枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株液體發(fā)酵條件優(yōu)化篩選

洪亮+胡金碧+魯海菊+張海燕+李麗莎

摘要：為弄清枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株最佳發(fā)酵條件，以分離自枇杷主干韌皮部的內(nèi)生木霉P3.9菌株為供試菌株，以菌絲生長量為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗，篩選最佳組合液體發(fā)酵培養(yǎng)液，碳源、氮源、pH及其接種量。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)液為馬鈴薯浸汁，碳源為D-果糖，氮源為磷酸二氫銨，pH 7.0，接種量為1.5%；正交試驗表明其菌絲生長的最佳組合培養(yǎng)條件為馬鈴薯浸汁，在其中添加2%D-果糖、0.05%磷酸二氫銨、pH 6.0、接種量為1.5%。按優(yōu)化后的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，最高菌絲干重可達(dá)5.1 mg/mL。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生菌；木霉；液體發(fā)酵；菌絲干重

中圖分類號：S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）14-2670-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.017

Abstract： In order to make clear optimal conditions of liquid fermentation for Trichoderma strain P3.9，Taking Trichoderma strain P3.9 isolated from trunk phloem of loquat as material，optimal substrates and its concentration of medium，including carbon source，nitrogen source，pH and inoculation count were studied according to the mycelial production by simple factor and orthogonal experiments，in order to screen out the best liquid fermentation for P3.9 strain. The results showed that the proper medium was potato juice； Carbon source was D-fructose； Nitrogen source was ammonium phosphate monobasic； pH was 7.0；Inoculation count was 1.5%. The orthogonal experiment indicated that optimal medium of the highest yields of mycelia consisted potato juice，2% D-fructose. 0.05% was ammonium phosphate monobasic. pH was 6.0. Inoculation count was 1.5%. By the optimal medium and culture conditions，the maximum mycelial yield was 5.1 mg/mL.

Key words： endophyte； Trichoderma； liquid fermentation； mycelial dry weight

植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，可通過競爭或其他作用來抑制或殺死各種致病菌[1]。在印楝[2]、銀杏[3]、曼陀羅[4]、萬壽菊[5]等藥用植物中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌。枇杷（Eriobotrya japonica）為薔薇科常綠喬木，其花、果、葉、根和樹皮均可入藥，具有抗炎和止咳的作用[6]。魯海菊等[7，8]在枇杷中也發(fā)現(xiàn)若干株內(nèi)生真菌。枇杷果實果肉柔軟多汁，酸甜適度，營養(yǎng)豐富。已成為浙江、福建、臺灣、四川、云南等省市主要果樹之一。隨著大面積連片種植枇杷樹苗，苗期和成株期枇杷病害逐年增加。近年來，在臺灣[9]、福建[10]及云南[11]，枇杷根腐病嚴(yán)重阻礙了枇杷產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而化學(xué)防治難以有效控制此土傳病害。

木霉是重要的生防因子之一。內(nèi)生木霉與其他腐生木霉相比，受到宿主組織的良好保護(hù)，更易于發(fā)揮生防作用。魯海菊等[12]從枇杷主干韌皮部中，發(fā)現(xiàn)1株能抑制枇杷根腐病菌的內(nèi)生木霉P3.9，經(jīng)顯微形態(tài)觀察及ITS測序，鑒定為深綠木霉（Trichoderma atroviride），此菌株同時能抑制枇杷內(nèi)生真菌[13]及其根際土壤真菌[14]，抗菌譜廣[15]，能成功定殖于枇杷植株及其根際土壤。因此，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株有望作為生防菌株來開發(fā)應(yīng)用。其固體發(fā)酵條件[16]已明確，鑒于固體發(fā)酵產(chǎn)品有效成分以木霉孢子為主，不耐儲藏，加之木霉P3.9菌株對枇杷有促生作用，液體發(fā)酵產(chǎn)品比固體發(fā)酵產(chǎn)品更容易被枇杷根部吸收利用。因此，本試驗以更耐儲藏的木霉菌絲產(chǎn)量為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗方法[17]，篩選P3.9菌株液體發(fā)酵最佳組合條件，為研制和開發(fā)生防木霉液體菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株，是從云南省蒙自市枇杷種植基地采集枇杷根莖韌皮部，采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離純化[18，19]獲得，置于斜面培養(yǎng)基低溫（4 ℃）保存?，F(xiàn)保存于云南省紅河學(xué)院植物病理教學(xué)實驗室。

1.1.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)液 PD（馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液）：20%馬鈴薯浸汁，2%葡萄糖，去離子水1 000 mL；PS（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)液）：20%馬鈴薯浸汁，2%蔗糖，去離子水1 000 mL；CD（胡蘿卜葡萄糖培養(yǎng)液）：20%胡蘿卜浸汁，2%葡萄糖，去離子水1 000 mL；BD（香蕉葡萄糖培養(yǎng)液）：20%香蕉浸汁，2%葡萄糖，去離子水1 000 mL；培養(yǎng)液A：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，K2HPO4 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，去離子水1 000 mL；CM：蔗糖30.00 g，NaNO3 2.00 g，K2HPO4 1.00 g，KCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，去離子水1 000 mL。

1.1.3 藥品與試劑 碳源包括麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、可溶性淀粉、D-甘露醇，氮源包括硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、尿素、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、甘氨酸、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨，酸鹽、氫氧化鈉。上述材料均購自農(nóng)貿(mào)市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 測定不同液體發(fā)酵培養(yǎng)液對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響 將P3.9木霉菌株在PDA平板培養(yǎng)基中28 ℃恒溫擴大培養(yǎng)3 d，用去離子水沖洗孢子，制成孢子液（1.5×106個/mL）備用[18]，分別在500 mL錐形瓶中加入100 mL上述6種不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)液（121 ℃高壓滅菌25 min），同時接種1 mL上述準(zhǔn)備好的孢子懸液，于28 ℃、光暗交替、180 r/min搖床培養(yǎng)7 d，然后真空抽濾菌絲體，60 ℃烘箱烘干至恒重，進(jìn)行稱量。每個處理設(shè)5個重復(fù)。

1.2.2 碳源和氮源對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響 以PD為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳（麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖、可溶性淀粉、D-甘露醇）和氮（硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨、尿素、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、甘氨酸、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨）替換蔗糖和硝酸鈉。接種、培養(yǎng)和測量方法同“1.2.1”。

1.2.3 pH對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響 以PD為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉將pH分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9和10。接種、培養(yǎng)和測量方法同“1.2.1”。

1.2.5 不同接種量對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響 以PD為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別接種0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL P3.9木霉孢子液，接種、培養(yǎng)和測量方法同“1.2.1”。

1.2.7 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，做4因素3水平L9（34）的正交試驗（表1），滅菌、孢子液制備、接種、培養(yǎng)和測量方法同“1.2.1”。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體發(fā)酵培養(yǎng)液對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響

由表2可知，P3.9菌株在不同培養(yǎng)液中均能生長，但其菌絲產(chǎn)量差異極顯著。其中，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中菌絲干重最大，表明馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液最適合其菌絲生長。其余培養(yǎng)液菌絲干重表現(xiàn)為CD>PS>BD>培養(yǎng)液A>CM。

2.2 不同碳源對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響

由表3可知，P3.9菌株在不同碳源培養(yǎng)液中均能生長，但其菌絲產(chǎn)量差異極顯著。其中，D-果糖培養(yǎng)液中菌絲干重最大，說明D-果糖最適合其菌絲生長。其余碳源中菌絲干重表現(xiàn)為葡萄糖>可溶性淀粉>D-甘露醇>麥芽糖>α-乳糖>蔗糖。

2.3 不同氮源對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響

由表4可知，P3.9菌株在不同氮源培養(yǎng)液中均能生長，其中，磷酸二氫銨中菌絲產(chǎn)量與其他氮源差異極顯著，菌絲干重最大，表明磷酸二氫銨最適合其菌絲生長。硫酸銨和酵母膏中菌絲產(chǎn)量差異不顯著，硝酸鈉、硝酸銨、磷酸二氫鉀和甘氨酸中菌絲產(chǎn)量差異不顯著，牛肉膏、蛋白胨和尿素之間及其與其他氮源差異極顯著。其中，尿素中菌絲干重最小，說明尿素最不適合其菌絲生長。

2.4 不同pH對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響

由表5可知，P3.9菌株在不同pH中均能生長，但其菌絲產(chǎn)量差異極顯著。其中，pH 7時菌絲干重最大，其余菌絲干重表現(xiàn)為pH 6>pH 5>pH 4>pH 3>pH 8>pH 9>pH 10。表明pH 7最適合其菌絲生長，其次是pH 6和pH 5。

2.5 不同接種量對枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株菌絲產(chǎn)量的影響

由表6可知，P3.9菌株在接種量為1.0和1.5 mL、2.5和3.0 mL時，兩兩之間菌絲產(chǎn)量差異不顯著，接種量為0.5 mL和2.0 mL與其余接種量中菌絲產(chǎn)量差異極顯著。菌絲干重表現(xiàn)為1.0 mL=1.5 mL>0.5 mL >2.0 mL>2.5 mL=3.0 mL。表明接種量為1.0 mL（1%）或1.5 mL（1.5%）最適合其菌絲生長，其次是接種量為0.5 mL（0.5%）。

2.6 正交試驗結(jié)果

由表7可知，P3.9菌株在9種配方中均能生長，其中配方4菌絲產(chǎn)量與其他配方差異極顯著，菌絲干重最大，表明配方4最適合其菌絲液體發(fā)酵，即最佳組合為A2B1C2D3，即2%D-果糖，0.05%磷酸二氫銨，pH 6，接種量1.5%。4個因素中D-果糖和接種量對其菌絲產(chǎn)量影響最大。

3 小結(jié)與討論

枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株在液體培養(yǎng)條件下生長良好，其菌絲體生物產(chǎn)量與培養(yǎng)條件密切相關(guān)，尤其受碳源及接種量的影響最為顯著。其液體發(fā)酵最佳組合條件為馬鈴薯浸汁、添加2%D-果糖、0.05%磷酸二氫銨、pH 6、1.5%接種量，最高菌絲干重可達(dá)5.1 mg/mL。P3.9菌株固體發(fā)酵[16]以木霉孢子量為計測指標(biāo)，液體發(fā)酵以木霉菌絲干重為指標(biāo)。菌絲比孢子耐儲藏，液體發(fā)酵產(chǎn)品比固體發(fā)酵產(chǎn)品更容易被枇杷根部吸收利用。固、液體發(fā)酵最佳碳、氮源基本一致，接種量不一致，液體發(fā)酵接種量少于固體發(fā)酵接種量（5%）。P3.9菌株固體發(fā)酵最佳溫度[16]為28 ℃，因此本試驗培養(yǎng)溫度同樣采用28 ℃。參照鉤狀木霉（T. hamatum）Th12菌株[20]最佳搖床轉(zhuǎn)速，本試驗搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為180 r/min。Th12菌株[20]菌絲液體發(fā)酵最佳碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，與此菌株不一致，pH、接種量與P3.9菌株一致。木霉厚垣孢子最耐儲藏，有研究表明哈茨木霉[21]液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子的最佳基質(zhì)為玉米粉，氮源為酵母膏，與此菌株不一致，最佳溫度與P3.9菌株一致（28 ℃）。長枝木霉[22]液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子的最佳溫度為28 ℃，pH為5。表明不同木霉菌株適合的液體發(fā)酵條件存在差異。該研究對木霉P3.9菌株液體發(fā)酵主要影響因素碳源、氮源、pH及接種量進(jìn)行了優(yōu)化，為深入研究其產(chǎn)孢、孢子類型及發(fā)酵代謝產(chǎn)物提供參考依據(jù)。

木霉是防治作物土傳病害的重要拮抗真菌，研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)存在內(nèi)生木霉真菌，在可可[23]、茶樹[24]、蘆竹[25]、蘆薈[26]、南方紅豆杉[27]等植物中成功分離到內(nèi)生木霉真菌。其中，蘆竹和南方紅豆杉中分離的內(nèi)生木霉分別對煙草赤星病和水稻紋枯病有很好的防治效果。研究還發(fā)現(xiàn)從其他地方分離的木霉菌株能在可可莖上定殖，與其形成共生關(guān)系，最終成為宿主的內(nèi)生真菌[28]。表明不管是土著的內(nèi)生木霉還是從外界引入的木霉，都能與宿主形成共生關(guān)系，最終成為宿主的內(nèi)生真菌，對宿主有促生、抗病等作用[29]。近年來，用宿主內(nèi)生木霉防治宿主植物病害的研究已成為綠色防控研究熱點。如茶樹內(nèi)生木霉防治茶葉斑病[24]、黃瓜內(nèi)生木霉防治黃瓜枯萎病[30]、香蕉內(nèi)生木霉防治香蕉枯萎病[31]等。魯海菊等[13]用枇杷內(nèi)生木霉防治枇杷根腐病，發(fā)現(xiàn)枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株能成功定殖于枇杷植株及其根際土壤，對枇杷有防病促生作用。其作用機理及其菌劑使用技術(shù)還待進(jìn)一步研究。

枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株液體發(fā)酵最佳組合條件為馬鈴薯浸汁，添加2%D-果糖、0.05%磷酸二氫銨，pH 6，1.5%接種量，光暗交替28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7 d。最高菌絲干重可達(dá)5.1 mg/mL。其菌劑有效成分以木霉菌絲為主，比其孢子耐儲藏。厚垣孢子比菌絲更耐儲藏，P3.9菌株液體發(fā)酵產(chǎn)厚垣孢子的最佳組合條件有待進(jìn)一步研究。

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