4）OβD吡喃葡萄糖苷[daidzein7OαDglucopyranosyl（1→4）OβDglucopyranoside，25][3]，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

12孔聚碳酯膜Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板（聚碳酯膜直徑12 mm，面積113 cm2，孔徑30 μm），15，50 mL塑料離心管、25，75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning Costar，Cambridge，MA，USA）。

DMEM培養(yǎng)基（dulbecco′s modified eagle medium）、MEM培養(yǎng)基（eagle′s minimum essential medium）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Hank′s緩沖溶液（Hank′s banlanced salt solution，HBSS）和羥乙基哌嗪乙磺酸（N2hydroxyethyl piperazineN′2ethanesulfonic acid，HEPES）購(gòu)自北京賽爾曼生物公司；胰蛋白酶（trypsin）購(gòu)自北京華美生物工程公司；青霉素（penicillin）和鏈霉素（streptomycin）購(gòu)自華北制藥集團(tuán)；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、普萘洛爾（propranolol，純度>98%）、阿替洛爾（atenolol，純度>98%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（批號(hào)20070627）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Na2CO3、D（+）葡萄糖、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）和冰醋酸購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；色譜純甲醇和乙腈購(gòu)自天津市西華特種試劑廠。endprint

人腸Caco2細(xì)胞株（ATCC #HTB37）購(gòu)自American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA。

12儀器

上皮細(xì)胞電阻儀（EVON，World Precision Instruments，Sarasota，F(xiàn)L，USA）、JJT1300型超凈工作臺(tái)（北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化公司）、GALAXY B型CO2氣體培養(yǎng)箱（英國(guó)RS Biotech公司）、TDL5A型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、MVS1渦旋混合器（北京金北德工貿(mào)有限公司）、PHS25型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、座式蒸汽壓力滅菌鍋（上海龍杰機(jī)械裝備有限公司）、XDS1倒置顯微鏡（重慶光電儀器總公司）、HZSH型恒溫水浴振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

Dionex HPLC儀系統(tǒng)（DIONEX Co，München，德國(guó)）：Dionex P680型泵、UVD170U型檢測(cè)器、Chromeleon version 650數(shù)據(jù)處理工作站；Dikma DiamonsilTM C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），偶聯(lián)Dikma EasyGuard C18保護(hù)柱（46 mm×250 mm）。

2方法

21細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)

211培養(yǎng)液和緩沖溶液的配制

培養(yǎng)液和緩沖溶液的配制同前期文獻(xiàn)報(bào)道[10]。

212細(xì)胞培養(yǎng)和種板

取復(fù)蘇凍存的第33代Caco2細(xì)胞置裝有DMEM20培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2，相對(duì)濕度90%）中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。以DMEM20培養(yǎng)2代，待細(xì)胞生長(zhǎng)速度正常后轉(zhuǎn)為DMEM15培養(yǎng)液培養(yǎng)1代，再轉(zhuǎn)為DMEM10培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。復(fù)蘇后的Caco2細(xì)胞以DMEM10培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)的第1天和第3天換液，若第4天細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)到50%亦需換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)到80%時(shí)，以001% EDTA/PBS，025%胰蛋白酶消化、傳代，傳代比例為1∶4。細(xì)胞傳代后，用完全DMEM10培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞使其終濃度為625 ×104個(gè)細(xì)胞/孔。向孔板的底室（basolateral chamber，BL）加入完全DMEM10培養(yǎng)液（無(wú)細(xì)胞）15 mL，向孔板的頂室（apical chamber，AP）加入已充分混合的細(xì)胞懸液05 mL，種板完成。在細(xì)胞生長(zhǎng)的第1～8天，奇數(shù)天更換AP室和BL室培養(yǎng)液，分別為05，15 mL，偶數(shù)天不更換培養(yǎng)液；在第9～16天，奇數(shù)天更換雙室培養(yǎng)液，偶數(shù)天只更換AP室培養(yǎng)液05 mL；第17天以后每天更換雙室培養(yǎng)液，至培養(yǎng)的第21天，此時(shí)細(xì)胞單層可以用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)用Caco2細(xì)胞代數(shù)為40～60代。

213Caco2細(xì)胞單層完整性與轉(zhuǎn)運(yùn)能力試驗(yàn)

2131測(cè)定跨上皮細(xì)胞電阻按標(biāo)準(zhǔn)操作程序[9]，用電阻儀測(cè)定Transwell中的Caco2細(xì)胞單層兩端的電阻值，若大于500 Ω·cm-2，則表明其具有足夠的緊密連接和完整性，可用來(lái)進(jìn)行藥物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)中選用電阻值大于500 Ω·cm-2的細(xì)胞單層用于實(shí)驗(yàn)。

2132測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化合物的表觀滲透系數(shù)來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞單層的完整性和轉(zhuǎn)運(yùn)能力選擇國(guó)際上公認(rèn)的、在Caco2細(xì)胞單層吸收性良好的普萘洛爾[表觀滲透系數(shù)（Papp）在1×10-5 cm·s-1數(shù)量級(jí)]和吸收性不良的阿替洛爾（Papp在1×10-7 cm·s-1數(shù)量級(jí)或以下）作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。在Transwell的AP端加入01 mmol·L-1普萘洛爾或1 mmol·L-1阿替洛爾的HBSS溶液05 mL，BL端加入15 mL HBSS溶液，于37 ℃水浴振搖溫育1 h，收集BL端溶液，HPLC法測(cè)定透膜藥物量，計(jì)算Papp。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得普萘洛爾Papp為（266±032）

×10-5 cm·s-1，阿替洛爾Papp為（234±010）×10-7cm·s-1。與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，證明Caco2細(xì)胞單層具有良好的完整性與轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

2133應(yīng)用堿性磷酸酶（AKP）試劑盒監(jiān)測(cè)細(xì)胞單層中堿性磷酸酶來(lái)驗(yàn)證細(xì)胞單層的完整性和轉(zhuǎn)運(yùn)能力Caco2細(xì)胞分別在培養(yǎng)的第4，8，12，16，20天用HBSS緩沖液洗細(xì)胞單層2次，用含鈣10 mmol·L-1、鎂05 mmol·L-1和05% Triton100的磷酸緩沖液（PBS）溶解細(xì)胞，置冰浴上1 h，12 000×g離心10 min，取上清液，按Lowry法[11]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。使用AKP試劑盒，按說(shuō)明書方法測(cè)定AKP活性。符合要求后，方能進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。Caco2細(xì)胞在接種第4天，細(xì)胞未完全匯合，不能水解AKP底物對(duì)硝基苯磷酸鹽生成對(duì)硝基苯酚，顯示Caco2細(xì)胞沒有AKP活性。接種第16天的細(xì)胞完全匯合，可水解對(duì)硝基苯磷酸鹽生成對(duì)硝基苯酚，具有AKP活性，顯示Caco2細(xì)胞分化已基本完成[9]。

214受試樣品溶液的配制

精密稱取待測(cè)化合物，用適量體積的DMSO溶解，配制成10 mmol·L-1濃度的儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱中保存，備用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用HBSS（pH 735）緩沖鹽溶液稀釋并配制成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度。

215受試化合物穩(wěn)定性考察

配制濃度為500 μmol·L-1的受試化合物溶液，于37 ℃水浴搖床上溫育90 min，取出后冷凍干燥，-20 ℃冰箱中保存，待處理。

216攝取轉(zhuǎn)運(yùn)和外流試驗(yàn)

測(cè)定培養(yǎng)第19～21天的細(xì)胞單層的跨膜電阻，選取跨膜電阻大于500 Ω·cm-2的Caco2細(xì)胞單層用于實(shí)驗(yàn)。用37 ℃的HBSS緩沖溶液洗滌AP端和BL端3次，棄去前2次的洗滌液。第3次洗后在37 ℃水浴上溫育30 min，再次測(cè)定跨膜電阻。吸走兩端的HBSS緩沖溶液，保存，備用。endprint

分別在細(xì)胞單層兩側(cè)加入受試化合物和HBSS溶液（AP側(cè)05 mL，BL側(cè)15 mL）。細(xì)胞單層AP側(cè)給藥、BL側(cè)取樣分析，為吸收轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)；BL側(cè)給藥、AP側(cè)取樣分析，為外流轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。每實(shí)驗(yàn)點(diǎn)為獨(dú)立的4個(gè)孔。

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配制一定濃度受試化合物的HBSS溶液，于恒溫?fù)u床上37 ℃，50 r·min-1溫育。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)分別收集一定體積的給藥側(cè)和接收側(cè)溶液（AP側(cè)045 mL，BL側(cè)130 mL），冷凍干燥，-20 ℃冰箱中保存，待處理。

217細(xì)胞攝入試驗(yàn)

216項(xiàng)取樣全部結(jié)束后，小心移走transwell中的溶液，以冷的HBSS溶液洗滌3次，放置在-20 ℃冷凍保存，1 d后取出放置融化，如此重復(fù)凍融3次，將細(xì)胞附著的聚碳酯膜取出，置于02 mL 70%甲醇中，渦旋混勻后超聲溶解20 min，再15 000×g離心10 min，取上清液，即得細(xì)胞攝入分析樣品。

218分析樣品處理

經(jīng)Caco2細(xì)胞單層試驗(yàn)后收集的樣品經(jīng)冷凍干燥，定量加入甲醇，渦旋混勻后超聲溶解20 min，15 000 ×g離心10 min，取上清液，備用。

219HPLC條件的建立

2191流動(dòng)相的選擇探討甲醇水、乙腈水、甲醇水冰醋酸、乙腈水冰醋酸等流動(dòng)相條件，根據(jù)待測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)、DAD紫外吸收光譜并結(jié)合文獻(xiàn)，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

2192方法學(xué)考察標(biāo)準(zhǔn)曲線：取待測(cè)化合物的儲(chǔ)備液，用最后1次洗滌Caco2細(xì)胞單層的HBSS將其配制成一系列濃度梯度的對(duì)照品溶液。冷凍干燥，按照各對(duì)照品溶液的原濃度，定量加入甲醇渦旋后超聲溶解，15 000×g離心10 min，取上清液，進(jìn)樣HPLC系統(tǒng)20 μL，以對(duì)照品摩爾濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。精密度、準(zhǔn)確度：從精密度、準(zhǔn)確度等方面考察分析方法。配制高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)照品溶液，在1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣分析3次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天進(jìn)樣1次，考察日間精密度。

22Papp計(jì)算和數(shù)據(jù)處理

受試化合物在Caco2細(xì)胞單層模型中的Papp按下式計(jì)算。

Papp=dQdt×1A×1C0

式中Papp單位cm·s-1；Q是累積轉(zhuǎn)運(yùn)量（cumulative amount of transport），代表化合物在接收端（receiver）出現(xiàn)的總量，單位μmol；dQ/dt是速率，單位μmol·s-1；C0是化合物在給藥端（donor）的初始濃度，單位μmol·cm-3 （即mmol·L-1）；A是聚碳酯膜的表面積，單位cm2。

每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)為獨(dú)立4孔的平均值，用±s表示。

3結(jié)果

31受試化合物HPLC分析方法的建立

HPLCDAD在線分析表明，受試25個(gè)異黃酮類化合物在250 nm均有較強(qiáng)的吸收，因此，所有受試化合物在該檢測(cè)波長(zhǎng)下檢測(cè)。在本實(shí)驗(yàn)儀器和色譜柱條件下，篩選了甲醇和乙腈配比水冰醋酸作為流動(dòng)相體系，結(jié)果甲醇水冰醋酸體系可使所有受試化合物在11 min內(nèi)分析完成，峰型對(duì)稱。流動(dòng)相比例，化合物1，3，4，11，12，22為60∶40∶03；化合物2為72∶28∶03；化合物5為44∶56∶03；化合物6，8，15，20，21為35∶65∶03；化合物7為55∶45∶03；化合物9，10為50∶50∶03；化合物13，23為30∶70∶03；化合物14為38∶62∶03；化合物16，17，18，19，24為45∶55∶03；化合物25為42∶58∶03。

取各化合物的儲(chǔ)備液，用最后1次洗滌Caco2細(xì)胞單層的HBSS將其分別配制成04，20，10，50，100，200，400 μmol·L-1的對(duì)照品溶液，冷凍干燥，按照各對(duì)照品溶液的原濃度定量加入甲醇渦旋后超聲溶解，15 000 × g離心10 min，取上清液，在上述色譜條件下進(jìn)樣20 μL，以對(duì)照品摩爾濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r）在0999 5及以上；所有25個(gè)化合物的線性范圍為04～400 μmol·L-1。

25個(gè)化合物在高（200 μmol·L-1）、中（50 μmol·L-1）、低（10 μmol·L-1）濃度的日內(nèi)和日間精密度RSD分別為041～31，068～51；日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度分別為9482%～1172%，8996%～1179%。

32原形化合物回收率和細(xì)胞蓄積

為考察雙向轉(zhuǎn)運(yùn)前后原形化合物的數(shù)量變化情況，確保測(cè)定的Papp準(zhǔn)確可靠，對(duì)化合物進(jìn)行了回收率試驗(yàn)。回收率是指在轉(zhuǎn)運(yùn)某一時(shí)間點(diǎn)，測(cè)得的AP端和BL端培養(yǎng)液中的原形化合物總量占轉(zhuǎn)運(yùn)初始時(shí)原形化合物給藥量的百分率。結(jié)果表明，25個(gè)化合物從AP端到BL端和從BL端到AP端轉(zhuǎn)運(yùn)的回收率分別為8919%～1018%，8433%～1004%。從結(jié)果可以看出，25個(gè)異黃酮類化合物的原形回收率均較高，表明其在Caco2細(xì)胞中的蓄積量皆極少，同時(shí)表明該類化合物穩(wěn)定性較好，不易被Caco2細(xì)胞代謝，適合采用Caco2細(xì)胞模型進(jìn)行腸吸收研究。

33受試化合物的穩(wěn)定性

將受試化合物溶解在HBSS緩沖液或100 ℃滅火的Caco2細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37 ℃水浴搖床上溫育180 min，或取出冷凍干燥后在-20 ℃冰箱中保存24 h，或經(jīng)凍融循環(huán)，然后按218項(xiàng)方法制備分析樣品，經(jīng)HPLCDAD分析，結(jié)果表明受試化合物穩(wěn)定性良好。

34攝取轉(zhuǎn)運(yùn)和外流試驗(yàn)

AP側(cè)或BL側(cè)給予受試樣品溶液，各化合物的給予濃度皆為500 μmol·L-1，溫育90 min后，分別定量吸取給藥側(cè)和接收側(cè)液，HPLC進(jìn)樣分析，計(jì)算Papp，見表1。endprint

4討論

通過(guò)對(duì)通脈方中化學(xué)成分的LCMS（liquid chromatographytandem mass spectrometry）分析[5]，確認(rèn)本文受試的25個(gè)異黃酮類化合物均來(lái)源于通脈方中的葛根。

由表1結(jié)果可知，受試的25個(gè)異黃酮類化合物中，大豆苷元（1）和芒柄花素（2）的Papp由AP側(cè)到BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)分別為（255±003）×10-5，（306±001）×10-5 cm·s-1；由BL側(cè)到AP側(cè)反流分別為（262±0）×10-5，（265±011）×10-5 cm·s-1。在本實(shí)驗(yàn)條件下，吸收轉(zhuǎn)運(yùn)良好的陽(yáng)性對(duì)照藥普萘洛爾由AP側(cè)到BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp為（266±032）×10-5 cm·s-1，它們同處于10×10-5 cm·s-1數(shù)量級(jí)，判斷1和2屬于吸收良好的化合物，根據(jù)其PappAP→BL/PappBL→AP的比值分別為115，097，都接近于1，推測(cè)其吸收的主要?jiǎng)恿?lái)源于膜兩側(cè)的濃度差，為被動(dòng)擴(kuò)散[9]。在受試的25個(gè)化合物中，1和2是苷元，吸收轉(zhuǎn)運(yùn)好于苷，吸收轉(zhuǎn)運(yùn)效果相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，提示苷元中引入糖基大大降低其吸收轉(zhuǎn)運(yùn)率。

其他23個(gè)異黃酮苷類化合物的Papp與在本實(shí)驗(yàn)條件下吸收不良的陽(yáng)性對(duì)照藥阿替洛爾的Papp （234±010）×10-7 cm·s-1同處于10×10-7 cm·s-1數(shù)量級(jí)，判斷這23個(gè)異黃酮苷類化合物都屬于吸收不良的化合物[9]。從PappAP→BL/PappBL→AP的比值看，5羥基芒柄花苷（3）染料木苷（7）、澳白檀苷（11）、葛花寧（12）和染料木素7OβD呋喃芹糖基（1→6）OβD吡喃葡萄糖苷（19）分別為018，028，045，038，049，提示在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中可能存在外流機(jī)制，有外排載體參與，其中3的外排現(xiàn)象最明顯。

化學(xué)結(jié)構(gòu)上形成明顯對(duì)比的，化合物5（大豆苷）是1的7OβD吡喃葡萄糖苷，其Papp與苷元1的相比降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)；化合物4（芒柄花苷）是2的7OβD吡喃葡萄糖苷，其Papp與苷元2的相比亦降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)?；衔?（葛根素）是1的8CβD吡喃葡萄糖苷，其Papp與苷元1的相比亦降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)，這解釋了8口服生物利用度低而研制出葛根素注射液的原因；化合物21（6″OD木糖基葛根素）是1的8C雙糖苷，其Papp與苷元1的相比降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)。化合物3，7，11，12，19的共同特征是母核A環(huán)的C5位上均具有羥基，并且C7位上的羥基均被糖苷化，它們的Papp均在10×10-7 cm·s-1數(shù)量級(jí)。苷化大大增高了化合物的親水性，使其在腸的吸收性大大降低。

對(duì)比異黃酮母核A環(huán)C5位上具有羥基、C7位羥基未被糖苷化、但C8位C葡萄糖苷化的異黃酮苷18，20，22，它們的PappAP→BL/PappBL→AP分別為107，185，076，總體上以從AP側(cè)到BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)為主導(dǎo)趨勢(shì)。母核C5位具有羥基、7O糖苷化、C8和C3′無(wú)取代、C4′具有羥基或甲氧基取代的化合物3，7，11，12，19皆有外排現(xiàn)象，而C4′甲氧基取代者（3，11）比相應(yīng)的羥基取代者（7，19）外排更明顯。由此可初步推斷：異黃酮類化合物具有C5羥基、且C7位羥基被糖苷化，可能是轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中外排機(jī)制的主要原因。

盡管苷類化合物與其苷元相比更難吸收，但苷類化合物一般為“前藥”[12]，在腸內(nèi)細(xì)菌的作用下可轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元，如大豆苷轉(zhuǎn)化為大豆苷元、芒柄花苷轉(zhuǎn)化為芒柄花素、染料木苷轉(zhuǎn)化為染料木素（genistein）[6]；盡管通脈方中的主要異黃酮類化合物為其苷[35]，原形化合物難以吸收，但這些苷類化合物在腸內(nèi)細(xì)菌作用下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的苷元[13]，將大大提高這些苷類化合物的生物利用度。本研究為合理應(yīng)用通脈方、確定其物質(zhì)基礎(chǔ)并據(jù)此制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[13]提供了科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑.第4冊(cè)[S] 1991：169

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑.第20冊(cè)[S] 1991：302

[3]Wang F R， Yang X W， Zhang Y， et al Three new isoflavone glycosides from Tongmai granules[J] J Asian Nat Prod Res， 2011， 13（4）：319

[4]王付榮， 葛喜珍 通脈方化學(xué)成分[J] 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011， 17（20）：61

[5]Wang F R， Zhang Y， Yang X B， et al Rapid determination of 30 polyphenols in Tongmai formula， a combination of Puerariae Lobatae Radix， Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， and Chuanxiong Rhizoma， via liquid chromatographytandem mass spectrometry[J] Molecules， 2017， 22（4）：545

[6]吳帥， 徐嵬， 楊秀偉 人源腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化通脈方的化學(xué)研究[J] 中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（20）：3510

[7]楊秀偉 基于體內(nèi)過(guò)程的中藥有效成分和有效效應(yīng)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)策略[J] 中國(guó)中藥雜志， 2007， 32（5）：365

[8]楊秀偉 基于體內(nèi)過(guò)程的中藥毒性成分和毒性效應(yīng)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)策略[J] 中華中醫(yī)藥雜志， 2007， 22（2）：67

[9]楊秀偉， 楊曉達(dá)， 王瑩， 等 中藥化學(xué)成分腸吸收研究中Caco2細(xì)胞模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的建立[J] 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)， 2007， 5（6）：633

[10]馬蓮， 楊秀偉 黃連堿和小檗紅堿在人源Caco2細(xì)胞單層模型中的吸收研究[J] 中國(guó)中藥雜志， 2007， 32（24）：2523

[11]Lowry O H， Rosebrough N J， Fan A L， et al Protein measurement with the Folin phenol reagent[J] J Biol Chem， 1951， 193（1）：265

[12]楊秀偉 中草藥化學(xué)成分的研究 [J] 中草藥， 2007， 38（7）：961

[13]楊秀偉 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥繼承、發(fā)展、創(chuàng)新的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題[J] 中國(guó)中藥雜志， 2015， 40（17）：3429

[責(zé)任編輯張燕]endprint