丹參酮ⅡA通過增強自噬抑制AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡

胡鵬飛　　陸明　　黃抒偉

[摘要] 目的 研究自噬在丹參酮ⅡA抑制晚期糖基化產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡中的作用及相關(guān)機制。 方法 丹參酮ⅡA及AGEs處理內(nèi)皮細胞，MTT法檢測細胞活性，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Western blot檢測相關(guān)蛋白量表達。 結(jié)果 與對照組相比，AGEs組和丹參酮ⅡA組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達增加，SQSTM1/p62表達減少，AGEs+丹參酮ⅡA組LC3-Ⅱ表達進一步增加，SQSTM1/p62表達進一步下降。與對照組相比，AGEs組細胞凋亡率增加，細胞活性下降，與AGEs組相比，AGEs+丹參酮ⅡA組細胞凋亡率下降，細胞活性增加，AGEs+自噬抑制劑3-MA組細胞凋亡率增加，細胞活性下降。丹參酮ⅡA組p-AKT、p-mTOR表達下降，呈時間依賴性。 結(jié)論 丹參酮ⅡA通過增強自噬抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡，這可能與其抑制AKT/mTOR信號通路相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；晚期糖基化產(chǎn)物；自噬；內(nèi)皮細胞；細胞凋亡

[中圖分類號] R363.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）21-0028-05

Tanshinone ⅡA suppresses AGEs-induced endothelial cell apoptosis by enhancing autophagy

HU Pengfei LU Ming HUANG Shuwei

Department of Cardiology， Zhejiang Xinhua Hospital， Zhejiang Traditional Chinese Medicine University Second Affiliated Hospital， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To study the effect and mechanism of autophagy in tanshinone ⅡA suppressing AGEs-induced endothelial cell apoptosis. Methods Endothelial cells were managed by tanshinone ⅡA and AGEs， MTT was used to detect cell viability， FCM was used to detect cell apoptosis rate， and Western blot was used to detect protein expression. Results Compared with the control group， the expression of autophagy-associated protein LC3-Ⅱ was enhanced in the AGEs group and the tanshinone ⅡA group， and the expression of SQSTM1/p62 was reduced. The expression of LC3-Ⅱ was further enhanced in the AGEs+tanshinone ⅡA group， and the expression of SQSTM1/p62 was further reduced. Compared with the control group， the rate of cell apoptosis was enhanced， and the cell viability was reduced in the AGEs group. Compared with the AGEs group， the rate of cell apoptosis was reduced and the cell viability was enhanced in the AGEs+tanshinone ⅡA group， and the rate of cell apoptosis was enhanced and the cell viability was reduced in the AGEs+autophagy inhibitor 3-MA group. The expressions of p-AKT and p-mTOR were reduced in the tanshinone ⅡA group， with time dependence. Conclusion Tanshinone ⅡA suppresses AGEs-induced endothelial cell apoptosis by enhancing autophagy， which may be associated with its suppression of AKT/mTOR signal channel.

[Key words] Tanshinone ⅡA； AGEs； Autophagy； Endothelial cell； Apoptosis

晚期糖基化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是指大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸或脂質(zhì)在無酶的條件下與其他還原單糖形成的共價化合物，在體內(nèi)隨年齡增加而逐漸蓄積，在糖尿病尤其糖尿病并發(fā)癥、尿毒癥、動脈粥樣硬化、衰老等病理生理過程中起著非常重要的作用[1]。自噬是細胞自身降解大分子或損傷細胞器，維持細胞正常代謝，當細胞自噬水平增強時，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達增加，SQSTM1/p62表達下降，本試驗以此作為判斷自噬水平的標準[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)AGEs能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞自噬水平升高，自噬做為保護性機制能抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡[3]。為進一步探討是否存在藥物對這一病理過程有干預(yù)作用，通過MTT、Western blot、流式細胞術(shù)等方法，對丹參酮ⅡA抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡及相關(guān)機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

抗LC3-Ⅰ/Ⅱ多克隆抗體、3-MA、MTT、小牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、D-葡萄糖均購于Sigma公司；雷帕霉素靶磷酸化蛋白多克隆抗體（phospho-mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、激酶B磷酸化蛋白多克隆抗體（phospho-protein kinase B，p-AKT）、雷帕霉素靶蛋白多克隆抗體（mammalian target of rapamycin，mTOR）、蛋白激酶B多克隆抗體（protein kinase B，AKT）購自Cell Signaling Technology公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；細胞內(nèi)毒素檢測試劑盒購自上海潤成公司；Alexa Fluor 488 Annexin V/PI凋亡試劑盒購自Invitrogen公司；人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（human umbilical endothelial cells，HUVECs）購自中科院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的培養(yǎng) HUVECs接種于含青鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，平均2天更換1次培養(yǎng)液，用0.25%胰酶（含EDTA）消化傳代，等待細胞貼壁24 h后加入AGEs等各項處理因素。

1.2.2 AGEs的制備 參照文獻[4]，將6.0 g D-葡萄糖和1 g BSA溶解于20 mL的0.5 mol/L PBS溶液中，0.22 μm濾器除菌后37℃培養(yǎng)箱內(nèi)錫紙包裹避光孵化3個月。在同等情況下，用不含葡萄糖PBS緩沖液溶解BSA作為對照組，檢測所有成品內(nèi)毒素含量<2.5 U/mL。

1.2.3 Western blot檢測蛋白 Western blot檢測LC3-Ⅰ/Ⅱ、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR、mTOR、AKT。按各組處理后收集細胞，用RIPA裂解液裂解后提取上清蛋白，通過BCA法定量，與5×loading buffer混合，煮沸5 min使蛋白變性。將上樣蛋白（40～50 μg）通過SDS-聚丙烯凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉60 min，相應(yīng)LC3-Ⅰ/Ⅱ、SQSTM1/p62、p-AKT、p-mTOR、mTOR、AKT抗體孵膜過夜。TBS-T洗滌3次，加入HRP標記二抗共孵育1 h，按1∶1配置化學(xué)發(fā)光液，使用LAS-4000-mini化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)成像并進行蛋白條帶灰度值分析。

1.2.4 MTT比色法檢測內(nèi)皮細胞活性 將HUVECs傳代后接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁24 h后分別加入3-MA（2 mmol/L）、AGEs、丹參酮ⅡA（10 μg/mL）等處理因素，每組5復(fù)孔，最終細胞培養(yǎng)液體積200 μL。培養(yǎng)48 h后加入20 μL MTT溶液（濃度5 mg/mL），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后吸棄上清，加入100 μL DMSO溶解沉淀，搖床振蕩5 min，于570 nm波長酶標儀測定吸光度值。

1.2.5 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 雙染標記法檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期HUVECs接種于6孔板中（密度：2.0×105/well），貼壁24 h后分別加入AGEs、丹參酮ⅡA（10 μg/mL）、3-MA（2 mmol/L）等處理因素并收集細胞。按Alexa Fluor 488 Annexin V/PI 凋亡試劑盒說明書操作，重懸細胞后用流式細胞儀FACS Calibur檢測，流式結(jié)果通過軟件BD Cell Quest分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均來自3次以上獨立實驗結(jié)果，計量資料以（x±s）表示，采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間計量資料兩兩比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AGEs及丹參酮ⅡA對內(nèi)皮細胞自噬水平的影響

為明確AGEs及丹參酮ⅡA對內(nèi)皮細胞自噬水平的影響，用100 μg/mL AGEs或10 μg/mL 丹參酮ⅡA處理HUVECs 6 h，與對照組比較，AGEs組及丹參酮ⅡA組的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達量增加，p62表達量下降；AGEs+丹參酮ⅡA組LC3-Ⅱ蛋白表達量繼續(xù)增加，p62蛋白表達量繼續(xù)下降（P<0.05）（圖1）。以上結(jié)果表明AGEs及丹參酮ⅡA均能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬水平升高，并有疊加效應(yīng)。

2.2 丹參酮ⅡA對AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡的影響

2.2.1 MTT比色法測定細胞活性 100 μg/mL的AGEs處理內(nèi)皮細胞48 h，一組與10 μg/mL丹參酮ⅡA共孵育，一組用2 mmol/L 濃度3-MA（自噬抑制劑）提前預(yù)處理30 min，與對照組比較，AGEs組內(nèi)皮細胞活性下降，丹參酮ⅡA組較AGEs組細胞活性升高，3-MA組較AGEs組細胞活性下降，抑制自噬后導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷進一步加重。結(jié)果表明丹參酮ⅡA能夠抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷，自噬在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷中起保護作用。見圖2。

2.2.2 Alexa Fluor 488 Annexin V/PI雙染標記法檢測細胞凋亡 100 μg/mL的AGEs處理內(nèi)皮細胞48 h，一組與10 μg/mL丹參酮ⅡA共孵育，一組用自噬抑制劑3-MA（2 mmol/L）提前30 min共培養(yǎng)預(yù)處理，AGEs組細胞凋亡率明顯升高，丹參酮ⅡA組較AGEs組細胞凋亡率下降，3-MA組較AGEs組細胞凋亡率升高，抑制自噬加劇AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡。以上結(jié)果表明丹參酮ⅡA能夠降低AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡，自噬在AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡中起保護作用。

2.3 丹參酮ⅡA對AKT/mTOR信號通路的作用

為明確丹參酮ⅡA對AKT/mTOR信號通路的影響，我們用10 μg/mL丹參酮ⅡA處理HUVECs，在不同時間點收集細胞（0.5 h、1 h），p-AKT和p-mTOR的表達水平隨著作用時間的延長而下降，說明丹參酮ⅡA能夠抑制AKT/mTOR信號通路，并呈時間依賴性（P<0.05）。見圖4。

3討論

血管內(nèi)皮是血管內(nèi)壁表層由單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成的薄膜，是血管壁的屏障。血管內(nèi)皮細胞損傷與凋亡導(dǎo)致的血管屏障破壞是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的初發(fā)病理環(huán)節(jié)之一[5]。糖尿病患者因代謝異常導(dǎo)致AGEs蓄積，AGEs可通過直接效應(yīng)或與其受體結(jié)合的間接作用導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷及凋亡，增加細胞促凝活性，影響內(nèi)皮細胞舒張功能，并最終導(dǎo)致血管通透性增加，順應(yīng)性下降，加速動脈粥樣硬化過程[6，7]。

丹參酮ⅡA（Tanshinone ⅡA，TⅡ A）是從植物丹參中提取出來的單體成分，具有活血化瘀通絡(luò)的作用，從西醫(yī)角度其具有擴血管、抗血小板聚集、抗炎、抑制細胞凋亡與增殖、抗氧化自由基、增加冠脈血流、促進冠脈側(cè)支循環(huán)形成、降低血壓黏度、改善血液流變學(xué)等作用，因此在心血管領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[8-10]。我們通過MTT及流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡，而調(diào)節(jié)自噬可能是其發(fā)揮保護作用的機制之一。張妮等[11]報道丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)自噬小體信號通路形成相關(guān)蛋白，對ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。

細胞自噬廣泛存在于真核生物的病理生理過程中，其本身是一個動態(tài)的過程：首先，受損的細胞器或大分子被來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜延伸包裹形成細胞自噬體，然后與細胞內(nèi)溶酶體相結(jié)合，形成自噬溶酶體，降解所包含內(nèi)容物供給自身代謝需要并維持細胞穩(wěn)態(tài)[12-14]。適度的自噬是細胞正常生理過程所必需的，但過度的自噬可能對細胞有保護作用，也可能加速細胞損傷，在疾病的不同階段，自噬的作用也不同，在缺血/再灌注損傷中，缺血階段心肌細胞自噬增強，高水平的自噬對心肌細胞具有保護作用，減少心肌細胞損傷，進入再灌注階段后，細胞自噬水平進一步升高，此時過度增強的自噬對心肌細胞造成進一步損傷[15]。多種信號通路能調(diào)控細胞自噬水平，其中mTOR（mechanistic target of rapamycin，mTOR）相關(guān)信號通路的研究較為透徹，也是最重要的一條通路，mTOR是一個保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，當其磷酸化水平升高后對自噬水平進行負性調(diào)節(jié)，在mTOR上游，AKT通過TSC1/2（tuberous sclerosis1/2）或PRAS40依賴的途徑激活mTOR，對mTOR進行正向調(diào)節(jié)并抑制自噬[16-18]。

Verma N等[19]報道晚期糖基化產(chǎn)物通過激活RAF蛋白激酶及NF-κB從而激活細胞自噬水平。Ma M等[20]研究發(fā)現(xiàn)晚期糖基化產(chǎn)物通過減少組織蛋白酶D促進大鼠血管平滑肌細胞增殖并抑制其自噬水平。Takahashi A等[21]發(fā)現(xiàn)自噬通過抑制腎臟近端小管溶酶體形成和功能從而抑制晚期糖基化產(chǎn)物的蓄積。本課題小組一直從事自噬與AGEs導(dǎo)致的心血管并發(fā)癥相關(guān)研究。前期研究發(fā)現(xiàn)：AGEs誘導(dǎo)的自噬參與AGEs誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖，其中AKT和ERK/MAPK信號通路發(fā)揮了重要作用[22]；AGEs通過AKT/mTOR和ERK/MAPK信號通路誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞自噬水平升高，通過AKT/mTOR和P38/MAPK信號通路誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞凋亡增加，自噬在AGEs誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡中起保護作用[23]；AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞自噬水平增強，增強的自噬能抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡[3]。通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能對抗AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，其機制可能是通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號通路從而調(diào)節(jié)細胞自噬水平。

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（收稿日期：2017-05-11）