豆科植物中異黃酮類化合物生物合成的研究進(jìn)展

王秋媛，姜 蘭，范成林

(1.安順市農(nóng)業(yè)委員會，貴州 西秀 561000，2.貴州省安順市西秀區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴州 西秀 561000)

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豆科植物中異黃酮類化合物生物合成的研究進(jìn)展

王秋媛，姜 蘭，范成林*

(1.安順市農(nóng)業(yè)委員會，貴州 西秀 561000，2.貴州省安順市西秀區(qū)農(nóng)業(yè)局，貴州 西秀 561000)

異黃酮是一類主要在豆科植物中合成的次級代謝產(chǎn)物，鑒于異黃酮類化合物在維持人類和植物健康的過程中發(fā)揮的重要作用，人們不約而同地把研究的重點(diǎn)集中于異黃酮的藥理分析及其合成途徑中來。異黃酮合成的前體為丙苯氨酸，通過苯丙氨酸途徑合成最后以葡糖基化和丙二酰糖基化的衍生物形式貯存于液泡中，為方便在未來的研究，介紹了植物異黃酮及其相關(guān)衍生物合成途徑的最新研究進(jìn)展。

異黃酮；豆科植物；合成途徑

異黃酮是一類只能在豆科植物天然合成的次級代謝產(chǎn)物，包括大豆苷元、染料木黃酮、黃豆黃素，以及經(jīng)過生物體的糖基化、丙二?；庸ど傻难苌锶绫４蠖裹S甙、丙二酰燃料木甙、丙二酰黃豆黃甙、葛根素等9種異黃酮類物質(zhì)[1-4]。異黃酮在豆科植物與微生物相互作用的過程中發(fā)揮了重要的作用，它可以促進(jìn)豆科作物的根與根瘤菌的結(jié)合，誘導(dǎo)根瘤的形成，提高豆科植物固氮的能力；又能充當(dāng)植物抗病毒素，抵抗真菌的浸染[1]。異黃酮是一類結(jié)構(gòu)與雌性激素相似的化合物，能產(chǎn)生類似雌性激素類似的效應(yīng)[5]，被人們喻植物雌性激素。研究表明，異黃酮能夠提高人類的抗氧化能力，有利于人們永葆青春、健康長壽；有助于預(yù)防或者緩解目前高發(fā)的中老年人心血管疾病；能夠在一定程度上治療一些婦科疾病，緩解絕經(jīng)期女人狀骨質(zhì)疏松的癥狀等[6]。通過體外試驗(yàn)和流行病學(xué)研究表明，攝入一定量的異黃酮對與激素相關(guān)的癌癥(乳腺癌、前列腺癌)有廣泛的防治作用[7-9]，一個延續(xù)了兩年的試驗(yàn)表明，補(bǔ)充異黃酮類化合物，對絕經(jīng)前期女性的乳腺密度沒有影響，但是能有效防止絕經(jīng)后期女性乳腺增生[10]。異黃酮能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而抑制癌變細(xì)胞(如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、白血病及淋巴癌細(xì)胞)的無限增殖[11-16]。此外，食用富含異黃酮的食物能夠有效降低肺癌、乳腺癌、前列腺癌、直腸癌以及心血管疾病的發(fā)生[17]。異黃酮類化合物在促進(jìn)人類身體健康以及能夠防治很多疾病的這種特性引起了藥物學(xué)家和生物科學(xué)家極大的興趣，人們不約而同地把目光投向異黃酮類化合物的生物合成途徑的研究上來，希望通過基因/代謝工程提高豆科植物合成異黃酮類化合物的能力，或通過基因改造使非豆科植物也能合成異黃酮類化合物，以進(jìn)一步滿足人類健康生活對異黃酮類化合物的需求。

1 異黃酮的合成途徑

合成異黃酮的前體為苯丙氨酸，通過苯丙氨酸途徑合成最后以葡糖基化和丙二酰糖基化的衍生物形式貯存于液泡中[18]。作為苯丙氨酸途徑的一個分支，異黃酮與類黃酮合成的上游途徑相同相同，如分別在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮還原酶(CHR)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)等酶的催化作用下將芳香族化合L-物苯丙氨酸[19]，在下游途徑中，異黃酮由4,5,7-三羥基黃烷酮/甘草黃素分別在異黃酮合成酶(IFS)和二羥基異黃烷酮還原酶(HID)的作用下催化合成，最后經(jīng)過一系列的羥基化、甲基化和糖基化作用修飾，運(yùn)輸儲存在液泡中[20](圖1)。.大豆苷元(1)、染料木素(2)和黃豆黃素(3)三種主要的異黃酮類化合物的合成途徑不盡相同。大豆苷元首先在查耳酮合成酶(chalcone synthase, CHS)的催化作用下合成查耳酮，然后產(chǎn)生分支，繼而同大多數(shù)植物一樣，一部分查耳酮由查耳酮還原酶摧花合成甘草黃素，最后由豆科植物中特異存在的酶——異黃酮合成酶催化合成。人們對染料木素的合成途徑至今還不是十分清楚，但可以肯定的是，染料木素是以甘草素為底物合成的[21]。黃豆黃素的合成，同花青素、類黃酮的合成共享底物4,5,7-三羥基黃烷酮，異黃酮合成酶(IFS)和黃烷酮-3-羥化酶( F3H)競爭底物4,5,7-三羥基黃烷酮合成黃豆黃素或者3-羥基黃酮(如圖1所示)。雖然這三種異黃酮類化合物的合成途徑有所不同，但是可以確定的是，無論哪一條分支途徑，最終都由異黃酮合成酶(IFS)催化甘草素發(fā)生分子內(nèi)芳基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成異黃酮[22-24]，繼而通過糖苷轉(zhuǎn)移酶等一序列酶催化反應(yīng)生成糖基化或者丙二?；a(chǎn)物貯存于細(xì)胞液泡中。在苯丙氨酸途徑合成異黃酮的過程中，存在著黃烷酮-3-羥化酶和異黃酮合成酶底物競爭的反應(yīng)，異黃酮合成酶的催化活性越強(qiáng)，反應(yīng)生成的異黃酮越多，反之異黃酮產(chǎn)物越少。所以，抑制黃烷酮-3-羥化酶的活性或者抑制其編碼基因的表達(dá)，以及促進(jìn)異黃酮合成酶在豆科植物內(nèi)超表達(dá)是提高豆科植物合成異黃酮能力的主要途徑。

圖1 苯丙氨酸途徑合成異黃酮的部分圖解，圖中列出了各種參與合成的酶、中間產(chǎn)物和本途徑中的一些分枝，虛線箭頭表示有很多反應(yīng)步驟，大箭頭表示的步驟還不甚明了。Fig.1 A partial diagram of the phenylpropanoid pathway. Intermediates and enzymes involved in isoflavone synthesis, as well as some branch pathways, are shown. Dotted arrows represent multiple steps; the block arrow represents speculative steps.

2 異黃酮合成相關(guān)的催化酶

作為苯丙氨酸代謝途徑的一個分支，異黃酮合成的上游途徑同類黃酮、花青素等色素合成的催化酶相同，如苯丙酰胺裂解酶，肉桂酸-4-羥化酶，4-香豆酸：輔酶A連接酶，查爾酮合成酶，查爾酮還原酶，查爾酮異化酶，異黃酮合成酶和2-羥基黃烷酮還原酶等。在下游途徑中，參與催化異黃酮合成的酶是異黃酮合成酶、二羥基異黃酮還原酶，以及一系列異黃酮合成后修飾的糖基化酶、乙?；?、甲基化酶等。異黃酮合成酶是豆科植物所特有的催化酶，這是其他科的植物不能自然合成異黃酮的最主要的原因。此外，黃烷酮-3-羥化酶的活性影響異黃酮的生成量，因?yàn)樵诋慄S酮(黃豆黃素)合成過程中，異黃酮合成酶(IFS)與黃烷酮-3-羥化酶同時競爭底物4,5,7-三羥基黃烷酮。在本文中，我們將主要討論豆科植物所特有的異黃酮合成酶，以及異黃酮合成后修飾的一系列糖基化、乙?；图谆?。

異黃酮合成酶，又叫二羥基異黃酮合成酶(2-HIS)，是一種屬P450細(xì)胞色素超家族CYP93C亞族的色素合成酶，異黃酮合成酶苯丙氨酸代謝途徑分支中催化合成異黃酮的第一個關(guān)鍵酶，在豆科植物異黃酮類合成過程中發(fā)揮了不可替代的作用。異黃酮合成酶在異黃酮合成過程中催化甘草黃素/4,5,7-三羥基黃烷酮分子內(nèi)原子重新排列，生成2.4.7-三羥基異黃酮/2,4,5,7-四羥基異黃酮(如圖2)，這一反映過程中需要NADPH+和分子氧的參與，并且是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上完成的[25]。Jung等首次在大豆及其他種類的豆科植物中獲得了兩種不同的類型的異黃酮合成酶編碼基因，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在擬南芥中合成異黃酮類化合物[24]。此外，tian等在很多能積累黃酮類或者花青素等但不能合成異黃酮的非豆科植物如煙草和擬南芥中轉(zhuǎn)入異黃酮合成酶基因，能夠在這些植物的相應(yīng)起器官中檢測到異黃酮的積累[26]。到目前為止，人們已經(jīng)從17種豆科植物中分離識別了28種異黃酮合成酶相關(guān)基因編碼的氨基酸序列，這些氨基酸序列的相似度性達(dá)到95%以上(斯圖加特大學(xué)P450工程數(shù)據(jù)庫，http://www.cyped.uni-stuttgart.de)，其中包括來自三葉草(Trifolium repens)的IFS2基因[27]、野葛(Pueraria montana var. lobat)[28]和泰國葛根(Pueraria candolleivar. mirific)的IFS基因[29]等。

二羥基異黃烷酮還原酶，是異黃酮生物合成的最后一個關(guān)鍵酶，催化2,4,7-三羥基異黃酮/2,4,5,7-四羥基黃烷酮在自然條件下或者在2-羥基異黃酮還原酶的催化下脫水生成異黃酮(如圖2)[30]。二羥基異黃烷酮還原酶是一種分子質(zhì)量為38kDa，等電點(diǎn)pH為5.1，最佳活性pH值為6.8的單鏈催化酶[31]。Akashi等分別克隆獲得了刺甘草和大豆的二羥基異黃烷酮還原酶(HID)的cDNA，酶活動力學(xué)試驗(yàn)表明，刺甘草HID只能催化還原2,7-二羥基-4-甲氧基異黃烷酮，二大豆HID既能催化4’-羥基-2-羥基異黃烷酮，又能催化4’-甲氧基-2-羥基異黃烷酮還原反應(yīng)生成異黃酮[30]。

異黃酮合成后修飾的相關(guān)酶，異黃酮合成之后，經(jīng)過一系列糖基化、乙?；?、甲基化酶的修飾后儲存在液泡中。參與異黃酮合成后修飾相關(guān)酶相關(guān)的研究至今開展的還不多，He等利用EST數(shù)據(jù)庫，通過race技術(shù)獲得了15個糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)編碼基因的序列，生物信息學(xué)軟件翻譯后的蛋白質(zhì)序列比對分析表明，這些基因的活性中心(UDP-結(jié)合中心)位于多肽序列的碳端，序列間的相似度在22%-80%之間。同擬南芥UGTs基因序列的進(jìn)化分析表明，這15個基因中的11個基因可劃分到擬南芥UGTs的兩個類群中，其中5個基因可劃到D類，另外6個可劃到E類[28]。Wang等利用轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了22個UDP-糖基轉(zhuǎn)化酶和45個氧甲基轉(zhuǎn)化酶基因的unigene，這些基因可能與異黃酮后期修飾有關(guān)[20]。

圖2 異黃酮合成酶、2-羥基異黃烷酮還原酶作用示意圖Fig.2 Catalyze function verifying of isoflavone synthase and 2-hydroxyyisoflavanone dehydratase in isoflavone biosynthesis pathway

3 異黃酮在細(xì)胞中的合成部位及其運(yùn)輸

異黃酮主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，貯存于液泡中，這說明異黃酮存在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)默F(xiàn)象。除此之外，異黃酮甚至可以從一個細(xì)胞運(yùn)輸?shù)搅硪粋€細(xì)胞中。Dhaubhadel等研究顯示，大豆的種子、豆莢和葉都能合成異黃酮，但大豆合成的異黃酮主要儲存在種子和根部，而且大豆種子異黃酮的含量還受母本的影響[2]，他們的研究指出，以異黃酮合成量較高的品系作母本的雜交F1代種子異黃酮含量最高，母本自交次之，父本自交異黃酮含量最低。但涉及異黃酮運(yùn)輸?shù)幕蚣捌溥\(yùn)輸途徑至今還基本上沒有報道。

4 提高豆科植物異黃酮合成量及在非豆科植物中合成異黃酮

鑒于異黃酮重要的藥理特性，人們希望通過基因/代謝工程技術(shù)提高豆科植物異黃酮的產(chǎn)量及把相關(guān)基因等轉(zhuǎn)入非豆科植物使一些非豆科植物也能合成異黃酮類，使之滿足人們健康生活對異黃酮類的需求。

Yu等將玉米中促進(jìn)花青素積累的CI和R轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入大豆中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株總異黃酮合成量是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏娜吨?，但是各種異黃酮成分的含量變化較大。之后，他們同時將CI、R轉(zhuǎn)錄因子和一個抑制F3H的基因轉(zhuǎn)入大豆中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株總異黃酮含量是對照株的四倍以上，且黃豆黃素的含量大為提高[3]。

Tian等構(gòu)建了一個作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的異黃酮合成酶/查爾酮異構(gòu)酶(IFS/CHI)復(fù)合酶基因并轉(zhuǎn)入酵母和煙草中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株的花瓣、葉片等積累了大量的異黃酮(黃豆黃素)，且含量高于只轉(zhuǎn)入異黃酮合成酶的植株[6]。

Chun-Hat Shih等將大豆異黃酮合成酶的cDNA轉(zhuǎn)入西紅柿，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片中含有大量的黃豆黃素，同時，西紅柿果實(shí)的表皮中也發(fā)現(xiàn)有少量黃豆黃素的積累[32]。

以上研究表明，異黃酮不僅僅只能在豆科作物中合成，在人工改造的條件下，西紅柿、煙草和擬南芥等非豆科植物也能有異黃酮類的合成，這有可能為解決某些地域的人們不能通過大量豆產(chǎn)品攝取異黃酮類的難題提供了參考。

5 展望

異黃酮是一種只能在豆科植物中自然合成的次生代謝物質(zhì)，在豆科植物與環(huán)境的作用特別是在保護(hù)植物免受病原菌的侵害以及豆科植物與固氮菌作用的過程中發(fā)揮了巨大作用。同時，攝入一定量的異黃酮，能夠在減輕女士絕經(jīng)期癥狀、抗氧化、降低中老年人骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病以及減輕癌癥的發(fā)生等方面發(fā)揮很大的作用。近年來，人們對大豆等主要農(nóng)作物異黃酮合成的途徑已經(jīng)研究得相當(dāng)深入，也通過基因/代謝工程技術(shù)改造非豆科植物使之能夠合成異黃酮方面取得了巨大的成就，但是對如葛等一些比較重要的豆科植物異黃酮合成及運(yùn)輸?shù)确矫孢€不甚了解。為了能夠獲得更多的異黃酮類物質(zhì)以滿人們健康生活的需求，在一些異黃酮積累量高的植物的異黃酮合成途徑及如何提高其異黃酮產(chǎn)量方面依然有待進(jìn)一步研究。本文簡單綜述了異黃酮合成途徑研究的一些進(jìn)展，希望對未來的相關(guān)研究有所幫助。

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The Research Advances of Isoflavonoids Biosynthesis in Legumes Plants

WANG Qiu-yuan, JIANG Lan, FAN Cheng-lin*

(1.AnshunCommissionofAgriculture,Xixiu,Guizhou561000,China，2.XixiuBureauofAgriculture,Xixiu,Guizhou561000,China)

Isoflavonoids are a class of secondary metabolism natural products predominantly synthetised in legumes plants. Because of the benefits for human and plants healths, attentions have drawn on isoflavoniods and the pathways for isoflavonoids biosynthesis, though the molecular mechanism of isoflavonoids biosynthesis is still unknown. The isoflavonoids were synthesized through phenylalanine pathway, and stored in vacuoles as glycosylation and deacetylation derivatives. In this review, provided an overview of resent advances in our understanding of biosynthesis of isoflavonoids and relative compounds, and summarize advantage ways to study the pathway and key enzymes for isoflavonoids and corresponding derivatives synthesizing for future study.

isoflavonoids; legumes plants; pathway

2016-05-05

王秋媛(1989-)，女，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。

范成林(1980-),男，高級農(nóng)藝師，農(nóng)技推廣站站長，主要從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。