野生側(cè)耳分子鑒定及生物栽培轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究

楊春成，覃 雯，武 琳，尹立偉*

（1.皖西南生物多樣性研究與保護(hù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246133；2.安徽省功能配合物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安慶師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 安慶 246133）

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus），又名側(cè)耳、平菇、蠔菇、黑牡丹菇，在臺(tái)灣又稱之為秀珍菇，其分類學(xué)地位是真菌界下的擔(dān)子菌亞門側(cè)耳科側(cè)耳屬[1-3]。糙皮側(cè)耳是一種常見的食藥用菌，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有蛋白多糖、甾類化合物、微量元素、氨基酸等多種成分，具備消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)理、調(diào)節(jié)婦女更年期綜合征、改善人體新陳代謝等多種藥理功能，在我國(guó)栽培歷史悠久、栽培面積廣[4-7]。王麗寧等研究發(fā)現(xiàn)糙皮側(cè)耳中過氧化氫酶CAT參與真菌脅迫響應(yīng)和發(fā)育過程的遺傳變異、基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化地位[8]。侯志浩通過生物信息學(xué)方法鑒定了糙皮側(cè)耳中Zn2Cys6型鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員（PoZCPs），并對(duì)其參與熱脅迫和子實(shí)體發(fā)育的家族成員PoZCP26功能及其下游基因調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了分析研究[9]。馬倩倩利用糙皮側(cè)耳粗酶液中的漆酶對(duì)7種不同結(jié)構(gòu)類型的染料進(jìn)行了脫色研究，發(fā)現(xiàn)漆酶對(duì)蒽醌類和苯甲烷類染料脫色顯著，對(duì)苯胺類和雜環(huán)類染料脫色良好，對(duì)偶氮染料脫色效果差[10]。

糙皮側(cè)耳已成為我國(guó)大宗蔬菜品種之一，市場(chǎng)需求量大、種植量多、栽培原料來源廣泛，以其為主要原料的休閑食品、保健品等精加工產(chǎn)品有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ俏覈?guó)鄉(xiāng)村脫貧致富的“小、易、速”事業(yè)[11]。野生側(cè)耳已瀕臨滅絕，種植側(cè)耳存在轉(zhuǎn)代次數(shù)多，朵形、味道差，產(chǎn)量不高，食用后功效不理想，栽培技術(shù)落后、污染大、風(fēng)險(xiǎn)高等問題。安徽省安慶市地屬亞熱帶季風(fēng)性氣候，冬暖夏熱、氣候濕潤(rùn)，適宜野生真菌室內(nèi)栽種。本文以野生側(cè)耳屬菌株為實(shí)驗(yàn)材料，探究側(cè)耳室內(nèi)生物栽培轉(zhuǎn)化技術(shù)與管理體系，為當(dāng)?shù)卮笈镌耘嗖谄?cè)耳提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

野生側(cè)耳PO1（WildP.ostreatus）于2019年2月采摘自安徽省安慶市安慶師范大學(xué)龍山校區(qū)某樟樹上，分離鑒定后于4°C保存在生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室，同時(shí)，栽培轉(zhuǎn)化的糙皮側(cè)耳PO2培養(yǎng)于學(xué)院食藥用菌栽培研究室G503。武漢平菇側(cè)耳（P.ostreatus）于2019年5月購(gòu)自武漢市周玉麟食用菌研究所。

1.2 培養(yǎng)基配制

母種PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、瓊脂10 g、蒸餾水補(bǔ)足500 ml，裝試分管，121°C 滅菌30 min后擺斜面[12]。

原種棉籽殼培養(yǎng)基：棉籽殼90%，麩皮4.5%，玉米粉4.5%，石膏粉1%，加水混合至約65%，pH 為5.5～6.5，配制10 kg的玻璃瓶原種培養(yǎng)基。

栽培種木屑培養(yǎng)基：雜木屑78%、麩皮或米糠20%、石膏粉1%、蔗糖1%、加水混合至50%～60%，裝制栽培料時(shí)達(dá)到手握料有水但不滴出為宜，pH為6.5左右，配制100 kg的塑料袋栽培種培養(yǎng)基，最后制成側(cè)耳菌袋[13-15]。

1.3 野生側(cè)耳形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

對(duì)野生側(cè)耳培養(yǎng)特性進(jìn)行觀察，將載玻片45°傾斜插入生長(zhǎng)7～9 d菌種的培養(yǎng)基中，室溫培育12 h后取出，觀察側(cè)耳菌絲的形成、色澤、構(gòu)造以及是否有分隔等宏觀和微觀生長(zhǎng)特性。采用細(xì)胞破壁儀充分研磨至破壁，利用真菌試劑盒（UNIQ-10柱式）提取總DNA，獲得側(cè)耳基因組DNA。最后，取2 μl溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)DNA樣品純度。以野生側(cè)耳基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μl，采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR 反應(yīng)條件：94°C 預(yù)變性5 min，94°C 變性30 s，55°C 退火45 s，72°C 延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min，終止溫度4°C。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并測(cè)序。在NCBI中提交側(cè)耳菌株P(guān)O1的ITS序列，對(duì)相似菌種ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并利用ClustalW 2.0軟件進(jìn)行序列質(zhì)檢，最后，采用MEGA 6.1軟件的NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16-17]。

1.4 側(cè)耳的室內(nèi)栽培管理

糙皮側(cè)耳栽培采用熟料與生料兩種培養(yǎng)方式，各培養(yǎng)200 袋，室內(nèi)培養(yǎng)2 個(gè)月，側(cè)耳菌絲體的生長(zhǎng)溫度以（22～28）°C為宜，子實(shí)體在（5～24）°C之間均能分化且出菇以（85～95）%的空氣相對(duì)濕度為宜。側(cè)耳菌種的轉(zhuǎn)接需在接種箱內(nèi)操作，發(fā)菌時(shí)轉(zhuǎn)至滅菌室避光培養(yǎng)，側(cè)耳菌絲在暗環(huán)境下長(zhǎng)滿整袋后搬到出菇室出菇，子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育只需散射光。優(yōu)質(zhì)原種和栽培種菌齡以（20～25）d為宜，側(cè)耳原基分化和子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育階段的嚴(yán)格管理是側(cè)耳高產(chǎn)的關(guān)鍵。側(cè)耳原基形成期時(shí)，應(yīng)增加照射強(qiáng)度和照射時(shí)間、環(huán)境相對(duì)濕度和空氣更替，并將溫度降至17°C左右，擴(kuò)大晝夜溫差以加快原基形成。在桑葚期要保持充足的相對(duì)濕度，可向環(huán)境中噴灑水霧，應(yīng)避免直接往培養(yǎng)料灑水。菇柄長(zhǎng)短與種類和環(huán)境條件有關(guān)，要做好室內(nèi)溫/濕度、通風(fēng)及散射光的管理工作。在菌蓋生長(zhǎng)期，溫度28°C為宜，相對(duì)濕度應(yīng)在87%以上。菌蓋處于基本展開狀態(tài)，長(zhǎng)達(dá)（8～10）cm，菌肉肥美，氨基酸含量高，顏色由深灰色變?yōu)榈疑蚧野咨?，孢子尚未彈射，此時(shí)采摘最為合適觀察，采收時(shí)不論大小，一次采完，留下小的菇蕾待發(fā)菌培養(yǎng)二潮菌菇[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生側(cè)耳的生物學(xué)特性

野生側(cè)耳母種培養(yǎng)采用PDA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)（8～10）d 后菌絲可長(zhǎng)滿平皿。生長(zhǎng)（3～7）d 的初生菌絲，如圖1A～B所示，側(cè)耳菌絲粗壯整齊、潔白濃密、呈匍匐絨毛狀、多分枝、有橫隔，菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌苔濃白；氣生菌絲爬壁力強(qiáng)；菌絲長(zhǎng)滿斜面時(shí)，子實(shí)體原基尚未分化，培養(yǎng)基未收縮，無雜菌；單核菌絲較纖細(xì)。在10～20倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，糙皮側(cè)耳二級(jí)菌絲粗壯，爬壁能力強(qiáng)，雙核菌絲有鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，如圖1C～D所示。

圖1 糙皮側(cè)耳的生物學(xué)培養(yǎng)特性

2.2 野生側(cè)耳PCR擴(kuò)增結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)野生側(cè)耳菌株P(guān)O1的ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了636 bp的核苷酸序列，將該序列提交到GenBank（登錄號(hào)為MT261808.1），見圖2 所示，ITS1 序列紅色區(qū)段是（1～217）bp，5.8S rDNA 序列藍(lán)色區(qū)段是（218～410）bp；ITS2 序列黃色區(qū)段是（411～574）bp，28S 序列黑色區(qū)段是（575～636）bp。將菌株P(guān)O1與100個(gè)同源菌株進(jìn)行對(duì)比，證明PO1與其他54株側(cè)耳（P.ostreatus）菌株親緣關(guān)系較為密切，ITS序列最小覆蓋率超過98%，且相似性達(dá)99.0%，與30株佛州側(cè)耳（Pleurotus florida）覆蓋率也為97%以上，與2株杏鮑菇（Pleurotus eryngii）相似性分別達(dá)99.2%和99.8%，與3株美味側(cè)耳（Pleurotus sapidus）最小相似性為99.4%，與1株大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）相似性為99.7%，與1株鮑魚菇（Abalone mushroom）的覆蓋率為97%，與其他9株側(cè)耳屬菌株的相似性超過98.6%。

圖2 野生側(cè)耳PO1的I TS序列分析

利用MEGA6.1軟件的NJ聚類法構(gòu)建出側(cè)耳屬的不同菌株間的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3 所示，菌株P(guān)O1（※表示野生側(cè)耳PO1）與5 株糙皮側(cè)耳菌株最為親密，與4 株佛州側(cè)耳（P.florida）關(guān)系緊密，與3株美味側(cè)耳（P.sapidus）、2 株杏鮑菇（P.eryngii）、1株鮑魚菇（P.abalonus）、1 株大伏革菌（P.gigantea）的遺傳距離也較接近。選取側(cè)耳屬的3株金頂側(cè)耳（P.citrinopileatus），2株白阿魏側(cè)耳（P.nebrodensis），2株肺形側(cè)耳（P.pulmonarius），4 株白黃側(cè)耳（P.cornucopiae），它們之間的親緣關(guān)系最為接近。另外，還選取了1 株草菇（Volvariella volvacea）作為另一組群，雖然側(cè)耳與草菇同屬傘菌目，但草菇為小包腳菇屬的小包腳菇（V.volvacea），而側(cè)耳屬于側(cè)耳科側(cè)耳屬，兩者在遺傳距離上較遠(yuǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹揭示了野生側(cè)耳PO1不是外源種，與草菇有區(qū)別，分子鑒定菌株P(guān)O1為糙皮側(cè)耳。

圖3 側(cè)耳屬不同菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

2.3 糙皮側(cè)耳生物栽培轉(zhuǎn)化結(jié)果

糙皮側(cè)耳采用熟料與生料2種培養(yǎng)方式，菌絲生長(zhǎng)需2個(gè)月，在溫/濕度以及光線等環(huán)境條件嚴(yán)格管控下，菌絲生長(zhǎng)速度分別為0.433 cm/d和0.405 cm/d，結(jié)合優(yōu)化的栽培種培養(yǎng)基配料，熟料采用高溫高壓方式，滅菌5 h 以上，萌發(fā)24 d 的菌絲發(fā)菌率可達(dá)99%以上，而未滅菌生料26.5 d 的菌絲發(fā)菌率僅為68%，且栽培過程易出現(xiàn)綠色霉菌。試驗(yàn)表明，添加1:1 000克霉靈，并進(jìn)行高溫高壓滅菌、室內(nèi)消毒等操作，可以防止在栽種過程中產(chǎn)生其他雜菌。重要的是，在拌料過程中水分不均勻會(huì)導(dǎo)致后期發(fā)菌過程菌袋內(nèi)濕度大，從而易出現(xiàn)黃色霉菌；在滅菌過程中部分菌袋會(huì)破裂，后期亦出現(xiàn)綠霉；培養(yǎng)料的處理方式也會(huì)明顯影響側(cè)耳生長(zhǎng)。本次熟料栽培的糙皮側(cè)耳生物轉(zhuǎn)化率為158%，而生料栽培的生物轉(zhuǎn)化率為143%。珊瑚期半球狀長(zhǎng)成菇蕾，并繼續(xù)伸長(zhǎng)形成菇柄，當(dāng)有大量孢子散發(fā)時(shí)，側(cè)耳質(zhì)量已變差，如圖4A～C所示。與野生側(cè)耳PO1和武漢平菇側(cè)耳相比，生物栽培轉(zhuǎn)化的糙皮側(cè)耳PO2 朵型豐滿、顏色灰白、整齊規(guī)則、產(chǎn)量高，如圖4D～E所示。采收后放入雙孔透氣一次性采收盒。一周后繼續(xù)噴水，仍按第一批出菇的種植采收程序進(jìn)行管理。按側(cè)耳菇市場(chǎng)均價(jià)6元/kg計(jì)算，本次栽培側(cè)耳收益約800 元，三潮菇從產(chǎn)量和品質(zhì)上都不及頭潮菇和二潮菇，尤其是口感木質(zhì)化嚴(yán)重。側(cè)耳成熟后潮次明顯，每批側(cè)耳收獲后料面均需清洗整理，并停水繼續(xù)養(yǎng)菌。

圖4 野生側(cè)耳PO1、武漢平菇側(cè)耳與糙皮側(cè)耳PO2子實(shí)體對(duì)比

3 結(jié)論與討論

安慶師范大學(xué)龍山校區(qū)的校園生境適宜野生側(cè)耳的生長(zhǎng)，從枯死樟樹上發(fā)現(xiàn)了大型真菌的存在，這種野生菌可在離體和人工培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化。將純培養(yǎng)菌絲接種到含有相同培養(yǎng)基質(zhì)的栽培料可以獲得相同的野生菌培養(yǎng)物，并得到與接種物相同的性狀?；趥?cè)耳ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，PO1與5株側(cè)耳P.ostreatus（P8、NW449、TNAUCBE1、B2SN043和Tianda300）親緣關(guān)系最為接近。野生菌PO1與生物栽培轉(zhuǎn)化的PO2同源性高達(dá)99.9%，表明其菌絲具備穩(wěn)定遺傳的生物學(xué)特性。宋立志基于ITS序列對(duì)側(cè)耳屬進(jìn)行了分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，研究結(jié)果為進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌種、優(yōu)化母種，提高生產(chǎn)量提供了重要參考信息[19]。王強(qiáng)等通過測(cè)定7 個(gè)側(cè)耳屬木質(zhì)纖維素酶活性發(fā)現(xiàn)，平菇菌株漆酶活性可達(dá)189.11 U/mL，而纖維素酶活性可達(dá)31.60 U/mL，該研究揭示了側(cè)耳是木腐菌，具有降解木質(zhì)纖維素的功能[20]。側(cè)耳栽培多以木屑等為主原料，對(duì)木屑降解的速率及程度將直接影響側(cè)耳子實(shí)體的生長(zhǎng)大小、快慢和周期。趙光輝等概述了平菇人工栽培中生料、熟料、發(fā)酵料、發(fā)酵-半熟料等4 種栽培模式的優(yōu)缺點(diǎn)[21-22]，為種植戶提供了側(cè)耳的栽培管理技術(shù)。

側(cè)耳栽培過程通常要處于暗環(huán)境條件下，溫度28°C左右、濕度80%以上、適宜的栽培料配比等都是提高側(cè)耳產(chǎn)量的重要條件，在人工栽培時(shí)需根據(jù)菌種綜合考慮。新鮮糙皮側(cè)耳PO2子實(shí)體長(zhǎng)勢(shì)水潤(rùn)脆嫩、肥厚、朵型大、抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高。王永斌[23]發(fā)現(xiàn)平菇黑平王品種的總生物轉(zhuǎn)化率為100%以上，而本研究的生物轉(zhuǎn)化率高達(dá)158%，經(jīng)過栽培轉(zhuǎn)化的糙皮側(cè)耳PO2產(chǎn)量要高于市售平菇側(cè)耳產(chǎn)量，提高了生物栽培轉(zhuǎn)化產(chǎn)能，達(dá)到高產(chǎn)目的，可以開展大棚種植，為農(nóng)民大棚栽培管理技術(shù)提供了參考依據(jù)。