蘆筍提取物穩(wěn)定性和緩解體力疲勞功能研究

鄭立新，蔡祥焜，吳玉平，賈迪，董鵬，田世民*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測中心，北京 100123；2.中檢科（北京）測試技術(shù)有限公司，北京 100176）

長時(shí)間過度運(yùn)動(dòng)或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞，導(dǎo)致機(jī)體機(jī)能和工作效率下降，長期疲勞還會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降，繼而出現(xiàn)器質(zhì)性疾病，影響健康。疲勞產(chǎn)生的同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)能量物質(zhì)、激素水平、代謝調(diào)節(jié)酶類、抗氧化系統(tǒng)酶類、代謝產(chǎn)物等內(nèi)環(huán)境的變化[1]。目前，疲勞產(chǎn)生機(jī)制主要包括能量耗竭、代謝產(chǎn)物堆積、離子代謝紊亂、保護(hù)性抑制、氧自由基損傷-脂質(zhì)過氧化學(xué)說[2-4]。近些年，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量的食源性抗疲勞活性成分的相關(guān)研究工作，表明通過補(bǔ)充含有氨基酸類、多糖類、維生素、多酚、生物堿、類胡蘿卜素以及皂苷類等天然活性成分的食源性物質(zhì)，可有效延緩疲勞的發(fā)生和促進(jìn)體力恢復(fù)[5-6]，因此，開發(fā)具有抗疲勞功能的保健食品，對(duì)于促進(jìn)人體健康具有積極意義。蘆筍（Asparagus officinalis L.）是天門冬科天門冬屬多年生草本植物石刁柏的幼苗，含有豐富的蘆筍多糖、黃酮類化合物、維生素、蛋白質(zhì)和甾體皂苷等物質(zhì)，蘆筍中提取的皂苷、粗多糖、黃酮類等活性成分，具有抗癌抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、血脂等多方面的藥理作用[7-8]，作為藥食兩用的名貴蔬菜，具有很高的營養(yǎng)保健價(jià)值。蘆筍及相關(guān)產(chǎn)品在抗疲勞研究方面已有報(bào)道[8-12]，由于采用蘆筍產(chǎn)地、植株部位不同，終產(chǎn)物的功效成分組分不同，導(dǎo)致報(bào)道中活性成分不確定或不盡統(tǒng)一，因此，需要將功效成分定量與功能評(píng)價(jià)結(jié)合研究。本試驗(yàn)在測定蘆筍提取物中功效成分和穩(wěn)定性，參考保健食品的抗疲勞功能評(píng)價(jià)方法，給予小鼠蘆筍提取物30 d后，在測定小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、肝糖原和肌糖原、血清尿素氮、血乳酸的基礎(chǔ)上，增加了小鼠運(yùn)動(dòng)前后血糖指標(biāo)的檢測，探討蘆筍提取物抗疲勞效果，以期為蘆筍提取物類的保健食品開發(fā)和利用提供實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蘆筍提取物黃褐色粉末狀固體（生產(chǎn)批號(hào)CS17-DF-009）：秦皇島長勝營養(yǎng)健康科技有限公司。

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康雄性ICR小鼠[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]192只，體重18 g～22 g：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房中[使用許可證號(hào)：SYXK（京）2018-0007]，食水自由攝入，動(dòng)物房溫度20℃～26℃，濕度40%～70%，光照為12 h明12 h暗；維持鼠料[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0015]：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

肝/肌糖原測定試劑盒（蒽酮法）（批號(hào)：20180615）：南京建成生物工程研究所；血清尿素氮試劑盒（批號(hào)：170831）、RANDOX多項(xiàng)血清復(fù)合質(zhì)控（批號(hào)：1225UN）：中生北控生物科技有限公司；乳酸檢測芯片（批號(hào)：CL1807）、破膜液（批號(hào)：H17368E）、系統(tǒng)液（批號(hào)：S17053）、乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：M18025）：德國 EKF 診斷公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TBA-120FR全自動(dòng)血生化分析儀：日本東芝（TOSHIBA）公司；BIOSEN C-line 15葡萄糖/乳酸分析儀：德國EKF診斷公司；HH-S數(shù)顯恒溫游泳箱：金壇市華龍實(shí)驗(yàn)儀器廠；U-3900紫外分光光度計(jì)：日本日立集團(tuán)；Synergy H1M酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；3K15冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司；0.8 mm焊錫絲：上海向智電子有限公司；PC2810計(jì)時(shí)器：深圳天福電子有限公司；10 μL采血管：德國EKF 診斷公司；5 mL、1 mL和200 μL 加樣器：德國 eppendorf公司；10 mL 移液管、尖底15 mL離心管、平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國corning公司。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照保健食品在注冊(cè)檢驗(yàn)時(shí)在37℃、75%的恒溫恒濕條件下進(jìn)行3個(gè)月的加速破壞性試驗(yàn)的方法，將樣品放在溫度為 37℃～40℃，濕度為（75±5）%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中0個(gè)月（放置前）、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行加速試驗(yàn)后，檢測總皂苷、粗多糖、總黃酮含量，以考察蘆筍提取物在保質(zhì)期內(nèi)有效成分的穩(wěn)定性。粗多糖按白鴻的苯酚-硫酸分光光度法測定[13]。總皂苷測定：用水飽和正丁醇提取凈化之后，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液 200 μL、高氯酸溶液 800 μL，蓋塞后混勻，70℃水浴15 min，取出后于冰水中冷卻5 min，加入5 mL冰醋酸混勻，移入比色皿中，于535 nm波長下測定吸光度。總黃酮依據(jù)保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）的第四章總黃酮測定方法[14]。

1.2.2 蘆筍提取物抗疲勞功能研究

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、劑量設(shè)定、灌胃給樣

小鼠適應(yīng)3 d后，取健康雄性ICR小鼠，將動(dòng)物隨機(jī)分為4大組（負(fù)重游泳、肝/肌糖原、血清尿素氮、血乳酸和血糖測定組），每大組48只，再按體質(zhì)量隨機(jī)分為去離子水陰性對(duì)照組和低、中、高3個(gè)劑量組[0.5、1.0、1.5 g/（kg·d）蘆筍提取物組]，每組12只。分別稱取0.5、1.0、1.5 g蘆筍提取物，用去離子水定容至20 mL，充分溶解混勻后備用，去離子水對(duì)照組用去離子水，均按20 mL/（kg·d），給予灌胃，每日1次，連續(xù)給樣30 d，每周根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。

1.2.2.2 指標(biāo)測定方法

在末次給予樣品30 min后，參考保健食品緩解體力疲勞功能評(píng)價(jià)方法測定各項(xiàng)生理指標(biāo)[14]。負(fù)重游泳：將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于水溫25℃游泳箱中游泳，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為小鼠入水至力竭而沉入水中并持續(xù)8 s不能浮出水面的時(shí)間。肝糖原和肌糖原測定：在正常狀態(tài)下，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取肝臟和腓腸肌，生理鹽水清洗，濾紙吸干后，嚴(yán)格按照南京建成試劑盒操作說明書測定肝糖原和肌糖原含量。高尿素模型小鼠血清尿素氮（urea nitrogen，UREA）測定：小鼠在溫度為30℃的水中不負(fù)重游泳90 min，休息60 min后，小鼠拔眼球采全血約1 mL（不加抗凝劑），置4℃冰箱約60 min，血凝固后3 000 r/min離心15 min，取血清，全自動(dòng)血生化儀測定尿素氮。血乳酸和血糖測定：小鼠不負(fù)重在溫度30℃的水中游泳10 min后停止，分別于游泳前、游泳后0 min和游泳后20 min，眼眶靜脈叢采全血10 μL加入檢測試劑中，混勻后上機(jī)測定血乳酸和血糖。

1.2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍提取物中3種功效成分穩(wěn)定性研究

蘆筍提取物中總皂苷、粗多糖、總黃酮的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 蘆筍提取物中總皂苷、粗多糖、總黃酮的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Stability test results of total saponins，crude polysaccharides and total flavones in asparagus extracts

結(jié)果表明，該蘆筍提取物中功效成分含量依次為粗多糖>總皂苷>總黃酮，總黃酮含量極低，為25 mg/100 g。經(jīng)過3個(gè)月的加速破壞性試驗(yàn)后，總皂苷、粗多糖穩(wěn)定性良好，總黃酮含量下降比率為20.0%，穩(wěn)定性稍差?？傇碥铡⒋侄嗵?、總黃酮的衰減率分別為6.3%、6.9%、20.0%。在研究中，可將總皂苷和粗多糖作為蘆筍提取物的主要標(biāo)志性成分。

2.2 蘆筍提取物抗疲勞功能研究

2.2.1 小鼠的一般情況觀察

整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，陰性對(duì)照組與3個(gè)劑量組的小鼠被毛有光澤、眼有神，未見飲食、精神和行為活動(dòng)的異常，研究結(jié)束時(shí)，各組小鼠的末期體重和體重增長值，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明蘆筍提取物對(duì)小鼠無不良影響。

2.2.2 蘆筍提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)耐力的下降是疲勞最直接的表現(xiàn)，負(fù)重游泳時(shí)間的長短可作為判斷機(jī)體疲勞程度的客觀指標(biāo)[15]。蘆筍提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響見表2。

表2 蘆筍提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Table 2 Effect of asparagus extracts on the time of weight-loading swimming in mice

小鼠負(fù)荷5%體重鉛皮游泳至力竭時(shí)間，與陰性對(duì)照組比較，1.0、1.5 g/（kg·d）劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以1.5 g/（kg·d）劑量組效果最佳。

2.2.3 蘆筍提取物對(duì)小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響

肌糖原、肝糖原和血糖組成機(jī)體的糖儲(chǔ)備，其大小與運(yùn)動(dòng)能力呈正相關(guān)[16-17]。肝糖原是血糖的貯存庫，需要時(shí)可釋放入血，以維持血糖的正常水平，保證生命活動(dòng)及運(yùn)動(dòng)能力，肝糖原貯備對(duì)維持長時(shí)間運(yùn)動(dòng)血糖濃度起重要作用。肌糖原氧化分解為肌肉的舒縮活動(dòng)提供能量并提高運(yùn)動(dòng)時(shí)的輸出功率，是運(yùn)動(dòng)中獲得好成績的物質(zhì)基礎(chǔ)，肌糖原降低與運(yùn)動(dòng)性疲勞和運(yùn)動(dòng)性損傷的發(fā)生有密切關(guān)系[18]。蘆筍提取物對(duì)小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響見表3。

在正常狀態(tài)下，3個(gè)劑量組小鼠肝糖原含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[0.5、1.5 g/（kg·d）劑量組均P＜0.05，1.0 g/（kg·d）劑量組P＜0.01]；1.0、1.5 g/（kg·d）劑量組小鼠肌糖原含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1.0 g/（kg·d）P＜0.01，1.5 g/（kg·d）P＜0.05]，1.0、1.5 g/（kg·d)無劑量效應(yīng)關(guān)系，均以中劑量效果最佳。

表3 蘆筍提取物對(duì)小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響Table 3 Effect of asparagus extracts on hepatic and muscular glycogen level in mice

2.2.4 蘆筍提取物對(duì)高尿素模型小鼠血清尿素氮水平的影響

血尿素氮是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝加強(qiáng)，導(dǎo)致尿素氮含量升高，對(duì)于評(píng)價(jià)機(jī)體在體力負(fù)荷時(shí)的承受能力是一個(gè)非常靈敏的指標(biāo)[14]。

蘆筍提取物對(duì)小鼠血清尿素氮水平的影響見表4。

表4 蘆筍提取物對(duì)小鼠血清尿素氮水平的影響Table 4 Effect of asparagus extracts on serum urea level in mice

不負(fù)重游泳90 min建立高尿素模型，休息60 min后，與陰性對(duì)照組比較，3個(gè)劑量組血清尿素氮含量略有降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.5 蘆筍提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)前后小鼠血乳酸、血糖水平的影響

血乳酸是與疲勞相關(guān)的重要的生化指標(biāo)，長時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，由于組織缺血、缺氧，造成組織細(xì)胞產(chǎn)生大量乳酸，肌肉中pH值隨著乳酸濃度上升而下降，使磷酸果糖激酶的活性受抑制，機(jī)體能量代謝水平降低，致使運(yùn)動(dòng)能力下降[19]，隨著乳酸的積累也開始了乳酸的自然清除，乳酸積累的程度取決于乳酸產(chǎn)生和清除的速度，乳酸是否能及時(shí)消除就十分重要[20]。蘆筍提取物對(duì)小鼠血乳酸水平及血乳酸曲線下面積的影響見表5。

在游泳前、游泳后0 min、游泳后20 min分別檢測血乳酸含量，與陰性對(duì)照組比較，僅1.5 g/（kg·d）劑量組在游泳后0 min血乳酸值顯著降低（P＜0.05）；3個(gè)劑量組的血乳酸曲線下面積均降低，但僅1.5 g/（kg·d）劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 蘆筍提取物對(duì)小鼠血乳酸水平及血乳酸曲線下面積的影響Table 5 Effect of asparagus extracts on blood lactic acid and area under curve of the blood lactic acid in mice

隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間的增加，血糖耗竭，這時(shí)肌糖原、肝糖原分解，補(bǔ)充葡萄糖，體內(nèi)各組織細(xì)胞活動(dòng)所需的能量大部分來自葡萄糖，所以血糖必須保持一定的水平才能維持體內(nèi)各器官和組織的需要[21]。蘆筍提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)前、后小鼠血糖水平的影響見表6。

表6 蘆筍提取物對(duì)運(yùn)動(dòng)前、后小鼠血糖水平的影響Table 6 Effect of asparagus extracts on blood glucose in mice

本研究結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較，各劑量游泳前、游泳后0min血糖值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；1.0、1.5 g/（kg·d)劑量組小鼠在游泳后20 min血糖值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3個(gè)劑量組血糖下降值均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[0.5、1.5 g/（kg·d）劑量組P＜0.05，1.0 g/（kg·d）劑量組P＜0.01]。提示該受試物有促進(jìn)組織對(duì)糖原的利用，加快血糖水平恢復(fù)的作用。

3 結(jié)論

近些年來，國內(nèi)外學(xué)者開展了許多食源性抗疲勞活性成分的相關(guān)研究，為新型抗疲勞產(chǎn)品研究與開發(fā)提供參考[6，22]，本研究可補(bǔ)充抗疲勞的食源性活性成分目錄。本試驗(yàn)蘆筍提取物的主要活性成分為總皂苷和粗多糖，其中總皂苷含量為0.79 g/100 g，3個(gè)月恒溫恒濕加速試驗(yàn)衰減率為6.3%，粗多糖為2.9×104mg/100 g，3個(gè)月恒溫恒濕加速試驗(yàn)衰減率為6.9%，表明總皂苷和粗多糖穩(wěn)定性良好，可用于保健食品中蘆筍提取物的質(zhì)量控制。

能量物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的堆積是產(chǎn)生疲勞的重要原因，采用引起疲勞的某些生化變化為指標(biāo)，觀察疲勞的出現(xiàn)及發(fā)展的過程，是研究運(yùn)動(dòng)性疲勞最有效的方法[2，23]，而要評(píng)價(jià)受試物是否有抗疲勞的作用，采用與疲勞產(chǎn)生機(jī)制有關(guān)的生物化學(xué)指標(biāo)才能得到可靠的結(jié)果[24]，糖原、血清尿素氮及血乳酸含量的變化最具有代表性，通常也作為檢測疲勞的生化指標(biāo)[25-28]，而血糖與各組織糖代謝關(guān)系密切，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的唯一能源，血糖水平除了反映糖代謝水平外，還可反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疲勞狀況，已被運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)家用于評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)員的訓(xùn)練水平，近些年來也被用在保健食品抗疲勞的研究工作中[29]。研究結(jié)果表明，補(bǔ)充蘆筍提取物能促進(jìn)小鼠肝糖原和肌糖原能源物質(zhì)的積累，延緩疲勞的發(fā)生，降低血乳酸曲線下面積，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10，12]。蘆筍提取物能夠增加肌糖原和肝糖原儲(chǔ)備，在運(yùn)動(dòng)中維持較高血糖水平，延長運(yùn)動(dòng)時(shí)間，推測其機(jī)制是通過增加肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，清除運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生自由基[12]，增加乳酸脫氫酶活力，從而降低體內(nèi)血乳酸水平，延緩疲勞的發(fā)生并加速其消除[9，30]；未發(fā)現(xiàn)蘆筍提取物對(duì)血清尿素氮有影響，與田穎剛等的報(bào)道一致[12]。當(dāng)糖原被大量消耗時(shí)，機(jī)體活動(dòng)能力降低，從而導(dǎo)致全身性疲勞的發(fā)生，糖原貯備的提高有利于機(jī)體耐力速度的提高，并減少蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解代謝，本研究結(jié)果也印證了這點(diǎn)。本次研究中還發(fā)現(xiàn)蘆筍提取物可以提高游泳后小鼠血糖水平，減少血糖下降值，在運(yùn)動(dòng)中能夠維持較高的血糖水平，從而延緩疲勞發(fā)生，而此種血糖測定的實(shí)驗(yàn)方法可用于抗疲勞功能研究。綜上所述，0.5 g/（kg·d） ～1.5 g/（kg·d）蘆筍提取物對(duì)于小鼠有抗疲勞效果，以1.5 g/（kg·d）劑量抗疲勞效果最好，也證實(shí)了可通過多種途徑緩解體力疲勞，對(duì)小鼠的一般健康情況和體質(zhì)量并無影響，是理想的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。因此，有針對(duì)性地補(bǔ)充蘆筍提取物來減緩體力疲勞的發(fā)生是解決運(yùn)動(dòng)性疲勞的有效途徑之一，但應(yīng)用到人群試食的功效仍需進(jìn)一步研究。