木霉分生孢子和厚垣孢子對黃瓜葉片抗氧化系統(tǒng)及枯萎病防效的影響

廉 華，馬光恕，靳亞忠，李 梅，張 帆

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學園藝園林學院，黑龍江 大慶 163319；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100081)

黃瓜(CucumissativusL.)是設施栽培的主要蔬菜之一，2017年黃瓜設施栽培面積58.29萬公頃，占黃瓜總面積的47.85%[1]。由于黃瓜種植面積逐漸增大，土傳病害如黃瓜枯萎病發(fā)生逐漸加重[2]。黃瓜枯萎病是一種土壤傳播的真菌性病害，病原為尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum，F(xiàn)OC)[3]，在我國各地黃瓜種植區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病率一般在10%～20%，重者可以達到80%～90%[4]，日益成為影響黃瓜生產(chǎn)安全的主要病害。黃瓜枯萎病在生產(chǎn)上一直以化學防治為主，但隨著人們環(huán)保意識加強，選擇生物技術手段進行枯萎病預防和控制逐漸為業(yè)內(nèi)所關注，其中利用木霉菌成為防治黃瓜枯萎病的有效手段之一[5]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是廣泛應用的植病生防真菌，對多種植物病原真菌特別是土傳病原真菌有較好的拮抗作用，包括立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鐮刀菌(Fusariumspp.)、疫霉菌(Phytophthoraspp)等[6]。木霉菌可以分泌細胞壁降解酶類和次級代謝產(chǎn)物，誘導植物抗性，促進植物生長和提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，廣泛用于生物肥料和生物制劑生產(chǎn)中[7-8]，在世界真菌殺菌劑市場已經(jīng)占據(jù)50%的市場份額[9]。

利用生防木霉菌防治枯萎病已有了較多的研究報道，如盧德鵬等[10]利用2×108cfu·g-1濃度的木霉菌可濕性粉劑設置5 000、7 500、15 000 g·hm-2劑量，施藥后90 d，對番茄枯萎病的防效分別達到了64.41%、60.84%和71.10%，而對照的防效僅能達到56.65%，說明木霉菌對番茄枯萎病具有較好的防治效果；趙玳琳等[11]利用4株生防木霉菌(GYXM-1p1、GYSW-3m1、KLSD-8m3 和GYYC-15p2)進行甘藍黑腐病大田防效試驗，結果顯示GYYC-15p2菌株的防效可達到79.16%，在4株木霉菌中表現(xiàn)最強；魯海菊等[12]利用內(nèi)生木霉P3.9 處理枇杷后，發(fā)現(xiàn)其對枇杷根腐病的防效可達80%以上。

生防菌防病的基礎條件是誘導植物抗性，而植物抗性主要通過防御酶系統(tǒng)的應答體系表現(xiàn)出來，防御酶系統(tǒng)主要包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)等，防御酶活性與植物抗病性之間有著密切的相關性[13]。膜脂過氧化作用會引起細胞膜的傷害，主要是因為膜中的蛋白質(zhì)和類脂物質(zhì)變化而導致的。當植物感病后，會引起膜脂的過氧化作用，造成細胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲，質(zhì)膜透性增大[14]，相對電導率增加幅度與脅迫強度和植物抗病能力緊密相關。丙二醛(MDA)作為膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，對植物細胞會產(chǎn)生一定程度的氧化脅迫，導致細胞膜系統(tǒng)遭受傷害，研究中MDA和質(zhì)膜透性都可以作為膜脂過氧化作用強弱的指標，在植物的抗病應答中發(fā)揮重要作用[15]。祝久香[16]研究菌株HX-140對黃瓜枯萎病對黃瓜防御反應酶系的影響，結果表明，單獨施加黃瓜枯萎病菌培養(yǎng)液或HX-140菌懸液，或者同時施加黃瓜枯萎病菌培養(yǎng)液和HX-140菌懸液均能使黃瓜葉片內(nèi)的CAT、POD、PPO、PAL、SOD等酶活性在48～72 h內(nèi)持續(xù)升高達到峰值。其中同時施加黃瓜枯萎病菌培養(yǎng)液和HX-140菌懸液的黃瓜葉片內(nèi)CAT、POD、PPO、PAL、SOD的酶活性分別為不接種任何菌液處理的黃瓜葉片的6.14、1.57、1.87、1.88、2.73倍。李聰[17]利用哈茨木霉TH發(fā)酵液處理蘆筍，發(fā)現(xiàn)5倍稀釋濃度對蘆筍根中SOD、POD、CAT、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性具有明顯提升作用，含量分別為對照的5.89、2.32、3.12、5.21、1.22倍，而MDA含量則最低，對照是其2.5倍。

以上研究多從木霉菌的防病效果、氧化酶體系作用等方面開展的單一研究，對木霉菌孢子不同形態(tài)施用效果的研究較少。本研究通過前期篩選試驗，選擇出3株對黃瓜枯萎病菌有較好拮抗作用的木霉菌即哈茨木霉菌(T.harzianum) 809、擬康氏木霉菌(T.pseudokoningii) 886和棘孢木霉菌(T.asperellum) 525，研究木霉菌分生孢子和厚垣孢子施用后對黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)及對黃瓜枯萎病的防治效果，以期為木霉菌制劑的推廣提供理論依據(jù)，為黃瓜安全和高效生產(chǎn)提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌為黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)，供試菌株分別為哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum) 809、擬康氏木霉菌(Trichodermapseudokoningii) 886、棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum) 525，以上材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供；供試黃瓜品種為長春密刺；供試土壤為草炭土，高溫滅菌。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂10 g，蒸餾水1 000 mL)、PD培養(yǎng)基(不加瓊脂的PDA)、尖孢鐮刀菌選擇培養(yǎng)基[18](KH2PO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)e-Na2-EDTA 0.01 g，L-天門冬酰胺2.0 g，D-半乳糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min)、木霉選擇性培養(yǎng)基(PDAm)[19](去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，氯霉素0.3 g，玫瑰紅即孟加拉紅0.02 g，水1 000 mL)、木霉厚垣孢子發(fā)酵培養(yǎng)基[20](稱取誘導劑60.0 g，酵母粉0.5 g，玉米粉1.0 g，葡萄糖1.0 g，玉米漿液3 mL，加水補足至100 mL，121℃滅菌 20 min)

1.2 病原菌孢子懸浮液和木霉孢子粉劑的制備

1.2.1 尖孢鐮刀菌粉劑的制備 將黃瓜枯萎病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)上，28℃下培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)的三角瓶(250 mL)中，28℃、120 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)7 d，用雙層紗布過濾去除菌絲，濾液經(jīng)5 000 r·min-1離心10 min，沉淀后的孢子重新懸浮于與發(fā)酵液等量的無菌水中，加入3%硅藻土，混勻、抽濾、干燥，制成病原菌孢子粉劑。為計算粉劑中病原菌孢子含量，將粉劑用無菌水梯度稀釋后，涂布于尖孢鐮刀菌選擇培養(yǎng)基[18]，放置1 h 后將培養(yǎng)平板倒置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，統(tǒng)計菌落數(shù)，經(jīng)計算孢子含量為1.9×107cfu·g-1，按照試驗要求計算應用劑量。

1.2.2 木霉分生孢子粉劑的制備 將哈茨木霉菌809(簡稱木霉809)、擬康氏木霉菌886(簡稱木霉886)、刺孢木霉菌525(簡稱木霉525)分別在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)上，28℃活化培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，用無菌水清洗孢子，制成木霉孢子懸液。小麥粒清水室溫浸泡1夜，撈出瀝水，裝入保鮮袋，每袋1 kg，滅菌，冷卻后，接入木霉孢子懸液，25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3周，待長滿孢子后，加無菌水沖洗，濾除麥粒，濾液中按10%加入硅藻土，混合后粉碎、抽濾、干燥，制成木霉分生孢子粉劑。用無菌水梯度稀釋后，涂布于木霉選擇培養(yǎng)基上[19]，在25℃～28℃下倒置培養(yǎng)1～2 d，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算木霉分生孢子含量。木霉菌809、886和525粉劑濃度分別為2×109、1.6×108cfu·g-1和2.8×107cfu·g-1，按照試驗要求計算應用劑量。

1.2.3 木霉厚垣孢子粉劑的制備 將木霉菌809、886和525接入滅菌的木霉菌厚垣孢子發(fā)酵培養(yǎng)基[20]中，28℃，200 r·min-1搖床中發(fā)酵7 d。將發(fā)酵液經(jīng)兩層紗布過濾，將濾液離心得到厚垣孢子，用無菌水沖洗3次。厚垣孢子沉淀加入與發(fā)酵液等量的無菌水稀釋后，再加入3%硅藻土，混勻、抽濾、干燥，制成木霉厚垣孢子粉劑。用無菌水配制成孢子懸浮液，涂布于木霉選擇培養(yǎng)基[19]上，在25℃～28℃下倒置培養(yǎng)1～2 d，統(tǒng)計菌落數(shù)，計算木霉厚垣孢子含量。木霉菌809、886和525粉劑濃度分別為3.5×108、4.7×107cfu·g-1和1.47×108cfu·g-1，按照試驗要求計算應用劑量。

1.3 盆栽試驗方法

1.3.1 試驗設計 試驗在黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院教學基地現(xiàn)代化溫室內(nèi)進行。取滅菌后試驗土，裝入塑料育苗盤(34.5 cm×24 cm×11 cm)中，盤裝土2.5 kg。試驗采用拌土的方式，利用104cfu·g-1濃度的尖孢鐮刀菌粉劑與104cfu·g-1濃度的木霉菌809、886、525厚垣孢子或106cfu·g-1濃度的分生孢子進行組合試驗，以單獨施用尖孢鐮刀菌粉劑為對照。每組試驗設置4個處理，每個處理4盤，3次重復。

每組試驗處理同時將104cfu·g-1濃度的尖孢鐮刀菌粉劑與104cfu·g-1濃度的木霉809厚垣孢子或106cfu·g-1濃度的分生孢子拌入土中，設為處理1；同時將104cfu·g-1濃度的尖孢鐮刀菌粉劑與104cfu·g-1濃度的木霉886厚垣孢子或106cfu·g-1濃度的分生孢子拌入土中，設為處理2；同時將104cfu·g-1濃度的孢鐮刀菌粉劑與104cfu·g-1濃度的木霉525厚垣孢子或106cfu·g-1濃度的分生孢子拌入土中，設為處理3；單獨將104cfu·g-1濃度的尖孢鐮刀菌粉劑拌入土中，設為對照(CK)。

每盤播種經(jīng)過催芽處理后的黃瓜種子80粒，出苗后保留50株黃瓜苗。播種后每隔2 d澆1次無菌水，每盤澆1 000 mL，保持黃瓜正常生長狀態(tài)。待黃瓜幼苗長至三葉一心(即播種后第25天)時，選取黃瓜幼苗的第二片真葉進行黃瓜幼苗各項抗氧化能力和抗病性指標的測定。

1.3.2 測定指標與方法

(1)抗氧化指標。丙二醛(MDA)，采用硫代巴比妥酸法[21]；質(zhì)膜透性，采用相對電導率法[21]；超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用氮藍四唑光化還原法[21]；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性，采用抗壞血酸法[22]；過氧化氫酶(CAT)活性，采用紫外吸收法[22]；過氧化物酶(POD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法[23]。

(2)抗病性指標?？共⌒灾笜税ㄖ仓臧l(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。

植株發(fā)病率為黃瓜幼苗長至三葉一心時各處理發(fā)病株數(shù)占調(diào)查總株數(shù)的百分比。

黃瓜苗期枯萎病參照張素平[24]的分級標準，病情指數(shù)參照宗兆鋒和康振生[25]的計算方法。

0級,無癥狀；1級,真葉、子葉黃化或萎蔫面積不超過總面積的50%；2級,真葉、子葉黃化或萎蔫面積超過總面積的50%；3級,葉片萎蔫或枯死，僅生長點存活；4級,全株嚴重萎蔫，以致枯死。

病情指數(shù)=[∑(病級株數(shù)×代表級數(shù))÷(植株總數(shù)×最高代表級值)]×100

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))÷對照病情指數(shù)×100

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2007版軟件制圖，利用DPS7.05進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 黃瓜幼苗葉片丙二醛含量 木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜幼苗葉片丙二醛含量測定結果見圖1。對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886和木霉525施用下黃瓜幼苗葉片丙二醛含量均顯著降低，其中以木霉886處理下葉片丙二醛含量最低，其顯著低于木霉525，但木霉809與木霉525、木霉809與木霉886之間差異均不顯著；3種木霉菌厚垣孢子處理下的黃瓜幼苗葉片丙二醛含量均顯著低于CK，說明木霉菌能增強黃瓜幼苗葉片膜脂過氧化抗性，減弱膜脂過氧化程度，通過減少對細胞膜的損傷以抵抗枯萎病菌的侵染。木霉886、木霉809、木霉525處理分別較CK降低了41.40%、33.16%、20.33%。

注：圖中正負誤差線表示標準差大小，不同小寫字母表示同一種木霉在同一時期各處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Values in the chart are mean ± standard error, different small letters mean significant difference at 0. 05 level among different treatments for the same Trichoderma in the same period, the same as following．圖1 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of Trichoderma conidia and chlamydospore onmalondialdehyde content in cucumber seedling leaves

對分生孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886和木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片丙二醛含量均顯著降低，其中以木霉886處理下葉片丙二醛含量最低，其顯著低于木霉809，但木霉525和木霉809、木霉525和木霉886之間差異均不顯著；3種木霉菌分生孢子處理下的黃瓜幼苗葉片丙二醛含量均顯著低于CK，木霉886、木霉525、木霉809處理下的葉片丙二醛含量分別較CK降低了38.87%、16.98%、13.25%。

對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的效果而言，黃瓜幼苗葉片丙二醛含量均表現(xiàn)為厚垣孢子處理低于分生孢子處理，木霉809、木霉886、木霉525分生孢子處理分別高出厚垣孢子處理22.95%、4.15%、4.03%。

2.1.2 黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性 細胞膜對維持植物細胞的代謝發(fā)揮著重要作用，當植物遭受各種逆境時，細胞膜的透性會不同程度增大，電解質(zhì)外滲加強，電導率持續(xù)加大，因此，電導率常作為反映質(zhì)膜透性指標。木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性測定結果見圖2。對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片相對電導率均顯著降低，其中以木霉886處理下葉片相對電導率最低，其顯著低于木霉525，但木霉809與木霉525、木霉809與木霉886之間差異均不顯著；3種木霉菌厚垣孢子處理下的黃瓜幼苗葉片相對電導率均顯著低于CK，說明木霉菌處理使葉片相對電導率明顯下降，質(zhì)膜受枯萎病原菌傷害的程度明顯減輕，膜穩(wěn)定性增強。木霉886、木霉809、木霉525處理下的葉片相對電導率分別較CK減小了47.74%、43.98%、39.72%。

對分生孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片相對電導率均顯著降低，其中以木霉886處理下葉片相對電導率最低，其顯著低于木霉809，但木霉525和木霉809、木霉525和木霉886之間差異均不顯著；3種木霉菌分生孢子處理下的黃瓜幼苗葉片相對電導率均顯著低于CK，木霉886、木霉525、木霉809處理下分別較CK減小了41.75%、38.77%、36.17%。

圖2 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響Fig.2 Effects of Trichoderma conidia and chlamydospore onplasma membrance permeability in cucumber seedling leaves

對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的效果而言，黃瓜幼苗葉片相對電導率均表現(xiàn)為厚垣孢子處理低于分生孢子處理，木霉809、木霉886、木霉525分生孢子處理分別高出厚垣孢子處理12.23%、10.29%、1.55%。

2.1.3 黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性 木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性測定結果見圖3。對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下葉片超氧化物歧化酶活性最高，但木霉886與木霉809、木霉809與木霉525之間差異均不顯著；3種木霉菌厚垣孢子處理下的黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均顯著高于CK，說明枯萎病菌對黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性有明顯的抑制作用，而木霉菌處理能夠緩解枯萎病菌對黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性的抑制作用，說明木霉處理能提高黃瓜對枯萎病的抗病能力。木霉886、木霉809、木霉525處理下的葉片超氧化物歧化酶活性分別較CK提高了300.34%、283.49%、273.33%。

圖3 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effects of Trichoderma conidia and chlamydospore onsuperoxide dismutase activity in cucumber seedling leaves

對分生孢子而言，與CK相比，木霉886、木霉809和木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下葉片超氧化物歧化酶活性最高，但木霉886與木霉525、木霉525與木霉809之間差異均不顯著；3種木霉菌分生孢子處理下的黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均顯著高于CK，木霉886、木霉525、木霉809處理分別較CK升高了260.91%、253.02%、241.12%。

對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的效果而言，黃瓜幼苗葉片超氧化物歧化酶活性均表現(xiàn)為厚垣孢子處理高于分生孢子處理，木霉886、木霉809、木霉525厚垣孢子處理分別高出分生孢子處理12.42%、10.92%、5.75%。

2.1.4 黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性 木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜葉片中的抗壞血酸過氧化物酶活性測定結果見圖4。對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉886、木霉809和木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下葉片抗壞血酸過氧化物酶活性最高，木霉886顯著高于木霉809和木霉525，且后二者之間差異不顯著；3種木霉菌厚垣孢子處理下的黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性均顯著高于CK，說明枯萎病菌對黃瓜幼苗的抗壞血酸過氧化物酶活性有一定程度的抑制作用，而木霉菌處理能夠緩解枯萎病菌對黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性的抑制作用，說明木霉處理能提高黃瓜對枯萎病的抗病能力。木霉886、木霉809、木霉525處理下的葉片抗壞血酸過氧化物酶活性分別較CK提高了157.09%、126.67%、117.59%。

圖4 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effects of Trichoderma conidia and chlamydospore onascorbate peroxidase activity in cucumber seedling leaves

對分生孢子而言，與CK相比，木霉886、木霉809和木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下葉片抗壞血酸過氧化物酶活性最高，木霉886顯著高于木霉525和木霉809，且后二者之間差異不顯著；3種木霉菌分生孢子處理下的黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性均顯著高于CK，木霉886、木霉525、木霉809處理分別較CK升高了139.68%、96.27%、90.20%。

對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的效果而言，黃瓜幼苗葉片抗壞血酸過氧化物酶活性均表現(xiàn)為厚垣孢子處理高于分生孢子處理，其中木霉809、木霉886、木霉525厚垣孢子處理分別高出分生孢子處理19.18%、7.27%、10.86%。

2.1.5 黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性 木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性測定結果見圖5。對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下的過氧化氫酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下過氧化氫酶活性最高，木霉886顯著高于木霉809和木霉525，且后二者之間差異不顯著；3種木霉菌厚垣孢子處理，黃瓜葉片的過氧化氫酶活性均高于CK，說明枯萎病菌對黃瓜幼苗的過氧化氫酶活性有一定程度的抑制作用，而木霉處理則能夠緩解枯萎病菌對過氧化氫酶活性產(chǎn)生的抑制作用，說明木霉處理能一定程度上提高幼苗對黃瓜枯萎病的抗病性。木霉886、木霉809、木霉525處理下的葉片過氧化氫酶活性分別較CK提高了155.36%、113.06%、101.14%。

圖5 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性的影響Fig.5 Effects of Trichoderma conidia and chlamydospore oncatalase activity in cucumber seedling leaves

對分生孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下葉片過氧化氫酶活性最高，木霉886顯著高于木霉525和木霉809，且后二者之間差異不顯著；3種木霉菌分生孢子處理下的黃瓜過氧化氫酶活性均高于CK，木霉886、木霉525、木霉809處理分別較CK升高了98.45%、68.27%、65.61%。

對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的效果而言，黃瓜幼苗葉片過氧化氫酶活性均表現(xiàn)為厚垣孢子處理高于分生孢子處理，其中木霉809、木霉886、木霉525厚垣孢子處理分別高出分生孢子處理28.65%、28.68%、19.53%。

2.1.6 黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性 木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性測定結果見圖6。對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理下葉片過氧化物酶活性最高，木霉886顯著高于木霉809和木霉525，且后二者之間差異不顯著；3種木霉菌厚垣孢子處理下的黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性均高于CK，說明枯萎病菌對黃瓜幼苗的過氧化物酶活性有一定程度的抑制作用，而木霉菌處理能夠緩解枯萎病菌對黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性的抑制作用，說明木霉處理能提高黃瓜對枯萎病的抗病能力。木霉886、木霉809、木霉525處理下的葉片過氧化物酶活性分別較CK提高了318.11%、237.98%、213.07%。

圖6 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性的影響Fig.6 Effects of Trichoderma conidia and chlamydospore onperoxidase activity in cucumber seedling leaves

對分生孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下的黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性均顯著升高，其中以木霉886處理葉片過氧化物酶活性最高，木霉886顯著高于木霉525和木霉809，且后二者之間差異不顯著；3種木霉菌分生孢子處理下的黃瓜過氧化物酶均高于CK，木霉886、木霉525、木霉809處理分別較CK升高了239.58%、185.87%、164.05%。

對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的效果而言，黃瓜幼苗葉片過氧化物酶活性均表現(xiàn)為厚垣孢子處理高于分生孢子處理，木霉809、木霉886、木霉525厚垣孢子處理分別高出分生孢子處理28.00%、23.13%、9.52%。

2.2 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜枯萎病的防治效果

當黃瓜幼苗長至三葉一心時，調(diào)查木霉分生孢子和厚垣孢子處理下黃瓜幼苗的發(fā)病率和發(fā)病情況，計算病情指數(shù)及防治效果，木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜枯萎病發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果的影響分別見圖7a、7b和7c。如圖7a所示，對厚垣孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下黃瓜幼苗的發(fā)病率均顯著低于CK，其中木霉886最低，僅為7.74%，木霉886顯著低于木霉809和木霉525，且后二者之間差異不顯著；對分生孢子而言，與CK相比，木霉809、木霉886以及木霉525施用下黃瓜幼苗的發(fā)病率均顯著低于CK，木霉886發(fā)病率最低，為10.76%，但木霉886與木霉525之間差異不顯著，且二者均顯著低于木霉809。圖7b顯示木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜枯萎病病情指數(shù)的影響與發(fā)病率規(guī)律一致，木霉厚垣孢子和分生孢子的病情指數(shù)均以木霉886最低，其顯著低于木霉809和木霉525，木霉886厚垣孢子和木霉886分生孢的病情指數(shù)分別為9.16和10.71。而對防治效果(圖7c)而言，厚垣孢子和分生孢子均以木霉886處理最高，分別達到81.46%和78.32%，均顯著高于木霉809和木霉525，且后二者之間差異不顯著。對同一木霉菌厚垣孢子和分生孢子處理的防治效果，3種木霉均表現(xiàn)為厚垣孢子處理高于分生孢子處理。

圖7 木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜枯萎病防效的影響Fig.7 Effect on the control efficiency of Trichoderma conidiaand chlamydospore against cucumber Fusarium wilt

3 討 論

木霉作為植物有益的生防真菌類型之一，對多種病菌如白絹病菌、鐮刀菌、立枯絲核菌、灰霉病菌、腐霉菌等引起的病害都具有一定的防效[26]。利用木霉進行土傳病害的防治研究很多，如莊敬華等[27]利用綠色木霉(T.viride)T23處理黃瓜幼苗，分生孢子和厚垣孢子作用下的黃瓜枯萎病的病情指數(shù)由33.69分別降至13.12和10.28；張晶晶等[28]分析了木霉分生孢子和厚垣孢子制劑對黃瓜灰霉病的防治效果，在噴施后12 d防效分別達到72.09%和90.12%，厚垣孢子的防效高于分生孢子。而本研究中的3株木霉菌即哈茨木霉菌809、擬康氏木霉菌886、棘孢木霉菌525，對黃瓜枯萎病的防效均高于66%，病情指數(shù)降低到17以下；3種木霉菌厚垣孢子的防效均高于分生孢子，擬康氏木霉菌886厚垣孢子的防效最高，達到81.46%，與以上研究結果相類似，只是病情指數(shù)和防效略有差異。

許多研究得出抗氧化酶系統(tǒng)包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、PPO、SOD、CAT、POD等均與植物的抗病性有關系，抗氧化酶活性與抗病性強弱存在顯著正相關，五大抗氧化酶的活性是植株抗病性的評價指標[29]。當植物受病原菌侵染后，木霉等生防微生物能夠誘導植物抗病相關防御酶發(fā)生變化，增強植物體的抗病防御功能，而防御反應與各種保護性酶活性的提高關系密切[30]。同時，葉片中的MDA積累量和細胞質(zhì)膜透性與保護酶活性與植物防御功能呈現(xiàn)密切關聯(lián)[31]。MDA的積累和質(zhì)膜透性增加均會造成植物體內(nèi)SOD、POD 和CAT 活性下降，降低保護酶系統(tǒng)的功能。如覃柳燕等[32]利用棘孢木霉菌株PZ6處理香蕉植株，結果顯示：與清水(CK)相比，香蕉苗SOD、CAT和POD活性顯著升高；PZ6(3 d)+枯萎病菌菌液(FOC)4處理下的香蕉苗球莖枯萎病病情指數(shù)和防效最好，病情指數(shù)和防效分別為37.50%和48. 28%；高長敏等[33]利用棘孢木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉處理黃瓜幼苗，葉片中的PPO、CAT、POD、SOD活性顯著升高，而相對電導率和MDA含量顯著下降，其中以擬康氏木霉促進效果最強；侯雪月等[34]利用哈茨木霉T8進行浸種和澆根處理，結果表明，施用木霉菌能顯著提高蕓芥的SOD、POD、CAT、PPO和脯氨酸含量，誘導植物提高其抗性；魏林等[35]選擇不同濃度的哈茨木霉T2-16發(fā)酵液對豇豆浸種處理，SOD、CAT和POD等保護酶活性增強，相對電導率下降，保護了細胞膜的相對完整性，豇豆種子的活力得到改善和提高。本研究中黃瓜幼苗經(jīng)木霉809、木霉886、木霉525分生孢子和厚垣孢子處理后，葉片中SOD、CAT、POD、APX等酶活性明顯上升，而MDA含量、相對電導率明顯下降，其中以木霉886厚垣孢子處理效果最強，與前人研究結果相類似，但由于木霉類型、形態(tài)及作用作物種類不同，略有差異。本研究僅探討木霉菌分生孢子和厚垣孢子對黃瓜幼苗的抗氧化能力及枯萎病防效的盆栽試驗效果，與大田試驗存在一定的差異，因此，需要進一步進行田間試驗研究。

4 結 論

綜上所述，哈茨木霉菌809、擬康氏木霉菌886、棘孢木霉菌525分生孢子和厚垣孢子通過提高黃瓜幼苗保護性酶活性，降低了相對電導率和MDA含量，增強了幼苗抗氧化能力，抑制黃瓜枯萎病發(fā)病率，提高了對黃瓜枯萎病的防治效果。其中以擬康氏木霉菌886厚垣孢子應用效果最好，對黃瓜枯萎病的防效達到 81.46%，黃瓜幼苗葉片中的POD、CAT、APX、SOD活性則分別比CK增加了318.11%、155.36%、157.09%和300.34%，而相對電導率、MDA含量則分別比CK下降了47.74%、41.40%。