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      中國11種野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的組成及含量

      2017-03-22 06:47:52嚴靜江雨樊秀彩姜建福張穎孫海生劉崇懷
      中國農業(yè)科學 2017年5期
      關鍵詞:黃烷野生種醇類

      嚴靜,江雨,樊秀彩,姜建福,張穎,孫海生,劉崇懷

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      中國11種野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的組成及含量

      嚴靜,江雨,樊秀彩,姜建福,張穎,孫海生,劉崇懷

      (中國農業(yè)科學院鄭州果樹研究所,鄭州 450009)

      【目的】探討中國野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的組成及含量的差異,為中國野生葡萄的加工利用及種質資源的評價提供依據?!痉椒ā恳宰內~葡萄、刺葡萄、華東葡萄、樺葉葡萄、毛葡萄、秋葡萄、桑葉葡萄、山葡萄、腺枝葡萄、燕山葡萄和蘡薁等11個野生種98個株系的葡萄果實為試材,以歐亞種品種‘赤霞珠’為對照,利用超高效液相色譜(UPLC)對不同野生種成熟葡萄果皮中的黃烷-3-醇類物質進行檢測分析。【結果】不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量存在較大差異,桑葉葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的含量高于對照,其余野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量低于對照,其中樺葉葡萄和變葉葡萄最低,僅為對照的64%。供試野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的組成與對照相似,均由兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯組成,并以表棓兒茶素和表兒茶素為主;這4種組成單元均可以末端單元和延伸單元的形式參與聚合黃烷-3-醇的形成。11個野生種葡萄果皮中90%以上的黃烷-3-醇類物質以聚合體的形式存在;不同野生種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度存在較大差異,其中山葡萄果皮聚合黃烷-3-醇的平均聚合度高達50,而樺葉葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度僅為25左右,而其余野生種則介于25—45。對不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇的代謝路徑分析結果表明,毛葡萄和秋葡萄果皮中黃烷-3-醇的積累更偏向于F3′5′H代謝路徑。主成分分析結果表明,不同野生種之間有一定的差異,而刺葡萄與其他野生種之間的差異更為明顯?!窘Y論】刺葡萄、樺葉葡萄、桑葉葡萄、山葡萄和腺枝葡萄均有黃烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’的株系,這些株系均可作為提高黃烷-3-醇的育種材料。此外,不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇的含量存在較大差異,這對中國野生葡萄種質資源的評價具有重要意義。

      中國野生葡萄;株系;果皮;黃烷-3-醇

      0 引言

      【研究意義】黃烷-3-醇類物質是葡萄果實中重要的次級代謝產物之一,具有諸多的生物活性,對人體健康有廣泛的藥理學作用,如清除自由基和抗氧化、抗感染、抑制動脈粥樣硬化、預防胃潰瘍與降低冠心病的風險等[1-3],葡萄皮提取物或葡萄籽提取物等保健品含有豐富的黃烷-3-醇類物質,已經成為歐美人民的日常膳食補充品[1,4]。此外,黃烷-3-醇是決定葡萄酒品質的一個重要因子,使葡萄酒呈現出一定的澀味和苦味[4-6],這種苦澀味與黃烷-3-醇類物質的結構組成[2,7-8]、聚合度及聚合過程中連鍵的方式密切相關[9-11],并且具有輔色效應和抗氧化作用,從而穩(wěn)定葡萄酒的色澤[12],黃烷-3-醇類物質還能與引起還原味的硫醇和其他硫化合物結合,從而去除還原味等不良氣味[13-14]。因此,研究中國野生葡萄果實中的黃烷-3-醇類物質的含量及組成,對于中國野生葡萄果實中黃烷-3-醇類物質的加工利用、野生葡萄種質資源評價及其在葡萄育種中的利用都具有重要意義?!厩叭搜芯窟M展】黃烷-3-醇是多酚類物質的一種,聚合的黃烷-3-醇又被稱為原花色素(Proanthocyanidins,PAs),也被稱作縮合單寧(condensed tannins),是葡萄果實中含量最為豐富的多酚類物質之一[15]。葡萄果實中黃烷-3-醇類物質的積累主要是在葡萄進入轉色期前,尤其是在葡萄果實發(fā)育的早期階段,而后伴隨著葡萄果實的成熟,其呈現下降趨勢[16-17],在葡萄果皮中常見的黃烷-3-醇結構單元有兒茶素(Catechin,C)、表兒茶素(Epicatechin,EC)、表棓兒茶素(Epigallocatechin,EGC)和表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin-3-O- gallate,ECG)4種[18];葡萄果皮中的黃烷-3-醇類物質以C、EC和EGC為主,而葡萄種子中的黃烷-3-醇類物質以EC和ECG為主[19-20],并且葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的平均聚合度顯著高于葡萄籽[21]。前人研究發(fā)現,沒食子化的黃烷-3-醇(如ECG)使得葡萄酒變得粗硬,而表棓兒茶素(EGC)則可降低這種效應,使得葡萄酒的口感變得柔和圓潤,通常將ECG等使葡萄酒口感變得粗硬的稱之為劣質單寧,而將能夠使葡萄酒產生圓潤、豐滿口感的C、EC和EGC等稱之為優(yōu)質單寧[10],相對于葡萄籽,葡萄果皮中含有相對較高的優(yōu)質單寧,對葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的分析對于釀造優(yōu)質葡萄酒具有重要意義。葡萄果實中黃烷-3-醇類物質的含量及結構組成,不僅受地域[22]、光照[23-26]、溫度[23,27]等環(huán)境條件以及整形方式[28]、套袋[29]、摘葉[30]、灌溉[31-33]等栽培管理措施的影響,與品種有更為直接的關系,基因型直接決定了黃烷-3-醇的含量及組成的差異[34-36]。Panteli?等[37]對塞爾維亞地區(qū)13個葡萄品種的葡萄果皮和種子中的酚類物質進行檢測分析發(fā)現,在葡萄果皮中的酚類物質以黃酮醇為主,而葡萄籽中的酚類物質以黃烷-3-醇類物質為主。以上述研究集中于歐亞種及其他國家的葡萄品種,對于中國野生葡萄果實中黃烷-3-醇類物質的研究相對較少。XU等[38]利用分光光度法對5個中國野生種共10個株系的葡萄果實中的黃烷-3-醇含量進行分析,山葡萄果皮中的黃烷-3-醇含量顯著高于其他所檢測的野生種,但此方法并沒有對黃烷-3-醇的結構組成進行分析;LIANG等[39]選取了刺葡萄和毛葡萄等共3個株系,利用HPLC-MS對其葡萄果皮中酚類物質如花色苷、黃酮醇、酚酸及黃烷-3-醇類物質的含量及結構組成進行了詳細分析,但選取的野生種有限,對于中國豐富的野生葡萄資源的評價利用存在一定的局限性。【本研究切入點】中國是葡萄屬植物的起源中心之一,也是葡萄屬植物遺傳資源最為豐富的國家之一[40],已知中國野生葡萄有38種、1個亞種和13個變種[41],絕大多數中國野生種葡萄果粒較小,果皮較厚且呈現紫色或紫黑色,具有釀造葡萄酒的潛質[42],小果粒的葡萄所釀葡萄酒含有更高的酚類物質,釀酒品質更好[43]。并且,葡萄果皮中富含優(yōu)質單寧,對于釀造優(yōu)質葡萄酒有著重要意義,而目前對中國野生葡萄果皮中的黃烷-3-醇類物質的研究相對較少?!緮M解決的關鍵問題】利用超高效液相色譜(UPLC)對11個中國野生葡萄種共98個株系葡萄果皮中的黃烷-3-醇類物質含量及結構組成進行檢測分析,以期為葡萄加工原料的選擇、野生葡萄果實中黃烷-3-醇類物質的開發(fā)利用及野生葡萄種質資源評價等提供參考依據。

      1 材料與方法

      試驗于2015年在國家果樹種質鄭州葡萄圃進行。

      1.1 材料與試劑

      對國家果樹種質鄭州葡萄圃的野生葡萄果皮中的黃烷-3-醇類物質進行檢測分析,在野生葡萄果實完全轉色后,每隔3 d進行葡萄果實可溶性固形物的測定,連續(xù)5次的測定結果保持不變后,進行成熟葡萄果實采集,最終采集到果實的有變葉葡萄、刺葡萄、華東葡萄、樺葉葡萄、毛葡萄、秋葡萄、桑葉葡萄、山葡萄、腺枝葡萄、燕山葡萄、蘡薁等11個野生種共98個株系。每個株系采樣300粒,其中隨機選取100粒用于果實理化指標的測定,其余用液氮速凍后,手工將果皮與果肉分離,將分離的果皮置于液氮速凍,用真空冷凍干燥機凍干后,用研磨機將其研磨為細粉,并儲藏于-80℃冰箱備用。

      兒茶素[(+)-Catechin,C]、表兒茶素[(-)-Epicatechin,EC]、表棓兒茶素[(-)-Epigallocatechin,EGC]和表兒茶素沒食子酸酯[(-)-Epicatechin-3-O-gallate,ECG]均購于Sigma(St. Louis,MO,USA)公司,純度均98%以上;色譜級的乙腈(Acetonitrile)、甲醇(Methanol)、丙酮(Acetone)和磷酸(Phosphoric acid)均購于Fisher(Fairlawn,NJ,USA)公司,純度均達99.9%以上;分析純的間苯三酚(phloroglucinol)、乙酸鈉(sodium acetate)和抗壞血酸(Ascorbate)購于索萊寶生物科技有限公司,純度達99%;HCl試劑購買于北京北化精細化學品有限公司,純度36.0%—38.0%;試驗用水由Milli-Q(Millipore,Bedford,MA)純化制得。

      1.2 儀器與設備

      Waters UPLC超高效液相色譜,包括TUV檢測器、四元溶劑管理器、樣品管理器,ACQUITY UPLC BEH HILIC C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),上海安亭科學儀器廠的GL-20G-11離心機,HW-SY11-K電熱恒溫水浴鍋,0.22 μm孔徑有機相濾膜。

      1.3 方法

      1.3.1 葡萄果實理化指標測定方法 每個野生種的每個株系隨機選取100粒果實,稱取果實鮮重。將果實用液氮速凍后,手動去皮,并稱取果皮鮮重,將新鮮的果皮用液氮速凍后用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥,稱取果皮冷凍干燥后的干重,計算葡萄果皮的比重及葡萄果皮的含水率。

      1.3.2 葡萄果實理化指標測定方法 葡萄果皮黃烷-3-醇的提取方法參考Downey等[21]的研究,并進行了優(yōu)化。準確稱取0.1 g葡萄果皮干粉于2 mL離心管中,加入1 mL 70%丙酮水溶液,加入0.005 g Vc避免氧化,置于-4℃冰箱,避光低溫浸漬24 h,隨后用低溫離心機離心(1 500 r/min,15 min,4℃),取上清液兩份,每份300 μL,均在常溫下進行氮氣吹干。其中一份用150 μL含1% HCl的酸化甲醇溶解,再加入150 μL乙酸鈉(200 mmol·L-1)中和后,于-80℃冰箱保存,用于游離態(tài)黃烷-3-醇的檢測;另一份加入150 μL間苯三酚緩沖液(0.3 N HCl,50 g·L-1間苯三酚和0.005 g Vc),在50℃下靜止裂解20 min后,加入150 μL乙酸鈉(200 mmol·L-1)終止反應,隨后于-80℃冰箱保存,用于聚合態(tài)黃烷-3-醇的檢測,每個提取重復3次。

      1.3.3 UPLC檢測黃烷-3-醇的條件 試驗采用Waters UPLC超高效液相色譜進行標準樣品及實際樣品的UPLC-TUV檢測分析。色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH HILIC C18柱。流動相A:0.2%磷酸水溶液,流動相B:乙腈﹕0.2%磷酸水溶液(4﹕1,v/v)。梯度洗脫程序:0—6 min,10% B;6—9 min,10%—15% B;9—12 min,15%—20% B;12—15 min,20%—33% B;15—16.5 min,33%—40% B;16.5—17.4 min,40%—100% B;17.4—18.9 min,100% B;18.9—19.2 min,10% B。流速0.3 mL·min-1;柱溫:25℃;樣品溫:4℃;檢測波長:280 nm;進樣量:10 μL。

      1.3.4 黃烷-3-醇的定性定量分析 待檢測的樣品經0.22 μm孔徑的有機相濾膜過濾后直接進入UPLC-TUV檢測分析。游離黃烷-3-醇以標樣的保留時間為主,根據所購買的標樣通過外標法得到標準曲線(表1)進行定量。聚合黃烷-3-醇經酸催化裂解反應后,末端單元以游離黃烷-3-醇單體的形式釋放出來,延伸單元會與間苯三酚結合形成新的復合物,定性參考KENNEDY等[44]的方法,黃烷-3-醇與間苯三酚的復合物分別用相應的標準曲線定量。末端單元和延伸單元總物質的量與末端單元物質的量的比值得到聚合黃烷-3-醇的平均聚合度(mean degree of polymerization,mDP),其計算公式mDP=(末端單元物質的量+延伸單元物質的量)/末端單元物質的量。

      1.4 統計分析

      利用Microsoft Excel 2007軟件對試驗結果進行初步分析;用Origin 8.5軟件進行圖形繪制;用SPSS 20.0進行單因素方差分析及主成分分析。

      表1 4種黃烷-3-醇類物質的線性方程及相關系數

      -峰面積;-黃烷-3-醇濃度(mg·L-1)

      -Peak area;-Concentration of flavan-3-ols (mg·L-1)

      2 結果

      2.1 葡萄果實理化指標

      對11個中國野生種共98個株系的葡萄果實鮮重、果皮比重及果皮含水率等果實理化指標進行了統計,結果如表2所示。刺葡萄的果實鮮重顯著高于其他野生種,并顯著高于對照‘赤霞珠’;秋葡萄和燕山葡萄果實鮮重顯著低于其他野生種及‘赤霞珠’。山葡萄和蘡薁的果皮比重顯著高于其他野生種,并顯著高于‘赤霞珠’;刺葡萄的果皮比重則顯著低于其他野生種及對照。變葉葡萄、華東葡萄、樺葉葡萄、山葡萄和蘡薁果皮中含水率與對照無顯著性差異,但均顯著高于毛葡萄和腺枝葡萄(表2)。

      2.2 中國野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量

      利用UPLC對11個野生種98個株系的葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質進行檢測,果皮中黃烷-3-醇的含量參照文獻中常見的mg·g-1和mg/berry兩種表示方法呈現[21],結果見電子附表1和圖1。

      從電子附表1可以看出,對于同一野生種,不同株系之間也存在較大差異,如變葉葡萄中‘靈寶變葉’果皮黃烷-3-醇含量高于同種其他株系,而‘龍峪灣2號’則較低;刺葡萄中‘福安刺葡萄’果皮黃烷-3-醇含量高于同種其他株系,而‘刺葡萄洪江-09’低于同種其余株系,僅為‘福安刺葡萄’的27.4%;華東葡萄中‘湖北浠水華東’果皮中黃烷-3-醇含量較高,高出含量最低的‘華東雙溪-03’約183.5%;桑葉葡萄中‘青要山-4’果皮中黃烷-3-醇含量高達1.288 mg·g-1,高于同種其余株系和所檢測的其余野生種,而‘信陽-09’含量最低,僅為‘青要山-4’的29.7%;腺枝葡萄中‘洪江雙溪-03’高于同種其余株系,而‘廣西羅城腺’低于同種其余株系;蘡薁中‘蘡薁林縣-1’略高于同種其余株系,而‘蘡薁青要山-10’略低于同種其余株系。

      供試野生葡萄果皮中黃烷-3-醇含量平均為0.674 mg·g-1或0.581 mg/berry,略低于對照品種‘赤霞珠’。在檢測的11個中國野生種中,變葉葡萄、樺葉葡萄、毛葡萄、秋葡萄、燕山葡萄和蘡薁的所有株系的葡萄果皮中黃烷-3-醇含量(以mg·g-1果實鮮重計)均低于‘赤霞珠’,而刺葡萄、華東葡萄、桑葉葡萄、山葡萄和腺枝葡萄均存在高于‘赤霞珠’的株系,其中桑葉葡萄中有19個株系的葡萄果皮中黃烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’,以‘青要山-4’株系含量最高,高出對照赤霞珠66.6%。

      表2 不同種葡萄果實理化指標的比較

      同列不同字母表示存在顯著性差異(<0.05)Different letters in the same column are significantly different (<0.05)

      圖1為不同野生種不同株系的葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質含量的箱線圖,可以直觀地看出,同一野生種不同株系的黃烷-3-醇含量變化幅度。其中A圖為以mg·g-1計的結果,可以看到刺葡萄、華東葡萄、山葡萄和腺枝葡萄處于相對較高的水平,而變葉葡萄和樺葉葡萄處于相對較低的水平,這與電子附表1展示的結果一致。B圖為以mg/berry計的結果,可以看到刺葡萄處于很高的水平,顯著高于其余野生種及對照,這與刺葡萄果實較大,單果粒果皮相對較重有密切的關系。綜合A圖和B圖可以看到,桑葉葡萄的變化范圍較大,這與株系的數量具有很大關系,通過選取盡可能多的株系進行檢測分析,對于野生種的評價更為準確。

      A圖為mg·g-1表示的黃烷-3-醇含量;B圖為mg/berry表示的黃烷-3-醇的含量。橫坐標縮寫指代同表1。下同

      2.3 中國野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的結構組成

      2.3.1 按照黃烷-3-醇類物質的結構組成進行分類分析 對不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質組成進行分析,結果如圖2所示。這11種野生葡萄果皮中黃烷-3-醇由EGC、C、EC和ECG組成,其中EGC和EC為葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的主要組成成份,并且在同一種葡萄果皮中EGC的含量均高于EC。秋葡萄果皮中EGC的含量高于其他野生種,其次是毛葡萄、桑葉葡萄和山葡萄,其果皮中EGC的含量也高于‘赤霞珠’,余下的7個野生種之間沒有明顯差異;桑葉葡萄果皮中EC的含量高于腺枝葡萄,腺枝葡萄果皮中EC的含量與‘赤霞珠’之間無明顯差異,均高于其他野生種(圖2-A)。刺葡萄果皮中EGC和EC的含量均高于對照和其他野生種,燕山葡萄果皮中EGC和EC的含量低于其他野生種;毛葡萄果皮中EGC的含量與對照組沒有明顯差異,EC的含量低于對照(圖2-B)。

      野生葡萄和對照葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質均以EGC和EC為主,C和ECG所占比例相對較低;不同野生種之間比較發(fā)現,毛葡萄和秋葡萄果皮中EGC所占比例較高,高于對照和其余野生種,而其余野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的組成比例與對照相似(圖2-C、D)。

      從圖2可以看出,野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的組成與對照相似,均由EGC、C、EC和ECG組成,并且均以EGC和EC為主;這兩種不同的表示方法呈現的黃烷-3-醇的含量存在較大差異,這與不同種葡萄果實鮮重及果皮比重的差異有較大關系;葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質組成單元的比例與黃烷-3-醇含量所用何種表示方法無關。

      C圖為mg·g-1計量的各組成單元所占百分比;D圖為mg/berry計量的各組成單元所占百分比

      2.3.2 按照黃烷-3-醇類物質的代謝路徑進行分類分析 根據黃烷-3-醇合成分支路徑可以把黃烷-3-醇類物質分為兩大類:一類是由F3′H途徑催化產生的兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯(C+EC+ECG);另一類是由F3′5′H途徑催化產生的表棓兒茶素(EGC)。不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質按照代謝路徑分類結果如圖3所示。不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質代謝路徑有一定的差異,毛葡萄和秋葡萄F3′5′H代謝路徑產生的3′4′5′端取代的黃烷-3-醇所占比例高于對照和其余野生種;其次是山葡萄,其3′4′5′端取代的黃烷-3-醇所占比例低于毛葡萄和秋葡萄,高于對照和其他野生種;其他野生種和對照之間均無明顯差異。

      2.3.3 按照黃烷-3-醇類物質的存在狀態(tài)進行分類分析 在歐亞種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質不僅以聚合態(tài)的形式存在,同時也以游離單體的形式存在,中國野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的存在形式如圖4所示。野生種和‘赤霞珠’的葡萄果皮中,黃烷-3-醇類物質的存在狀態(tài)相似(圖4-A),主要以聚合體的形式存在,并且聚合黃烷-3-醇所占比例在90%以上。不同種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度存在較大差異(圖4-B),山葡萄果皮中黃烷-3-醇的平均聚合度高達50,高于對照和其他野生種;樺葉葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度低于對照和其余野生種,其平均聚合度在25左右,其余野生種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度介于25—45。

      圖3 不同種葡萄果皮中F3′H和F3′5′H代謝產生的黃烷-3-醇類物質的相對比例

      圖4 不同種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇和游離黃烷-3-醇在黃烷-3-醇總量所占比例(A)及聚合黃烷-3-醇的平均聚合度(B)

      2.4 中國野生種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇類物質的結構組成

      從圖4可以看出,野生葡萄果皮中的黃烷-3-醇主要以聚合體的形式存在,并且不同種葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的存在狀態(tài)相似,而聚合態(tài)的黃烷-3-醇由末端單元和延伸單元組成,因此對其末端單元和延伸單元進行詳細分析,以探尋差異。

      2.4.1 不同野生種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇末端單元組成及含量比較分析 在末端單元中檢測到EGC、C、EC和ECG這4種組分(圖5),表明這4種組分均可以作為末端單元參與聚合黃烷-3-醇的形成;不同種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇末端單元主要由兒茶素和表兒茶素組成,并且對于同一個野生種聚合黃烷-3-醇末端單元中C的含量高于EC。

      樺葉葡萄中作為末端單元C的含量高于桑葉葡萄和蘡薁(圖5-A),并高于對照和其余野生種;對于EC組分,不同種葡萄C組分表現相似;而EGC和ECG在不同野生種之間沒有明顯差異,也均與對照沒有明顯差異。

      刺葡萄果皮中作為末端單元的C和EC的含量高于其余野生種和對照(圖5-B),毛葡萄果皮中作為末端單元的C和EC與對照赤霞珠沒有明顯差異,高于其余野生種;而華東葡萄、秋葡萄和燕山葡萄果皮中末端單元中各組分的含量低于其他野生種。

      2.4.2 不同野生種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇延伸單元組成及含量比較分析 在延伸單元中同樣檢測到C、EC、ECG和EGC這4種組分(圖6),表明這4種組分均可以延伸單元的形式參與聚合形成聚合黃烷-3-醇。不同種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇延伸單元主要由EGC和EC組成,并且對于同一個野生種,聚合黃烷-3-醇延伸單元中EGC的含量高于EC。

      A圖為mg·g-1果實鮮重表示的延伸單元含量;B圖為mg/berry表示的延伸單元的含量

      秋葡萄延伸單元中EGC的含量高于對照和 其余野生種(圖6-A)。對于同一種葡萄,EGC的含量高于EC;桑葉葡萄和腺枝葡萄果皮延伸單元中EC含量與對照無明顯差異,但均高于其余野生種。

      刺葡萄果皮延伸單元中EGC和EC的含量高于對照和其余野生種(圖6-B),對于同一種葡萄,EGC的含量高于EC;毛葡萄果皮延伸單元中EGC的含量與對照無明顯差異,但EC的含量卻低于對照。燕山葡萄果皮中EGC的含量低于其余野生種,秋葡萄的EC含量低于其余野生種。

      2.5 主成份分析

      對11個野生種的98個株系基于其果皮中黃烷-3-醇的含量(mg·g-1)及理化指標進行主成份分析,結果如圖7所示(圖7-A:載荷圖,展示的是各變量所占的比重;圖7-B:得分圖,展示的是不同種之間的差異性)??梢钥闯觯唐咸雅c其余野生種有較大的差異,這種差異與刺葡萄果實大小有密切的關系;桑葉葡萄大部分株系都集中在第三象限,結合圖7-A可知,桑葉葡萄果皮中黃烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’和刺葡萄,這與前面的分析結果一致。

      圖7 不同野生種基于葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的含量及理化指標的主成份分析

      3 討論

      黃烷-3-醇類物質,是葡萄果實內在品質的重要特征之一,具有明顯的藥理學作用,是葡萄及葡萄酒中的保健功能成分。此外,黃烷-3-醇類物質對葡萄酒的許多感官品質如色澤、風味、澄清度、收斂性、褐變等具有決定性作用[1]。不同組成單元對葡萄酒感官品質的影響不同,與兒茶素相比,表兒茶素更為苦澀,并且時間也更持久,在相同條件下,含有較多的表兒茶素的分子會更澀[8],沒食子化的黃烷-3-醇使葡萄酒變得粗硬,而表棓兒茶素則可降低這種效應,使葡萄酒的口感變得柔和圓潤。另外,隨著黃烷-3-醇類物質聚合度的增大,其澀味增強[10-11]?!嘞贾椤鳛榻浀涞尼劸破咸哑贩N之一,其葡萄果實及所釀造的葡萄酒中的黃烷-3-醇類物質的結構組成、在葡萄果實中的分布及其合成的影響因素等研究較為深入[9,45-51],因此,本研究選擇同一資源圃中的‘赤霞珠’作為對照。在本研究中檢測的變葉葡萄、刺葡萄、華東葡萄、樺葉葡萄、毛葡萄、秋葡萄、桑葉葡萄、山葡萄、腺枝葡萄、燕山葡萄和蘡薁這11個野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇的組成相似,均是由兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯組成,并且以表棓兒茶素和表兒茶素為主,而不同種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量均存在較大差異。以mg·g-1果實鮮重表示的結果中,桑葉葡萄果皮中黃烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’,高出6.5%,其余野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量均低于‘赤霞珠’,按照黃烷-3-醇含量從高到底依次為桑葉葡萄、赤霞珠、山葡萄、腺枝葡萄、秋葡萄、毛葡萄、華東葡萄、刺葡萄、燕山葡萄、蘡薁和變葉葡萄,與文獻報道毛葡萄果皮中黃烷-3-醇總量顯著高于刺葡萄的結果一致[39],同樣與研究報道中桑葉葡萄果皮黃烷-3-醇含量顯著高于刺葡萄、毛葡萄、山葡萄及‘赤霞珠’的結果一致[38]。不同的表示方法所得的結果有所差異,以mg/berry計的結果中,刺葡萄果皮黃烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’,高出65.5%,其余野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量低于‘赤霞珠’,按照黃烷-3-醇含量由高到底順序依次為刺葡萄、赤霞珠、腺枝葡萄、山葡萄、桑葉葡萄、蘡薁、樺葉葡萄、變葉葡萄、秋葡萄、華東葡萄和燕山葡萄,這與mg·g-1果實鮮重表示的結果有很大的不同,尤其是刺葡萄,用mg/berry表示的結果,消除了果粒大小、果實鮮重對葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的“稀釋”作用,使得黃烷-3-醇含量有極大的提高。不同的表示方法呈現出不同的結果,這與文獻中的相關報道一致[21]。

      研究指出毛葡萄酒中兒茶素的含量高于‘赤霞珠’[52],而在本研究中同樣觀察到了毛葡萄果皮中兒茶素的含量高于‘赤霞珠’。按照黃烷-3-醇合成的分支路徑,把黃烷-3-醇類物質分成兩大類:一類是由F3′5′H代謝路徑產生的3′4′5′端取代的黃烷-3-醇(EGC);另一類是由F3′H催化產生的3′4′端取代的黃烷-3-醇(C、EC和ECG)。本研究中,毛葡萄和秋葡萄果皮中3′4′5′端取代的黃烷-3-醇所占比例高于對照和其余野生種,這與文獻報道的結果一致[39]。由此看出,毛葡萄和秋葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質的合成更偏向于F3′5′H路徑。

      本研究對部分野生葡萄果實酚類物質中的黃烷-3-醇類物質進行了詳細的比較分析,除黃烷-3-醇類物質外,還有葡萄果皮中的花色苷、黃酮醇、白藜蘆醇,葡萄果肉中的酚酸以及葡萄種子中的單寧等酚類物質,均具有較高的生物活性,對人體健康具有重要意義,同時也對葡萄酒的品質有重要作用[6,39],這些組分在葡萄果實中的存在位置、存在形式及含量有待更詳細的研究。此外,與釀酒特性相關的可溶性固形物含量、酸度、香氣及釀造工藝等共同決定釀酒品質[6],因此,中國野生葡萄的釀造利用還需進一步研究。同時,不同種野生葡萄果皮中黃烷-3-醇含量的差異可能與其合成代謝路徑及相關酶活性等相關[16],也需進一步研究。

      4 結論

      不同種野生葡萄果皮中黃烷-3-醇類物質均由兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯組成,其中以表棓兒茶素和表兒茶素為主。不同表示方法所得的黃烷-3-醇含量有較大的差異,以mg·g-1果實鮮重表示的結果,桑葉葡萄高于對照和其他野生種,而樺葉葡萄則低于其他野生種;以mg/berry表示的結果中,刺葡萄高于其他野生種,而燕山葡萄則低于其他野生種。相對于其他野生種,毛葡萄和秋葡萄果皮中黃烷-3-醇的積累更偏向于F3′5′H代謝路徑;所檢測的中國野生種葡萄果皮中的黃烷-3-醇類物質90%以上以聚合體的形式存在,不同種葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度存在較大差異,其中山葡萄的平均聚合度高達50,而樺葉葡萄果皮中聚合黃烷-3-醇的平均聚合度僅為25左右,而其余野生種則介于25—45;C、EC、ECG和EGC四種組分均以末端單元和延伸單元的形式參與聚合黃烷-3-醇的形成,其中末端單元以C和EC為主,而延伸單元以EGC和EC為主??傮w來說,刺葡萄、樺葉葡萄、桑葉葡萄、山葡萄和腺枝葡萄均有黃烷-3-醇含量高于‘赤霞珠’的株系,這些株系均可以作為提高黃烷-3-醇的育種材料。不同野生種葡萄果皮中黃烷-3-醇含量存在較大差異,對于中國野生葡萄種質資源的評價具有重要意義,對進一步深入研究野生葡萄果實中的其他功能性成分代謝奠定了基礎。

      References

      [1] ARON P M, KENNEDY J A. Flavan-3-ols: nature, occurrence and biological activity., 2008, 52(1): 79-104.

      [2] GROTEWOLD E.. Springer, 2006.

      [3] JORD?O A M, CORREIRA A C, GON?ALVES F J. Evolution of antioxidant capacity in seeds and skins during grape maturation and their association with proanthocyanidin and anthocyanin content., 2015, 51(3): 137.

      [4] KENNEDY J A, SAUCIER C, GLORIES Y. Grape and wine phenolics: history and perspective., 2006, 57(3): 239-248.

      [5] KOVAC V, ALONSO E, REVILLA E. The effect of adding supplementary quantities of seeds during fermentation on the phenolic composition of wines., 1995, 46(3): 363-367.

      [6] CONDE C, SILVA P, FONTES N, PIRES DIAS A C, TAVARES R M, SOUSA M J, AGASSE A, Delrot S, GERóS H. Biochemical changes throughout grape berry development and fruit and wine quality., 2007, 1(1): 1-22.

      [7] HERDERICH M J, SMITH P A. Analysis of grape and wine tannins: Methods, applications and challenges., 2005, 11(2): 205-214.

      [8] THORNGATE J H, NOBLE A C. Sensory evaluation of bitterness and astringency of 3R (?)‐epicatechin and 3S (+)‐catechin., 1995, 67(4): 531-535.

      [9] CHIRA K, JOURDES M, TEISSEDRE P L. Cabernet sauvignon red wine astringency quality control by tannin characterization and polymerization during storage., 2012, 234(2): 253-261.

      [10] VIDAL S, FRANCIS L, GUYOT S, MARNET N, KWIATKOWSKI M, GAWEL R, CHEYNIER V, WATERS E J. The mouth‐feel properties of grape and apple proanthocyanidins in a wine‐like medium., 2003, 83(6): 564-573.

      [11] ELEG H, GACON K, SCHLICH P, NOBLE A C. Bitterness and astringency of flavan‐3‐ol monomers, dimers and trimers., 1999, 79(8): 1123-1128.

      [12] DRINKINE J, LOPES P, KENNEDY J A, TEISSEDRE P L, SAUCIER C. Ethylidene-bridged flavan-3-ols in red wine and correlation with wine age., 2007, 55(15): 6292-6299.

      [13] 李華, 王華, 袁春龍, 王樹生. 葡萄酒化學. 北京: 科學出版社, 2005.

      LI H, WANG H, YUAN C L, WANG S S.. Beijing: Science Press, 2005. (in Chinese)

      [14] POZO-BAYóN M á, MONAGAS M, BARTOLOMé B, MORENO- ARRIBAS M V. Wine features related to safety and consumer health: an integrated perspective., 2012, 52(1): 31-54.

      [15] SOUQUET J M, CHEYNIER V, BROSSAUD F, MOUTOUNET M. Polymeric proanthocyanidins from grape skins., 1996, 43(2): 509-512.

      [16] FUJITA A, SOMA N, YAMAMOTO N G, SHINDO H, KAKUTA T, KOIZUMI T, HASHIZUME K. Anthocyanidin reductase gene expression and accumulation of flavan-3-ols in grape berry., 2005, 56(4): 336-342.

      [17] CADOT Y, CASTELLó M M, CHEVALIER M. Flavan-3-ol compositional changes in grape berries (L. cv Cabernet Franc) before veraison, using two complementary analytical approaches, HPLC reversed phase and histochemistry., 2006, 563(1): 65-75.

      [18] FOURNAND D, VICENS A, SIDHOUM L, SOUQUET J M, MOUTOUNET M, CHEYNIER V. Accumulation and extractability of grape skin tannins and anthocyanins at different advanced physiological stages., 2006, 54(19): 7331-7338.

      [19] MATTIVI F, VRHOVSEK U, MASUERO D, TRAINOTTI D. Differences in the amount and structure of extractable skin and seed tannins amongst red grape varieties., 2009, 15(1): 27-35.

      [20] CERPA-CALDERóN F K, KENNEDY J A. Berry integrity and extraction of skin and seed proanthocyanidins during red wine fermentation., 2008, 56(19): 9006-9014.

      [21] DOWNEY M O, HARVEY J S, ROBINSON S P. Analysis of tannins in seeds and skins of Shiraz grapes throughout berry development., 2003, 9(1): 15-27.

      [22] CADOT Y, CHEVALIER M, BARBEAU G. Evolution of the localisation and composition of phenolics in grape skin between veraison and maturity in relation to water availability and some climatic conditions., 2011, 91(11): 1963-76.

      [23] COHEN S D, TARARA J M, KENNEDY J A. Assessing the impact of temperature on grape phenolic metabolism., 2008, 621(1): 57-67.

      [24] KOYAMA K, IKEDA H, POUDEL P R, GOTO-YAMAMOTO N. Light quality affects flavonoid biosynthesis in young berries of Cabernet Sauvignon grape., 2012, 78: 54-64.

      [25] AZUMA A, YAKUSHIJI H, KOSHITA Y, KOBAYASHI S. Flavonoid biosynthesis-related genes in grape skin are differentially regulated by temperature and light conditions., 2012, 236(4): 1067-1080.

      [26] 溫鵬飛, 邢延富, 牛鐵泉, 高美英, 牛興艷. UV-C對葡萄果實發(fā)育過程中黃烷醇類積累及隱色花色素還原酶表達的影響. 中國農業(yè)科學, 2012, 45(21): 4428-4436.

      WEN P F, XING Y F, NIU T Q, GAO M Y, NIU X Y. Accumulation of flavanols, expression of leucoanthocyanidin reductase induced by UV-C irradiation during grape berry development., 2012, 45(21): 4428-4436. (in Chinese)

      [27] SPAYD S E, TARARA J M, MEE D L, FERGUSON J C. Separation of sunlight and temperature effects on the composition ofcv. Merlot berries., 2002, 53(3): 171-182.

      [28] SABBATINI P S, WIERBA K, CLEARWATER L, HOWELL G S. Impact of training system and pruning severity on yield, fruit composition, and vegetative growth of ‘Niagara’ grapevines in Michigan., 2015, 15(3): 237-250.

      [29] SCAFIDI P, PISCIOTAA A, PATII D, TAMBORRA P, LORENZO R D, BARBAGALLO M G. Effect of artificial shading on the tannin accumulation and aromatic composition of the Grillo cultivar (L.)., 2013, 13(1): 175.

      [30] KEMP B. S, HARRISON R,GREASY G. L. Effect of mechanical leaf removal and its timing on flavan-3-ol composition and concentrations inL. cv. Pinot Noir wine., 2011, 17(2): 270-279.

      [31] STEVENS R M, PECH J M, TAYLOR J, CLINGELEFFER P, WALKER R R, NICHOLAS P R. Effects of irrigation and rootstock on(L.) cv. Shiraz berry composition and shrivel, and wine composition and wine score., 2016, 22(1): 124-136.

      [32] FILIPPETTI I, MOVAHED N, ALLEGRO G, VALENTINI G, PASTORE C, COLUCCI E, INTRIERI C. Effect of post-veraison source limitation on the accumulation of sugar, anthocyanins and seed tannins incv. Sangiovese berries and seed tannins incv. Sangiovese berries., 2015, 21(1): 90-100.

      [33] NOORDWYK M V. Interaction of water deficit, canopy modification and ripening: effect on the phenolic and colour composition of Shiraz grapes & subsequent wine [D]. Stellenbosch: Stellenbosch University, 2012.

      [34] HERNANDEZ M M, SONG S, MENENDEZ C M. Influence of genetic and vintage factors in flavan-3-ol composition of grape seeds of a segregatingpopulation., 2017, 97(1): 236-243.

      [35] PI?EIRO Z, CANEPA D, PALMA M, BARROSO C G. Evolution of grape seed flavan-3-ols during ripening of different grape cultivars., 2012, 47(1): 40-46.

      [36] BUELGA C S, ARICHA E F, BAILóN M E. Comparative flavan-3-ol composition of seeds from different grape varieties., 1995, 53(2): 197-201.

      [37] PANTELI? M M, ZAGORAC D D, DAVIDOVI? S M, TODI? S R, BE?LI? Z S, GA?I? U M, TE?I? ? L, NATI? M M. Identification and quantification of phenolic compounds in berry skin, pulp, and seeds in 13 grapevine varieties grown in Serbia., 2016, 211: 243-252.

      [38] XU C M, ZHANG Y L, CAO L, LU J. Phenolic compounds and antioxidant properties of different grape cultivars grown in China., 2010, 119(4): 1557-1565.

      [39] LIANG N N, PAN Q H, HE F, WANG J, REEVES M J, DUAN C Q. Phenolic profiles ofandspecies native to China., 2013, 61(25): 6016-6027.

      [40] JAING J F, KELL S, FAN X C, ZHANG Y, WEI W, KANG D, MAXTED N, LIOYD B F, LIU C H. The wild relatives of grape in China: Diversity, conservation gaps and impact of climate change.,, 2015, 209: 155-163.

      [41] 孔慶山. 中國葡萄志. 北京: 中國農業(yè)科學技術出版社, 2004: 28-53.

      KONG Q S.. Beijing: Chinese Agricultural Science and Technique Publishing Company, 2004: 28-53. (in Chinese)

      [42] 劉崇懷, 姜建福, 樊秀彩, 張穎. 中國野生葡萄資源在生產和育種中利用的概況. 植物遺傳資源學報, 2014, 15(4): 720-727.

      LIU C H, JIANG J F, FAN X C, ZHANG Y. The utilization of Chinese wild grape species in production and breeding., 2014, 15(4): 720-727. (in Chinese)

      [43] GIL M, PASCUAL O, ALONSO S G, ROMERO E G, GUTIéRREZ I H, ZAMORA F, CANALS J M. Influence of berry size on red wine colour and composition., 2015, 21(2): 200-212.

      [44] KENNEDY J A, JONES G P. Analysis of proanthocyanidin cleavage products following acid-catalysis in the presence of excess phloroglucinol., 2001, 49(4): 1740-1746.

      [45] HARBERTSON J F, KENNEDY J A, ADAMS D O. Tannin in skins and seeds of Cabernet Sauvignon, Syrah, and Pinot noir berries during ripening., 2002, 53(1): 54-59.

      [46] Li Z, PAN Q H, JIN Z M, MU L, DUAN C Q. Comparison on phenolic compounds incv. Cabernet Sauvignon wines from five wine-growing regions in China., 2011, 125(1): 77-83.

      [47] GAGNé S, SAUCIER C, GéNY L. Composition and cellular localization of tannins in Cabernet Sauvignon skins during growth., 2006, 54(25): 9465-9471.

      [48] HANLIN R L, KELM M A, WILKINSON K L, DOWNEY M O. Detailed characterization of proanthocyanidins in skin, seeds, and wine of Shiraz and Cabernet Sauvignon wine grapes ()., 2011, 59(24): 13265-13276.

      [49] MONAGAS M, GóMEZ-CORDOVéS C, BARTOLOMé B, LAUREANO O, SILVA J M R. Monomeric, oligomeric, and polymeric flavan-3-ol composition of wines and grapes fromL. cv. Graciano, Tempranillo, and Cabernet Sauvignon., 2003, 51(22): 6475-6481.

      [50] KOYAMA K, GOTO-YAMAMOTO N. Bunch shading during different developmental stages affects the phenolic biosynthesis in berry skins of ‘Cabernet Sauvignon’grapes., 2008, 133(6): 743-753.

      [51] LIU Y X, PAN Q H, YAN G L, HE J J, DUAN C Q. Changes of flavan-3-ols with different degrees of polymerization in seeds of ‘Shiraz’, ‘Cabernet Sauvignon’ and ‘Marselan’ Grapes after Veraison., 2010, 15(11): 7763-7774.

      [52] 吳瑩, 李華. 廣西都安野生毛葡萄酒中單體酚的測定. 中國釀造, 2010, 220 (7): 168-170.

      WU Y, LI H. Determination of mono-phenols in wild Vitis quinquangularisris wine in Guangxi Du'an., 2010, 220(7):168-170. (in Chinese)

      (責任編輯 趙伶俐)

      附表1 98個株系的野生葡萄果皮中黃烷-3-醇含量

      Table 1 Content of flavan-3-ols in berry peel of 98 cultivars or clones

      Composition and Concentration of Flavan-3-ols in Berry Peel of 11 Chinese Wild Grape species

      YAN Jing, JIANG Yu, FAN XiuCai, JIANG JianFu, ZHANG Ying, Sun HaiSheng, LIU ChongHuai

      (Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009)

      【Objective】China is one of the countries rich in resources ofgermplasm in the world, most of their berries are little in size, with thick dark-red peels, thus they are expected to be utilized for high quality wine production. While as a critical component to wine quality, flavan-3-ols in peel of Chinese wild grapes seldomly has been researched. In the present paper, the difference of the composition and concentration of flavan-3-ols in berry peel of different Chinese wild grape species was evaluated, with the aim of leading to better choice of raw materials for wine making and evaluation of Chinese wild grape germplasm.【Method】 Ninety-eight cultivars or clones of eleven Chinese wild species were selected, includingsubsp.varand.L.‘Cabernet Sauvignon’ was chosen as control. Mature berries were collected from the National Grape Germplasm Repository in Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences in 2015. The composition and concentration of flavan-3-ols in berry peel of selected samples were determined by reversed-phase UPLC after acetone extraction and acid-catalysis in the presence of excessive phloroglucinol. 【Result】 The results are as follows: The contents of flavan-3-ols from different species were different. Among the eleven species, the contents of flavar-3-ols insubsp.were much higher in berry peel than the control and the other detected species, while that inandwere the lowest in berry peel, only 64% of the control. The compositions of falvan-3-ols in berry peel of Chinese wild grapes was similar to that of the control, and composed by catechin (C), epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC) and epicatechin-3-O-gallate (ECG). In berry peel, EGC was the major constituent representing around 60% of total flavan-3-ols, with EC accounting for around 35% of total flvan-3-ols, while C and ECG represented less than 5%. These four constitutional units can not only being as terminal subunits but also as extension subunits of polymeric flavan-3-ols. The flavan-3-ols in berry peel of Chinese wild species was mainly existed as polymers, and representing above 90% of total flavan-3-ols. The mean degree of polymerization (mDP) of different species was different, among the detected species,had the highest level of mDP above 50, whilewas only 25 and the other species were between 25 and 45. Of these flavan-3-ol compounds, EGC is synthesized from the F3′5′H-mediated branch pathway and so is grouped into the 3′,4′,5′-substituted flavan-3-ols, whereas C, EC and ECG are from the F3′H-mediated branch and are grouped into 3′,4′-substitued flavan-3-ols. Compared with the other species,andhad a much lower percentage of total 3′,4′-substituted flavan-3-ols (C, EC and ECG) and a significantly higher percentage of 3′,4′,5′-substituted flavan-3-ols (EGC). Principle component analysis revealed that there was a certain distinction among the wild species, whilewas notably from the other species.【Conclusion】 Compared with theL.‘Cabernet Sauvignon’, some special cultivars or clones of the,,subsp.,andpossess much higher flavan-3-ols content in berry peel, which hold a great potential be used for breeding new materials with high level of flavan-3-ols. Besides, the content of flavan-3-ols varied among different species, which would act as an additional index to evaluate the quality of Chinese wild grape germplasm.

      Chinese wild grapes; cultivars or clones; berry skin; flavan-3-ols

      2016-07-19;接受日期:2016-12-19

      國家葡萄產業(yè)技術體系(CARS-30)、中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程專項經費項目(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)

      嚴靜,E-mail:hnnyzzyj@163.com。 通信作者劉崇懷,Tel:0371-55906986;E-mail:liuchonghuai@caas.cn

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