高山蔥類(lèi)蔬菜染色體制片方法改進(jìn)

符家平+郭鳳領(lǐng)+邱正明+吳金平+張昊+馬璐

摘要：以山韭菜（Allium japonicurn Regel）和紅皮洋蔥（A. cepa L.）的根尖為材料，參考常規(guī)制片方法，對(duì)傳統(tǒng)的植物染色體制片方法進(jìn)行了改進(jìn)。結(jié)果表明，改進(jìn)后的制片方法不僅提高了植物染色體的制片質(zhì)量，而且節(jié)約了時(shí)間和成本。

關(guān)鍵詞：山韭菜（Allium japonicurn Regel）；紅皮洋蔥（A. cepa L.）；染色體制片

中圖分類(lèi)號(hào)：S633：Q-336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）14-2707-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.027

Abstract： With the root tips of Allium japonicurn Regel and A. cepa L. as materials， we developed and improved a method for preparation of plant chromosome spreadsbased on conventional techniques. The result indicated that this method not only saves the time and cost， but also improves the quality of chromosome slides.

Key words： Allium japonicurn Regel； Allium cepa L.； chromosome preparation

染色體是基因的載體，而基因支配遺傳和變異，也調(diào)控著染色體的結(jié)構(gòu)和行為。植物的染色體數(shù)目與核型確定是對(duì)染色體特征進(jìn)行定性和定量描述的一種基本方法，對(duì)研究植物系統(tǒng)演化、物種之間的親緣關(guān)系、起源、進(jìn)化與分類(lèi)、遠(yuǎn)緣雜交及遺傳工程中的染色體鑒別等都具有重要的意義[1]。染色體數(shù)目與核型的觀察主要依賴(lài)于染色體制片，目前常用的技術(shù)有2種，即壓片技術(shù)和去壁低滲火焰干燥技術(shù)[2]，前者操作簡(jiǎn)單，但需要制片者取材時(shí)間適宜，壓片力量適中，載玻片需要干燥數(shù)小時(shí)后才能鏡檢，對(duì)操作者的熟練程度要求較高；后者需要的制片經(jīng)驗(yàn)較少，且制片效果較好，但操作過(guò)程涉及酒精燈，需要火焰干燥和蓋玻片壓片，這些中間步驟會(huì)對(duì)染色體制片效果造成不利影響。而本試驗(yàn)改進(jìn)后的滴片技術(shù)，染色體清晰、分散，不會(huì)導(dǎo)致染色體丟失，并且節(jié)約了制片時(shí)間和成本，具有一定的實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

山韭菜（Allium japonicurn Regel）植株和紅皮洋蔥（A. cepa L.）種子由湖北省高山蔬菜工程技術(shù)研究中心提供，試驗(yàn)在武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

山韭菜植株在實(shí)驗(yàn)室盆栽，于室溫下生長(zhǎng)8 d左右后取根尖備用；紅皮洋蔥種子先用自來(lái)水在室溫下浸泡10 h左右，然后放入底部墊有濕紗布的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放入光照培養(yǎng)箱內(nèi)、25 ℃左右培養(yǎng)5 d后取根尖備用。

1.2 制片方法

1.2.1 預(yù)處理 參照文獻(xiàn)[2]的制片方法，但做了一些改進(jìn)。取山韭菜和紅皮洋蔥剛長(zhǎng)出的長(zhǎng)度1～2 cm的新根，洗凈，放在超凈工作臺(tái)上，用刀片切取根尖頂端部分，長(zhǎng)度1～2 mm；取下后裝入1.5 mL離心管中，加入水飽和的α-溴代萘溶液1.0 mL，在25～28 ℃水浴鍋中處理120～150 min。

1.2.2 前低滲 預(yù)處理后的根尖用移液槍吸出α-溴代萘溶液，每次加入去離子水1.0 mL清洗，3～4次后加入去離子水1.0 mL，放置25～28 ℃水浴鍋中處理30 min。

1.2.3 固定 用移液槍吸出去離子水，加入1.0 mL剛配制的固定液，避光放入4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜（固定時(shí)間15～20 h），固定液按甲醇∶冰醋酸=3∶1（V/V）配制。

1.2.4 酶解 去掉固定液，用去離子水清洗，每次加入去離子水1.0 mL，清洗3～4次后吸出去離子水，加入2%纖維素酶和2%果膠酶等體積混合的酶液，放入28 ℃水浴鍋中酶解3～4 h，酶液的體積為根尖體積的50～60倍。

1.2.5 后低滲 用移液槍小心吸出酶解后的酶解混合液，輕輕加入1.0 mL去離子水，放入28 ℃水浴鍋中處理30 min，吸出處理后的去離子水。

1.2.6 制備懸浮液 在離心管中對(duì)每個(gè)根尖加入15～20 μL剛配制的固定液，用解剖針搗碎根尖，制成細(xì)胞懸浮液。

1.2.7 滴片 將移液槍固定在工作臺(tái)上方60 cm處，干燥后的載玻片斜放在下方，用固定好的移液槍吸取配制的細(xì)胞懸浮液，滴在載玻片上，每塊載玻片可滴1～3滴懸浮液，20 min后可對(duì)載玻片進(jìn)行鏡檢。這一步驟是本試驗(yàn)改進(jìn)的關(guān)鍵，這里應(yīng)用了自然重力的作用原理，將根尖細(xì)胞懸浮液從高處滴下，使載玻片上的染色體自然分散，載玻片上無(wú)細(xì)胞重疊和細(xì)胞原生質(zhì)堆積現(xiàn)象，操作過(guò)程也簡(jiǎn)單。

1.2.8 鏡檢 顯微鏡有相差顯微鏡和熒光顯微鏡2類(lèi)，分別對(duì)載玻片鏡檢，熒光鏡檢前先進(jìn)行DAPI熒光染色，然后照相。

2 結(jié)果與分析

山韭菜和紅皮洋蔥染色體制片相差顯微鏡鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1，熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，經(jīng)DAPI熒光染色后，可明顯看出染色體帶型清晰、結(jié)構(gòu)完整，可觀察到明顯的著絲粒帶和四分體結(jié)構(gòu)，具有良好的制片后操作性。壓片法在蓋玻片擠壓過(guò)程中，由于受力不一致，可能導(dǎo)致染色體分布不均勻，而且液氮固定后，在揭蓋玻片的同時(shí)，染色體可能粘在蓋玻片上而丟失，揭完蓋玻片后，一般要過(guò)夜干燥后才能鏡檢?；鹧娓稍锓m然制片時(shí)間較短，但操作難度較大，染色體不易分開(kāi)。按1次試驗(yàn)計(jì)算，滴片法比壓片法至少節(jié)約時(shí)間1 d，而且不需要液氮，比火焰干燥法操作簡(jiǎn)單，并且不需要酒精燈。3種制片方法的特點(diǎn)比較見(jiàn)表1。

3 討論

染色體制片質(zhì)量是染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)與核型分析的關(guān)鍵所在，也關(guān)系到原位雜交試驗(yàn)的成敗；沒(méi)有一個(gè)分裂相多、染色體分散好的制片是無(wú)法進(jìn)行下一步原位雜交試驗(yàn)的。在植物染色體制片過(guò)程中，許多人對(duì)制片方法進(jìn)行了探索。陳磊等[3]以胡蘿卜（Daucus carota L. var. sativa Hoffm.）根尖為試驗(yàn)材料，對(duì)常規(guī)胡蘿卜染色體制片方法進(jìn)行改良后，制片質(zhì)量和獲得的所需細(xì)胞數(shù)量都有了明顯提高。為了獲得一串紅（Salvia splendens Ker-Gawler）多個(gè)品種的染色體制片，洪培培等[4]對(duì)一串紅染色體壓片技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到6個(gè)一串紅品種的高清晰染色體制片。本試驗(yàn)利用自然重力將染色體擴(kuò)散分開(kāi)，改進(jìn)了傳統(tǒng)的染色體壓片法和火焰干燥法植物染色體制片技術(shù)，減少了操作程序，節(jié)約了時(shí)間和成本，提高了成功率。有關(guān)植物染色體滴片方法的報(bào)道有王幼平[5]的試驗(yàn)，但其并沒(méi)有說(shuō)明移液槍和載玻片之間的高度及具體的操作過(guò)程。本試驗(yàn)中的滴片高度是否科學(xué)合理也還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊漢民.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，1997.208.

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[3] 陳 磊，管長(zhǎng)志，尹立榮，等.一種改進(jìn)的胡蘿卜染色體制片方法[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，15（2）：12-13.

[4] 洪培培，楊建玉，陳洪偉，等.一串紅染色體制片技術(shù)優(yōu)化與計(jì)數(shù)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（10）：2124-2128.

[5] 王幼平.植物染色體制片方法的改進(jìn)[J].生物學(xué)通報(bào)，2007，42（10）：55.