泉州市平菇木霉病菌的分離及鑒定

藍(lán)波妙

（泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建泉州 362212）

平菇（Pleurotus ostreatus）屬于側(cè)耳科（Pleurotaceae）側(cè)耳屬（Pleurotus）[1]，可人工栽培，多見(jiàn)于溫帶至亞熱帶地區(qū)。平菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及碳水化合物，除食用價(jià)值外，還具有很好的藥理作用，可以降血脂，保肝解毒，其含有的菌類多糖能夠消滅腫瘤細(xì)胞[2]。在平菇栽培過(guò)程中，常發(fā)生病害，引起平菇發(fā)生病害的微生物主要包括真菌、細(xì)菌、病毒等，其中木霉是平菇生產(chǎn)過(guò)程中較常見(jiàn)且危害較大的真菌之一[3-5]。木霉（Trichoderma）是無(wú)性型真菌，屬于半知菌類的絲孢菌綱（Hyphomycetes），肉座菌科（Hypocreaceae）的肉座菌屬（Hypocrea Fr）。1996年Rifai首次對(duì)木霉屬進(jìn)行系統(tǒng)分類，將木霉屬分為9個(gè)復(fù)合種，分別是綠色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）、黃綠木霉（T.aureovirid）、哈茨木霉（T.harzianum）、長(zhǎng)枝木霉（T.longibrachiatum）、擬康氏木霉（T.pseudokoningii）、鉤狀木霉（T.hamatum）、多孢木霉（T.polysporum）和小球木霉（T.piluliferm）。Bissett根據(jù)木霉菌的性狀特征并結(jié)合前人的研究結(jié)果，提出了一個(gè)新的分類系統(tǒng)，引進(jìn)了組（section）的概念，將木霉屬重新劃分成了 5個(gè)組：長(zhǎng)枝組（Longibraehiatum）、土星孢組（Satumisporum）、木霉組（Trichoderma）、厚基組（Paehybasium）和肉座組（Hypocreaum）。我國(guó)對(duì)木霉屬真菌的分類研究，大多集中在對(duì)木霉應(yīng)用的開(kāi)發(fā)上。1993年，文成敬等[6]從西南地區(qū)的土壤中分離鑒定出9個(gè)木霉種，分別是哈茨木霉（T.harzianum）、擬康氏木霉（T.pseudokoningii）、長(zhǎng)枝木霉（T.longibrachiatum）、深綠木霉（T.atroviride），桔綠木霉（T.citrinoviride）、綠色木霉（T.viride）、鉤狀木霉（T.hamatum）、康氏木霉（T.koningii）及黃綠木霉（T.aureovirid）。2005年，章初龍等[7]從河北、浙江及云南等地分離到了8個(gè)已知種的木霉菌，4個(gè)新紀(jì)錄木霉種，包括棘孢木霉（T.asperllum）、淡黃木霉（T.cerinum）、螺旋木霉（T.spirale）、茸狀木霉（T.veletinum）。2006年，孫軍等[8]從遼寧省的土樣和植物組織中分離鑒定出了 12種木霉，其中 11種為已知種，長(zhǎng)孢木霉（T.longipilis）為中國(guó)新紀(jì)錄種。據(jù)報(bào)道，危害香菇、平菇等食用菌的木霉種類主要有哈茨木霉、康氏木霉、綠色木霉和長(zhǎng)枝木霉[9-14]等。

目前對(duì)食用菌木霉病害的鑒定主要是采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法。形態(tài)學(xué)觀察包括菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率、有無(wú)揮發(fā)性氣體產(chǎn)生等；木霉分子生物學(xué)鑒定主要是根據(jù)真菌核酸序列的rDNA在18S和28S區(qū)域具有保守性，在ITS區(qū)段又存在著水平上的差異，通過(guò)對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序來(lái)檢測(cè)真菌。Kim等[15]運(yùn)用形態(tài)學(xué)和 ITS結(jié)合的方法在培養(yǎng)香菇的椴木上鑒定出一種新木霉T.mienum。張廣志等[16]利用形態(tài)學(xué)和ITS序列比對(duì)分析相結(jié)合的方法從阿魏菇腐爛菌蓋上分離出一株側(cè)耳木霉。程麗云等[17]利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法從福建的食用菌及土壤中分離得到125株木霉，鑒定出5個(gè)種。2010年李廣記等[18]通過(guò)ITS序列和形態(tài)學(xué)分類方法對(duì)華東地區(qū)采集到的木霉菌株進(jìn)行鑒定，得到一株擬康氏木霉（T.koningiopsis）。

近年來(lái)，泉州市食用菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷發(fā)展壯大，平菇逐漸形成規(guī)模化生產(chǎn)，但平菇病害發(fā)生嚴(yán)重，影響平菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，給菇農(nóng)造成較大損失。其中，木霉病發(fā)病速度快，可造成嚴(yán)重減產(chǎn)或使平菇失去商業(yè)價(jià)值。木霉種類多，不同地區(qū)木霉的優(yōu)勢(shì)種類不同，不能進(jìn)行有效的針對(duì)性的治理。關(guān)于泉州市平菇木霉菌的主要種類尚未見(jiàn)報(bào)道，筆者將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)手段相結(jié)合，對(duì)平菇木霉菌進(jìn)行菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

PDA固體培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，pH 6.8~7.0，121℃滅菌30 min；PDA液體培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 平菇病害樣品采集2020年分別于泉州市惠安縣和豐澤區(qū)等地的平菇工廠觀察病害癥狀，隨機(jī)采集樣品，進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 病原菌的分離純化打開(kāi)超凈工作臺(tái)紫外滅菌20 min，關(guān)閉紫外后通風(fēng)5 min；點(diǎn)燃酒精燈，燒熱接種環(huán)，待涼后用接種環(huán)刮取發(fā)病部位霉層，采用平板劃線的方法進(jìn)行分離，在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，貼好封口膜，放置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)；48 h后等菌絲長(zhǎng)出后再進(jìn)行純化，如此重復(fù)純化3~4次后，將得到的病原菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面上，待菌落較為豐滿或有大量孢子產(chǎn)生時(shí)放于 4℃冰箱保存[19]。

1.2.3 形態(tài)特征觀察及性狀測(cè)定將分離到的菌株接種到 PDA固體培養(yǎng)基平板上，于 28℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)，顏色反應(yīng)，菌體大小。

1.2.4 16 S rDNA分子鑒定

1.2.4 .1 基因組 DNA 提取將分離出來(lái)的致病菌接種于PDA液體培養(yǎng)基上，放置于120 r/min的搖床上培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)好的菌液以100 000 g室溫下離心 30 s，收集沉淀的菌體，按照生工SK1201-UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。

1.2.4 .2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序引物序列：7F（5′CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′），1540R（1522）（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），由上海生工生物工程有限公司提供。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：1 μL基因組 DNA（10 pmol），引物各 1 μL（10 μmol/L），1 μL dNTPs（10 mmol/L），5 μL 10×PCRbuffer，0.25 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），加水至 50 μL。

PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸8 min。

PCR產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì)，得出單克隆菌株所屬分類地位。選取每個(gè)單克隆菌株的近緣序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 泉州市平菇病害發(fā)生情況

2020年4月至2020年10月對(duì)泉州市惠安、豐澤等地的菇廠進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性真菌病害普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重。通過(guò)本次調(diào)查可知，泉州市平菇真菌性病害主要表現(xiàn)為平菇菌袋或培養(yǎng)料受到病原菌的污染，平菇菌絲不能正常生長(zhǎng)（圖1）。

圖1 平菇病害癥狀

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的形態(tài)鑒定經(jīng)菌落形態(tài)觀察，本次分離到3種真菌。其主要形態(tài)特征如下：

菌株P(guān)1在PDA平板上，菌落生長(zhǎng)迅速，致密棉絮狀。菌落起初為白色，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng) 3 d后菌落顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，反面為無(wú)色（圖2）。菌株P(guān)1形態(tài)特征與John Bisset[20]和張廣志等[21]描述的里氏木霉一致，故將菌株P(guān)1初步鑒定為里氏木霉（Trichoderma reesei）。

圖2 菌株P(guān)1（里氏木霉）

菌株P(guān)2在PDA平板上，菌落迅速生長(zhǎng)，培養(yǎng) 2~3 d后，可產(chǎn)生簇狀白色氣生菌絲；菌落剛開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)為白色，后轉(zhuǎn)變?yōu)榈G色，培養(yǎng)3 d后表現(xiàn)為墨綠色，在產(chǎn)孢簇邊緣形成白色流蘇狀菌絲（圖3）。菌株 P2的形態(tài)特征與 John Bissett[22]及張廣志等[21]對(duì)側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola）的描述一致，因此初步將菌株P(guān)2鑒定為側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。

圖3 菌株P(guān)2（側(cè)耳木霉）

菌株P(guān)3在PDA平板上生長(zhǎng)迅速，菌絲初期呈白色毛氈狀，3 d后產(chǎn)孢并變?yōu)闇\綠色；菌落老熟時(shí)為茶綠色，背面由白色變?yōu)辄S色（圖4）。菌株P(guān)3與Bissett[23]描述的長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的形態(tài)結(jié)構(gòu)一致，故將菌株 P3初步鑒定為長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

圖4 菌株P(guān)3（長(zhǎng)枝木霉）

2.2.2 木霉菌序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析將分離純化后的菌株P(guān)1、P2、P3提取基因組DNA后，利用PCR對(duì)其ITS片段進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序得到3條不同的堿基序列；將3條序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast序列檢索（表1）；各選取2個(gè)相似度較高的序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。根據(jù)Bissett系統(tǒng)的分組情況，并結(jié)合進(jìn)化樹(shù)可以看出，P1菌株的序列與里氏木霉（Trichoderma reesei）的遺傳距離最近，P2菌株與側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola）的遺傳距離最近，P3菌株與長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的遺傳距離最近，都各自聚在一個(gè)小分枝里；因此，結(jié)合其形態(tài)特征和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將菌株P(guān)1鑒定為里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株 P2鑒定為側(cè)耳木霉（Trichoderma pleuroticola），菌株 P3鑒定為長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。菌株P(guān)1所處的這個(gè)分枝與P3的分枝聚在一起，共同屬于長(zhǎng)枝組（set.longibachiatum），P2菌株所在的小分枝則屬于厚基孢組（set.pachybasium）。

表1 平菇木霉病菌16S rDNA序列的Blast比對(duì)結(jié)果

圖5 三株木霉ITS系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

平菇為木腐生營(yíng)養(yǎng)型的食用菌，主要以多種含有纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素成分的玉米芯、稻草等為培養(yǎng)料。絕大多數(shù)的木霉是纖維素酶的生產(chǎn)菌株，因此，木霉成為食用菌生產(chǎn)中主要的栽培料污染菌；同時(shí)，食用菌的栽培料也有適于木霉的生長(zhǎng)。泉州夏天高溫時(shí)間較長(zhǎng)，平菇病蟲(chóng)危害嚴(yán)重，有的菇廠木霉污染率高達(dá)90%以上，菇農(nóng)損失慘重。為了分離與鑒定危害平菇的病菌，明確危害菌的種類，筆者利用純培養(yǎng)特征和分子鑒定相結(jié)合的手段，初步確定了泉州地區(qū)平菇栽培過(guò)程中污染菌的種類，主要有里氏木霉、長(zhǎng)枝木霉和側(cè)耳木霉，為有針對(duì)性地進(jìn)行病害防治奠定了基礎(chǔ)。由于真菌核酸序列的rDNA在18S和28S區(qū)域具有保守性，通過(guò)對(duì) ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序來(lái)檢測(cè)病原真菌的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用。

研究鑒定木霉菌屬對(duì)病害的發(fā)生和防治有著重要的作用。泉州屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，冬天主要受蒙古冷高壓控制，盛行偏北風(fēng)，氣溫低，干燥少雨；夏季受副熱帶高壓影響，盛行偏南風(fēng)，氣溫高，濕潤(rùn)多雨。泉州夏季高溫高濕的天氣，有利于木霉病害大面積迅速爆發(fā)。因此，確定了木霉病菌的種類，在食用菌病害防治方面更有針對(duì)性，并可根據(jù)天氣合理安排栽培時(shí)間，避開(kāi)病害高發(fā)期，或選擇抗病品種，加強(qiáng)管理。

隨著木霉在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用越來(lái)越多，木霉分類學(xué)的研究也越深入[24-25]。本研究旨在明確平菇生產(chǎn)中污染菌木霉的種群結(jié)構(gòu)，從而為木霉病害的安全防治提供理論依據(jù)。