深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 抑菌活性及對(duì)番茄幼苗促生效果研究

梁 松，王建霞，魏甜甜，張靜蕾，胡春艷，姚艷平

（1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801；2．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

化學(xué)防治一直在植物病害防治中扮演重要的角 色，但近年來(lái)，長(zhǎng)期化學(xué)防治帶來(lái)的問(wèn)題越來(lái)越被人們所重視，例如農(nóng)藥殘留和生態(tài)環(huán)境污染等問(wèn)題。生物防治作為一種安全環(huán)保的防治措施，而成為目前防治植物病害研究工作的熱點(diǎn)。木霉菌（spp.）是一種重要的生防真菌，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用、產(chǎn)生抑菌次生代謝產(chǎn)物、重寄生作用、促生作用以及誘導(dǎo)植物抗病性等機(jī)理達(dá)到防治植物病害的目的，因此木霉菌也被譽(yù)為最具開(kāi)發(fā)潛力的生防菌。

木霉菌作為生防真菌已被廣泛報(bào)道，自從Oros等于1932 年首次發(fā)現(xiàn)木霉對(duì)土壤中的幾種真菌具有拮抗作用后，人們開(kāi)始逐漸認(rèn)識(shí)到木霉菌可以抑制植物病害并且促進(jìn)植物生長(zhǎng)。20 世紀(jì)80 年代，研究人員在木霉研究和應(yīng)用方面就有過(guò)諸多報(bào)道，20 世紀(jì)90 年代至今，木霉菌在植物病害防治和促生方面的研究更加深入。Kottb 等發(fā)現(xiàn)，利用棘孢木霉（）的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6PP）處理擬南芥（），激活了擬南芥的防御反應(yīng)，減輕了對(duì)灰霉菌（）和十字花科鏈格孢病菌（）的侵染。Kishimoto 等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)綠色木霉（）的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物1-辛烯-3-醇處理擬南芥后，通過(guò)激活茉莉酸（JA）依賴的防御途徑，增強(qiáng)了擬南芥對(duì)病原體的抗性。Malmierca 等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)哈茨木霉（）的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物Trichodiene 處理番茄后，上調(diào)了植物防御相關(guān)基因，尤其是水楊酸（SA）相關(guān)基因。

番茄（）是我國(guó)重要的蔬菜品種之一，其不僅含有多種營(yíng)養(yǎng)成分而且還具有防癌抗癌的作用，因而成為人們生活中常見(jiàn)的一種蔬菜。在北方，番茄種植主要以保護(hù)地栽培為主。由于設(shè)施連作次數(shù)的增加和不合理的施肥灌溉等農(nóng)藝措施，引起番茄品質(zhì)變差、產(chǎn)量下降等問(wèn)題，成為設(shè)施栽培番茄的主要障礙。應(yīng)用微生物改善植物根際生態(tài)環(huán)境是目前研究的熱點(diǎn)。目前常見(jiàn)的微生物包括木霉菌（spp.）、芽孢桿菌（spp.）和假單胞菌（spp.）等，這些微生物可以通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和土壤生物修復(fù)等途徑改善土壤微生態(tài)環(huán)境。

本研究以深綠木霉（）T1和哈茨木霉（）T21 為研究對(duì)象，測(cè)定其對(duì)7 種植物病原真菌的抑菌活性，同時(shí)通過(guò)灌根法研究其對(duì)溫室連作土壤狀態(tài)下番茄幼苗的促生效果，為進(jìn)一步深入研究木霉抑菌和促生機(jī)理提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試木霉菌株 深綠木霉（）T1、哈茨木霉（）T21，均分離自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站溫室土壤。

1.1.2 供試植物病原真菌 尖孢鐮刀菌番茄專化型（f.sp.）、番茄早疫病菌（）、芒果炭疽病菌（）、蘋 果 輪 紋 病 菌（）、禾谷鐮刀菌（）、串珠鐮刀菌（）、玉米鏈格孢葉枯病（），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），以上培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓滅菌后使用。

1.1.4 供試番茄種子 番茄種子品種：‘東圣一號(hào)’。

1.1.5 供試土壤 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站常年種植番茄的溫室連作土壤。

1.2 木霉菌對(duì)病原真菌的拮抗作用研究

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定木霉菌對(duì)病原菌的拮抗作用，取活化后直徑約為5 mm 的病原菌菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基，在距離病原菌菌餅5 cm 處放置5 mm 木霉菌餅，以不接種木霉菌為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，7 d 后計(jì)算抑菌率。

抑菌率＝（對(duì)照病原菌的直徑－對(duì)峙培養(yǎng)病原菌的直徑）/對(duì)照病原菌的直徑×100%。

1.3 木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌效果研究

采用平板對(duì)扣法測(cè)定木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌活性，將5 mm 木霉菌餅接到PDA 培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d 后，在PDA 培養(yǎng)基上接種5 mm 病原菌菌餅，將生長(zhǎng)3 d 的木霉皿底與接種病原菌菌餅的皿底對(duì)扣，中間間隔一層玻璃紙。放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，以不對(duì)扣為對(duì)照，計(jì)算抑菌率。抑菌率的計(jì)算方法參考1.2。

1.4 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌效果研究

1.4.1 木霉菌無(wú)菌發(fā)酵液的制備 將木霉菌株接入PDB 培養(yǎng)基，置于28 ℃，180 r·min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，先將培養(yǎng)液通過(guò)無(wú)菌紗布過(guò)濾大部分菌絲，再經(jīng)過(guò)12 000 r·min離心10 min，使雜質(zhì)沉淀，取上清液，過(guò)0.22 μm 無(wú)菌濾膜，獲得無(wú)菌發(fā)酵液。將獲得的發(fā)酵液保存至4 ℃冰箱。

1.4.2 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn) 采用固體稀釋法測(cè)定，將發(fā)酵液與熔融的PDA 培養(yǎng)基（55 ℃）按1∶2 混勻后，均勻倒入平板中，以加入無(wú)菌水作為對(duì)照，待培養(yǎng)基凝固后，用直徑為5 mm 的打孔器取植物病原真菌菌餅置于培養(yǎng)基中間，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理重復(fù)3 次，采用十字交叉法計(jì)算菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。抑菌率的計(jì)算方法參考1.2。

1.4.3 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑制病原菌孢子萌發(fā)試驗(yàn) 參考凹玻片法并加以改進(jìn)，制備病原菌孢子懸浮液（1×10個(gè)·mL），取無(wú)菌1.5 mL 離心管，加入600 μL 病原菌孢子懸浮液和600 μL 木霉菌無(wú)菌發(fā)酵液，充分混勻，以加無(wú)菌水作為對(duì)照，取60 μL 混合液置于滅菌凹玻片中，放入鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃培養(yǎng)，分別在8 h 后鏡檢，每個(gè)處理重復(fù)3 次，觀察孢子萌發(fā)情況，以孢子芽管的長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑的1/2 記作已萌發(fā)的孢子。

孢子萌發(fā)率＝孢子萌發(fā)數(shù)/總孢子數(shù)×100%

孢子萌發(fā)抑制率＝（對(duì)照孢子萌發(fā)率－處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%

1.5 木霉菌對(duì)番茄幼苗促生效果研究

木霉分生孢子懸浮液的制備：將木霉菌T1、T21 置于PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，加無(wú)菌水制成分生孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子濃度為1×10個(gè)·mL。

先將番茄種子進(jìn)行育苗，長(zhǎng)至四葉一心后進(jìn)行移栽，將長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄幼苗移栽至帶土盆缽內(nèi)，盆缽直徑11.7 cm，高9.5 cm，每盆裝土500 g，移植四葉一心的番茄幼苗。放置于光照培養(yǎng)箱中，光周期為14 h 白光（光照強(qiáng)度30 000 lx），10 h 黑夜，白天溫度28 ℃，晚上溫度20 ℃。移栽后3 d，進(jìn)行木霉孢子懸浮液灌根處理，每2 d 灌根1 次，共灌根3 次，每次每株灌根10 mL 孢子懸浮液，以灌無(wú)菌水作為對(duì)照，統(tǒng)一定期澆水。各處理15 盆，15 d 后統(tǒng)計(jì)相關(guān)生長(zhǎng)和生理指標(biāo)。

生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定，株高：子葉節(jié)到生長(zhǎng)點(diǎn)的長(zhǎng)度，單位cm，用游標(biāo)卡尺測(cè)定；莖粗：子葉節(jié)的粗度，單位cm，用游標(biāo)卡尺測(cè)定；根長(zhǎng)：根基部到最長(zhǎng)須根之間的距離，單位cm，用游標(biāo)卡尺測(cè)定；植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量：植株用清水反復(fù)清洗，再用吸水紙充分吸干水分，測(cè)定鮮質(zhì)量，測(cè)定完鮮質(zhì)量后，將植株放置于105 ℃烘箱中殺青15 min 后，在80 ℃恒溫烘箱下烘至恒重，用千分之一電子天平測(cè)定干質(zhì)量和鮮質(zhì)量。

生理指標(biāo)測(cè)定，葉綠素含量：利用葉綠素測(cè)定儀測(cè)定葉片的SPAD 值；根系活力：采用TTC 法測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌與植物病原真菌平板對(duì)峙試驗(yàn)

由表1 和圖1 可知，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對(duì)7 種病原菌均具有一定的抑菌效果。其中深綠木霉T1 對(duì)玉米葉枯病菌抑菌效果最好，抑菌率為86.16%。哈茨木霉T21 對(duì)7 種病原菌的抑菌率均在80%以上，其中對(duì)芒果炭疽病菌的抑菌效果最好，抑菌率為91.82%。哈茨木霉T21 對(duì)7 種病原菌的平板對(duì)峙效果均高于深綠木霉T1，說(shuō)明哈茨木霉T21 在對(duì)峙培養(yǎng)中對(duì)病原菌的抑制效果強(qiáng)于深綠木霉T1。這可能是因?yàn)楣哪久筎21 在PDA 上生長(zhǎng)速度極快，能夠迅速占據(jù)空間從而達(dá)到抑菌效果。其次哈茨木霉T21 能夠在與病原菌接觸后，產(chǎn)生黃色色素或直接利用病原菌菌絲進(jìn)行生長(zhǎng)，說(shuō)明哈茨木霉T21 能夠產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物并且能夠寄生于病原菌菌絲。

圖1 木霉菌對(duì)病原菌的平板對(duì)峙結(jié)果

表1 木霉菌對(duì)病原菌的平板對(duì)峙結(jié)果

2.2 木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌的抑菌效果

由表2 可知，深綠木霉T1 的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)7 種病原菌均具有一定的抑菌活性。其中，深綠木霉T1 對(duì)玉米穗腐病菌的抑菌效果最差，抑菌率為39.78%；對(duì)芒果炭疽病菌的抑菌效果最好，抑菌率為76.78%。哈茨木霉T21 的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)7 種病原菌均沒(méi)有抑菌效果，可能是因?yàn)楣哪久筎21 揮發(fā)性物質(zhì)中并沒(méi)有對(duì)病原菌有抑制作用的物質(zhì)。

表2 木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌效果

2.3 木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌的抑菌效果

2.3.1 木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3 可知，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均對(duì)7 種病原菌均具有一定的抑菌活性。其中，深綠木霉T1 對(duì)番茄早疫病菌的抑制效果最好，抑菌率為75.22%；哈茨木霉T21對(duì)番茄枯萎病菌抑菌效果最好，抑菌率為79.21%。

表3 木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)效果

2.3.2 木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)植物病原菌孢子萌發(fā)的影響 由表4 可知，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)7 種病原菌均具有一定的抑制效果。其中，深綠木霉T1 對(duì)番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)抑制率最高，可達(dá)76.69%，其對(duì)番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌的孢子萌發(fā)抑制率也均達(dá)到70%以上；哈茨木霉T21 對(duì)番茄枯萎病菌孢子萌發(fā)抑制率最高，可達(dá)100%，其對(duì)玉米穗腐病菌和芒果炭疽病菌也具有較好的孢子抑制萌發(fā)率，抑制率可達(dá)98.07%，97.41%。

表4 木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑制病原菌孢子萌發(fā)效果

2.4 木霉菌對(duì)番茄幼苗的促生效果研究

2.4.1 木霉菌對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的促生效果研究由表5 和圖2 可知，經(jīng)過(guò)深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 灌根后，在株高方面，經(jīng)哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄幼苗株高分別達(dá)到13.10，11.80 cm，相較于對(duì)照處理分別提高29.19%，16.37%；在根長(zhǎng)方面，經(jīng)哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄根長(zhǎng)分別達(dá)到23.41，22.22 cm，相較于對(duì)照處理分別提高42.14%，34.91%；在莖粗方面，經(jīng)哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄莖粗分別達(dá)到0.56，0.53 cm，相較于對(duì)照處理分別提高14.59%，8.16%；在植株鮮質(zhì)量方面，經(jīng)哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄植株鮮質(zhì)量分別達(dá)到19.05，16.01 g，相較于對(duì)照處理分別提高55.00%，30.27%；在植株干質(zhì)量方面，經(jīng)哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄植株干質(zhì)量分別達(dá)到1.92，1.30 g，相較于對(duì)照處理分別提高69.91%，15.04%。

表5 木霉灌根處理下番茄幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)

圖2 木霉菌對(duì)番茄幼苗的促生效果研究

2.4.2 木霉菌對(duì)番茄幼苗生理指標(biāo)的促生效果研究由表6 可知，在根系活力方面，經(jīng)哈茨木霉T21 處理的番茄幼苗根系活力達(dá)到2.26 mg·g·h，顯著高于深綠木霉T1 處理和對(duì)照處理，相較于對(duì)照處理提高69.92%，深綠木霉T1 處理和對(duì)照處理之間在番茄幼苗根系活力方面無(wú)顯著性差異；在SPAD 方面，經(jīng)哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理的番茄幼苗葉片SPAD 值均顯著高于對(duì)照處理，相較對(duì)照處理分別提高20.97%，20.75%。

表6 木霉灌根處理下番茄幼苗的生理指標(biāo)

3 結(jié)論與討論

本文研究了深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對(duì)7種病原菌的抑菌活性以及對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 在平板對(duì)峙試驗(yàn)中，均能夠占據(jù)營(yíng)養(yǎng)空間從而達(dá)到抑菌目的，其中哈茨木霉T21 對(duì)7 種病原菌的抑菌活性均高于深綠木霉T1，說(shuō)明哈茨木霉T21 在平板對(duì)峙試驗(yàn)中的抑菌效果優(yōu)于深綠木霉T1。在揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)中，深綠木霉T1 對(duì)7 種病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，而哈茨木霉T21 的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物并沒(méi)有抑菌活性，說(shuō)明深綠木霉T1 在揮發(fā)性物質(zhì)上的抑菌能力高于哈茨木霉T21。在非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物試驗(yàn)中，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對(duì)7種病原菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，說(shuō)明2 株木霉的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中均存在抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)和病原菌孢子萌發(fā)的物質(zhì)。在對(duì)番茄幼苗的促生試驗(yàn)中，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對(duì)番茄幼苗的相關(guān)生長(zhǎng)指標(biāo)和生理指標(biāo)均有促進(jìn)作用，說(shuō)明在溫室連作土壤狀態(tài)下，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21均對(duì)番茄具有促生效果。

木霉菌具有多種生防機(jī)理，且多種生防機(jī)理相互配合。劉佳等利用平板對(duì)峙和木霉代謝產(chǎn)物的活性測(cè)定長(zhǎng)枝木霉T6 對(duì)黃瓜枯萎病的抑菌效果，并經(jīng)過(guò)室內(nèi)防效測(cè)定其生防效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)枝木霉T6 對(duì)黃瓜枯萎病的室內(nèi)盆栽防效為69.06%，具有較好的生防效果。王子晴等通過(guò)測(cè)定木霉對(duì)菌核病菌的MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性和POD活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)木霉處理后，菌核病菌的MDA含量顯著增加、CAT、SOD 和POD 活性均有所下降，表明木霉處理能夠使病原菌氧自由基增加，抗氧化系統(tǒng)破壞，最終導(dǎo)致病原菌死亡。陳迪等通過(guò)測(cè)定木霉幾丁質(zhì)酶的活性來(lái)分析生防木霉菌株的抑菌活性。由于幾丁質(zhì)是病原菌細(xì)胞壁的主要成分，生防木霉菌可以通過(guò)分泌幾丁質(zhì)酶來(lái)裂解病原菌細(xì)胞壁從而使其死亡。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示，木霉能夠產(chǎn)生70 種以上次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括烴類、醇類、內(nèi)酯、呋喃烷、酮類、醛類、酯類、芳香族化合物、雜環(huán)化合物和各種萜類化合物以及木霉素、抗菌肽和膠霉素等抗生素。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在木霉生物防治過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的平板對(duì)峙及代謝產(chǎn)物對(duì)7 種病原菌均具有較好的效果，可能是因?yàn)樯罹G木霉T1 和哈茨木霉T21 可以通過(guò)空間營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)以及產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物等生防機(jī)理協(xié)同拮抗病原菌。但本研究未能分析具體是哪一種次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)揮了抑菌作用，也未能測(cè)定深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的室外生防潛力，只測(cè)定出深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 具有較好的離體抑菌效果。這些都是今后要深入研究的方向。

促生作用也是木霉菌生防機(jī)理的一個(gè)重要方面，因?yàn)槟久咕旧砭褪且环N重要的植物根際共生微生物，所以木霉對(duì)很多植物都具有促生效果。許多木霉可以產(chǎn)生植物激素（生長(zhǎng)素、赤霉素），以及產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1 羧酸脫氨酶（ACC）調(diào)節(jié)植物體內(nèi)乙烯水平。另外，木霉菌可以產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)刺激植物生長(zhǎng)發(fā)育。Vinale 等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)哈茨木霉（） 的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物harzianum acid 處理番茄后，顯著促進(jìn)了番茄幼苗的生長(zhǎng)，提高種子發(fā)芽率。Ruocco 等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)長(zhǎng)枝木霉（）的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物Hydrophobin 處理煙草和番茄后，誘導(dǎo)并激活了煙草和番茄體內(nèi)防御相關(guān)反應(yīng)，包括產(chǎn)生活性氧（ROS）和其他化合物，并刺激植物根的形成和生長(zhǎng)。本研究采用的土壤為溫室番茄連作土壤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 處理后，番茄相關(guān)生長(zhǎng)和生理指標(biāo)均高于對(duì)照處理，說(shuō)明深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 具有較好的促生效果，但未能研究2 株木霉對(duì)番茄幼苗的促生機(jī)理，這也是今后要深入研究的方向。