木霉及其代謝產(chǎn)物在果蔬保鮮中的應(yīng)用研究進(jìn)展

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028）

我國(guó)果蔬產(chǎn)量和消費(fèi)量均處于世界前列，但由于果蔬采摘后自身呼吸作用、病原菌侵染、貯運(yùn)條件等原因，造成約占總產(chǎn)量20%～30%的腐爛[1]。所以，針對(duì)果蔬保鮮技術(shù)的開發(fā)及應(yīng)用對(duì)減少果蔬損耗有重要意義，也有利于國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。果蔬保鮮的常用方法是使用化學(xué)保鮮劑，但果蔬經(jīng)過化學(xué)保鮮劑處理后，殘留在果蔬上的化學(xué)物質(zhì)可能危害人體健康[3]。且化學(xué)保鮮劑的使用，會(huì)造成環(huán)境污染。出于對(duì)消費(fèi)者的安全及環(huán)境污染考慮，多數(shù)的化學(xué)保鮮劑被禁用[4]。木霉菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)引起果蔬腐爛的多種病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，與化學(xué)保鮮劑相比，具有天然、無毒、無污染等優(yōu)點(diǎn)，因此以木霉及其代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)的保鮮劑成為果蔬采后貯藏保鮮的研究熱點(diǎn)。本文從木霉的種類、木霉的保鮮機(jī)理，木霉及其代謝物在果疏保鮮上的應(yīng)用以及木霉商業(yè)制劑和保鮮產(chǎn)品的開發(fā)等方面進(jìn)行闡述，為木霉在果蔬保鮮方面的應(yīng)用及研究提供參考。

1 木霉種類、分布、性質(zhì)

木霉屬真菌廣泛分布于世界各地，生存在富含有機(jī)物的土壤中。個(gè)別菌種受到地理環(huán)境影響，并非普遍存在。如勾狀木霉和擬康寧木霉適應(yīng)于濕度過高的土壤，而哈茨木霉常見于溫暖氣候地區(qū)。木霉也存在于各種植物根系表面，如腐爛的樹皮當(dāng)中[5]。因木霉資源豐富，木霉的種類十分豐富，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的木霉有250多種[6]。吳紫燕等[7]對(duì)我國(guó)不同地區(qū)農(nóng)作物土壤進(jìn)行采樣，從土壤中分離出了9種木霉菌，包括哈茨木霉、棘孢木霉、綠色木霉、漸綠木霉、康寧木霉、深綠木霉、鉤狀木霉、長(zhǎng)枝木霉、橘綠木霉。其中棘孢木霉和哈茨木霉數(shù)量占比最高。秦文韜等[8]從湖南和湖北采集的土壤樣品中分離出4種新木霉，依據(jù)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，依次命名為喜溫木霉、華中木霉、大孢木霉和檸檬黃木霉。隨著對(duì)木霉的研究深入，越來越多的新種木霉會(huì)被發(fā)現(xiàn)并命名。

木霉的生存和繁殖能力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率高，對(duì)多種植物病原真菌有拮抗活性，可以防治由致病菌引起的多種植物病害和果蔬腐爛病[9]。如灰霉病、炭疽病、褐斑病、綠霉病、蒂腐病等。木霉菌根系定殖能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高植物對(duì)非生物脅迫的抵抗力以及養(yǎng)分的吸收和利用率，使作物產(chǎn)量增加[10]。木霉分泌的有機(jī)酸能促進(jìn)磷酸鹽、微量礦物質(zhì)和金屬離子在土壤中的溶解[9]，因此，在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的土壤中添加木霉，可以起到生物肥料的作用。此外，木霉還具有降解纖維素，提高植物防御能力等功能。

2 木霉的保鮮機(jī)理

木霉抑菌保鮮的機(jī)理有：競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生、寄生作用、宿主抗病性的誘導(dǎo)等[11]。

2.1 競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)與空間

對(duì)碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)以及氧氣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空間的有效競(jìng)爭(zhēng)是木霉等拮抗微生物對(duì)果蔬采后真菌起到抑制作用的一種方式[12]。根據(jù)木霉的生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)利用率高、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)的特點(diǎn)，當(dāng)木霉定殖在果蔬上，能利用表面營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)繁殖、生長(zhǎng)，迅速占領(lǐng)空間，使果蔬患病率下降[13]。木霉等拮抗微生物保鮮效果還與果蔬的種類有關(guān)，不同果蔬含有不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利用率和效果也就不同，但從目前報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)來看，木霉都有較好的抑菌作用[14]。常媛等[15]利用從土壤中分離并鑒定的長(zhǎng)枝木霉與核盤菌、立枯絲核菌、細(xì)鏈格孢菌對(duì)峙培養(yǎng)，通過觀察對(duì)比，病原菌菌落占據(jù)空間有所縮減。可以證明長(zhǎng)枝木霉對(duì)3種病原菌生長(zhǎng)有抑制作用，但對(duì)核盤菌的抑制效果最好，抑菌率為77.71%。Card等[16]利用從草莓葉片上分離的深綠木霉LU132制成濃度為1×107/mL孢子懸液噴灑在草莓上，能有效抑制草莓上灰霉病菌的生長(zhǎng)，抑菌率為32%。并利用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，深綠木霉是通過與灰霉菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)揮抑制作用。

2.2 寄生作用

寄生是一種微生物附著在另一種微生物上，并吸收利用宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。木霉也可以通過寄生作用，達(dá)到抑菌保鮮的目的。這個(gè)寄生的過程為，首先木霉與病原菌接觸、相互識(shí)別，之后沿著病原菌菌絲生長(zhǎng)，通過分泌水解酶、進(jìn)入宿主內(nèi)并利用其中的營(yíng)養(yǎng)，分解或破壞其結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致病原菌死亡[17-18]。Elad等[19]的研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉通過寄生方式抑制了引起馬鈴薯白絹病的齊整小核菌生長(zhǎng)（Sclerotium rolfsii），也證明木霉能識(shí)別并附著在宿主菌絲上是因?yàn)橐环N凝集素的存在，它可以與木霉細(xì)胞壁的碳水化合物結(jié)合從而起到識(shí)別的作用。寄生作用發(fā)生的關(guān)鍵是細(xì)胞壁溶菌酶的產(chǎn)生。因?yàn)檎婢?xì)胞壁是由糖類化合物（如幾丁質(zhì)、葡聚糖）和細(xì)胞壁蛋白結(jié)合組成維持結(jié)構(gòu)的完整性。木霉通過分泌幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶等裂解病原真菌細(xì)胞壁，起到抑菌作用。如馬桂珍等[20]研究表明，用鏈孢粘帚霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶配制成的粗酶液處理玉米黃斑病、小麥赤霉病菌孢子和立枯絲核菌的菌核，顯著降低了孢子萌發(fā)率。Deng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉的天冬氨酸蛋白酶在畢赤酵母中表達(dá)的重組蛋白酶的酶活性高達(dá)321.8 U/mL，并且在含有4.56 μg/mL蛋白酶的PDA平板上培養(yǎng)灰葡萄孢菌、立枯絲核菌、黃曲霉等多種病原菌，發(fā)現(xiàn)添加蛋白酶后使病原菌生長(zhǎng)受到抑制，抑制率分別為57.3%、34.8%、26.1%。此外，蛋白酶還對(duì)導(dǎo)致蘋果、黃瓜、橘子腐爛的灰霉病有抑制效果，也表明天冬氨酸蛋白酶有作果蔬保鮮劑的前景。同時(shí)也為直接利用細(xì)胞壁溶菌酶保鮮果蔬提供了依據(jù)。

2.3 抗生作用

微生物產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制或殺死病原體即為抗生作用，而木霉能產(chǎn)生多種具有抗生作用的物質(zhì)。到目前為止，從木霉中分離得到有抑菌效果的代謝物有140余種[22]。它們主要分為兩大類：小分子易揮發(fā)的物質(zhì)，主要有芳香族化合物、聚酮類、丁烯酸內(nèi)酯類等；大分子類物質(zhì)如木霉素、膠霉素、抗菌肽等[23]。研究發(fā)現(xiàn)，從青蒿內(nèi)分離的哈茨木霉對(duì)5種常見于獼猴桃腐爛致病菌，并對(duì)木霉發(fā)酵液進(jìn)行分離純化分析，明確乙酸乙酯對(duì)病原菌起抑制作用[24]。Khare等[25]研究發(fā)現(xiàn)用鈰木霉Gur1孢子數(shù)為1×108CFU/g制成的懸浮液浸泡處理鷹嘴豆后，由尖孢鐮刀菌引起的鷹嘴豆枯萎病發(fā)病率下降了82.4%，也對(duì)鷹嘴豆生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。而鈰木霉有抑菌作用主要依賴其產(chǎn)生的一種哌珀霉素，也證明木霉代謝產(chǎn)生抑菌物質(zhì)是木霉有拮抗性的一個(gè)重要原因。

2.4 誘導(dǎo)抗性

木霉與植物接觸后，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性，也是木霉有抑菌保鮮作用的重要機(jī)制。誘導(dǎo)抗病性產(chǎn)生的原因可能在于木霉與植物相互作用，激發(fā)了自身的抗性反應(yīng)，提高植物體內(nèi)與抗病相關(guān)酶的活性[26]。木霉與植物相互作用會(huì)產(chǎn)生效應(yīng)因子（如絲氨酸蛋白酶、木聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等），激活水楊酸、茉莉酸、乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑，觸發(fā)機(jī)體自身系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性反應(yīng)，增強(qiáng)抗病能力[27-28]。徐文[29]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)枝木霉H9能防治黃瓜的灰霉病，主要是經(jīng)過木霉處理后黃瓜，使黃瓜體內(nèi)與茉莉酸、水楊酸合成的相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)，最后茉莉酸和水楊酸含量顯著提高。濃度為1×107/mL綠色木霉T6和T8的孢子懸液涂抹在蘋果上，能降低由擴(kuò)展青霉引起的腐爛[30]。綠色木霉防腐作用主要是通過誘導(dǎo)蘋果體內(nèi)過氧化物酶、過氧化氫酶、β-1、3-葡聚糖酶等防御酶活性實(shí)現(xiàn)。

3 木霉及代謝產(chǎn)物在果蔬保鮮上的研究

3.1 木霉在果蔬保鮮上的研究

木霉用于果蔬的保鮮最早是在1977年，Tronsmo等[31]利用木霉控制了由葡萄球菌引起的草莓腐爛。之后，因木霉自身對(duì)多種病原菌有拮抗作用，利用木霉防治果蔬病害的研究越來越多。Valenzuela等[32]通過體外木霉與炭疽病菌雙重培養(yǎng)試驗(yàn)，在木瓜損傷處添加濃度為1×106/mL的木霉孢子懸液，證明木霉對(duì)木瓜炭疽病的拮抗能力。Panebianco等[33]利用濃度為1×109/mL深綠木霉和假單孢菌混合濾液浸漬處理柑橘，能有效抑制柑橘青霉病，抑制率達(dá)到80%以上。Suhanna等[34]用3種不同濃度木霉孢子懸液噴灑在茶堿桿菌侵染的芒果上，與對(duì)照組相比，濃度為1×106/mL處理后，腐爛率從46.7%下降到31.7%，濃度為1×103/mL和1×108/mL則效果不明顯。李佩芳等[35]用稀釋600倍后的木霉菌液浸泡處理青椒后，青椒40 d腐敗率為30.84%，而對(duì)照組20d的腐敗率為78.80%，已經(jīng)失去了商品價(jià)值。劉淑宇等[36]研究發(fā)現(xiàn)用綠色木霉發(fā)酵液能降低芒果炭疽病25%發(fā)病率，也能延緩反映芒果品質(zhì)的可溶性固形物（total soluble solids，TSS）、可滴定酸（titrable acidity，TA）等數(shù)值的下降。曹森等[37]在采前噴灑3×106CFU/mL哈茨木霉菌和采后噴灑0.5 μL/L的1－甲基環(huán)丙烯相結(jié)合處理櫻桃番茄，比單獨(dú)使用一種方法保鮮效果更明顯，腐敗率為19.81%。高欣等[38]用涂布木霉發(fā)酵液的聚乙烯塑料薄膜袋和瓦楞紙箱對(duì)黃瓜進(jìn)行包裝，并每隔兩天隨機(jī)抽樣，測(cè)定與保鮮相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)，通過比較得出，包裝材料在涂布發(fā)酵液后，黃瓜的營(yíng)養(yǎng)損失更少且保鮮時(shí)間延長(zhǎng)了5 d。

3.2 木霉代謝物在果蔬保鮮上的研究

Pascale 等[39]用濃度為 10 μmol/L 哈茨木霉、深綠木霉的代謝產(chǎn)物哈茨酸和6-戊基-α-吡喃酮溶液噴灑處理葡萄，可以使葡萄白粉病的發(fā)病率降低60%。Saravanakumar等[40]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉細(xì)胞壁降解酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物協(xié)同防治黃瓜枯萎病的效果更好，防治率達(dá)到71.67%。也證明代謝產(chǎn)物和細(xì)胞壁降解酶聯(lián)用可提高抑菌能力。吳紫燕等[41]利用橘綠木霉發(fā)酵代謝產(chǎn)物哌珀霉素制成含量50 mg/L液體制劑浸泡處理獼猴桃，防治了獼猴桃軟腐病的發(fā)生，儲(chǔ)藏期也延長(zhǎng)了30 d。張量等[42]用漸綠木霉代謝產(chǎn)物中的6-戊基-2H-吡喃酮配制成濃度為400 μg/mL溶液，基本能完全抑制辣椒疫霉菌的生長(zhǎng)。張婧迪[43]用濃度為2%木霉菌代謝產(chǎn)物與稀釋5 000倍的0.1%蕓苔素內(nèi)酯結(jié)合使用，對(duì)番茄灰霉病防治率達(dá)到56.62%。

4 木霉商業(yè)制劑及保鮮產(chǎn)品的開發(fā)與存在問題

木霉對(duì)引起植物病害的多種真菌有拮抗作用、還具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高植物抗性等優(yōu)良特性，所以木霉成為一種被廣泛研究的真菌，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最常用的生物制劑。到目前為止，已有200多種木霉制劑可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，并作為生物農(nóng)藥、生物肥料、生長(zhǎng)促進(jìn)劑和天然抗性刺激劑銷售[44]。木霉生物制品最多的是亞洲，其次是歐洲、中南美洲和北美等，但大多數(shù)標(biāo)簽都顯示為殺菌作用。國(guó)際上可以進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的木霉制劑如美國(guó)用綠色木霉G-41生產(chǎn)的殺菌劑BW240 W、巴西用棘孢木霉生產(chǎn)的生物制劑Quality WG、南非用哈茨木霉SF生產(chǎn)的商業(yè)制劑Bio-Tricho、以色列用哈茨木霉T39發(fā)酵制成的可濕性粉劑Trichodex等。國(guó)內(nèi)也有一些木霉商業(yè)制劑的生產(chǎn)，多數(shù)應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上。如防治番茄灰霉病的木霉菌可濕性粉劑、防治大白菜和黃瓜霜霉病的木霉菌可濕性粉劑[45]等。

根據(jù)木霉菌對(duì)多種病原菌有拮抗作用這一性質(zhì)，已經(jīng)研究出多種木霉殺菌劑，用于防治果蔬采前的真菌病害。因此，也可以把木霉用于果蔬采后防腐保鮮中，制成生物保鮮劑。但在實(shí)際開發(fā)木霉保鮮劑時(shí)又存在許多問題需要解決，如效果不穩(wěn)定、理論研究不深入等問題[46]。

1）效果不穩(wěn)定：保鮮劑主要成分是有活性木霉孢子，容易受到外界環(huán)境（如溫度、pH值等）、加工技術(shù)、使用方法等因素，導(dǎo)致菌種活性發(fā)生改變，抑菌效果不穩(wěn)定。由于木霉自身原因，難以達(dá)到性質(zhì)穩(wěn)定。可以通過誘變育種、原生質(zhì)體融合等技術(shù)[47]，得到效果更強(qiáng)且更穩(wěn)定的木霉菌。在加工技術(shù)方面，對(duì)木霉菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，培育出效果更穩(wěn)定、儲(chǔ)存期更長(zhǎng)的孢子。

2）理論研究不深入：目前利用木霉在果蔬保鮮上的研究?jī)H處于初級(jí)階段，只對(duì)一部分果蔬有所研究，發(fā)現(xiàn)能延長(zhǎng)果蔬儲(chǔ)藏期。而具體是木霉中的哪些物質(zhì)起到保鮮效果還需要深入研究。

5 前景與展望

木霉不僅可以研制成生物農(nóng)藥應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上，也能應(yīng)用于果蔬中，提高采后果蔬抗病性，延長(zhǎng)果蔬儲(chǔ)存期、減緩營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，是一種有應(yīng)用潛力的真菌。但在實(shí)際開發(fā)中存在性質(zhì)不穩(wěn)定、儲(chǔ)存期短等缺點(diǎn)，尚需深入的研究和改進(jìn)。如何開發(fā)出高效、穩(wěn)定、抗菌性能較好的木霉保鮮劑是今后的研究重點(diǎn)，也為生物保鮮代替化學(xué)保鮮奠定基礎(chǔ)。