不同貯藏溫度對(duì)糙皮側(cè)耳冷藏后貨架期品質(zhì)和細(xì)胞壁變化的影響

李甜竹，劉 熙，王政鈞，孫玉文，郝永勝，伊亮輝，胡克玲

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥 230036）

【研究意義】糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）俗稱平菇，是我國栽培最廣泛的食用菌之一。由于其子實(shí)體表面缺乏保護(hù)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致采后糙皮側(cè)耳極易受到機(jī)械損傷，表現(xiàn)為質(zhì)地變軟、褐變、水分流失等，嚴(yán)重縮短了糙皮側(cè)耳的貨架期[1-2]。低溫貯藏是目前國內(nèi)外食用菌保鮮最常用的方法之一。低溫抑制菌柄伸長、菌蓋開傘，減緩酶活性和微生物生長，降低呼吸作用，防止食用菌采后失水，減少失重率和干物質(zhì)的損耗，有效抑制蛋白質(zhì)的分解[3]。在低溫貯藏下，糙皮側(cè)耳的貯藏壽命從常溫1～3 d 延遲到10 d 左右[4]。園藝產(chǎn)品的貨架壽命是實(shí)現(xiàn)自身經(jīng)濟(jì)價(jià)值極其關(guān)鍵的時(shí)刻[5]，而溫度又是影響園藝產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮和貨架期保鮮效果的關(guān)鍵因子[6]，當(dāng)產(chǎn)品從貯藏環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)至貨架上時(shí)，其生理上發(fā)生著一系列的變化，這些變化在貯藏期不易被察覺，但在貨架期會(huì)明顯地表現(xiàn)出來[7]。【前人研究進(jìn)展】早期研究[8]表明，當(dāng)貯藏溫度從2 ℃上升到18 ℃，糙皮側(cè)耳的呼吸速率迅速增加。對(duì)比10 ℃貯藏條件，0 ℃低溫保鮮的糙皮側(cè)耳蒸騰速率降低了約1/3[9]。低溫影響采后園藝產(chǎn)品細(xì)胞壁顯微、超微結(jié)構(gòu)變化，推遲細(xì)胞壁膨脹等衰老現(xiàn)象的發(fā)生，使細(xì)胞壁得到保護(hù)[10]。譚志勇等[11]對(duì)食用菌不同貯藏保鮮效果的研究表明，低溫使食用菌的保鮮時(shí)間明顯延長。低溫貯藏過程中發(fā)生的木質(zhì)化現(xiàn)象，導(dǎo)致貯藏產(chǎn)品硬度增加，質(zhì)地變差，且只有當(dāng)轉(zhuǎn)入常溫貨架期間才明顯地表現(xiàn)出來。研究發(fā)現(xiàn)，0 ℃冷藏后貨架期的華山梨由于失水萎蔫，導(dǎo)致果柄干枯、褐變[12]。蘋果冷藏期及貨架期生理品質(zhì)變化的研究表明，冷藏后室溫貨架的果實(shí)較冷藏果實(shí)硬度更低[13]。隨著冷藏時(shí)間的延長，藍(lán)莓果實(shí)MDA 含量在貨架期顯著增加，膜脂過氧化程度加劇[14]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于園藝產(chǎn)品采后保鮮技術(shù)的研究多集中在貯藏過程，較少涉及冷藏后貨架期產(chǎn)品品質(zhì)的變化情況。因此，探究不同貯藏溫度對(duì)糙皮側(cè)耳冷藏后貨架期品質(zhì)和細(xì)胞壁變化的影響尤為重要，以期為糙皮側(cè)耳的保鮮、貯藏及加工運(yùn)輸提供更加全面的參考依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過設(shè)置不同貯藏低溫，對(duì)糙皮側(cè)耳進(jìn)行冷藏處理，隨后轉(zhuǎn)入常溫貨架期，分析貨架期間兩種冷藏溫度對(duì)糙皮側(cè)耳的外觀品質(zhì)、抗氧化能力、細(xì)胞壁水解酶活性以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化的影響，探究不同貯藏溫度對(duì)糙皮側(cè)耳冷藏后貨架期品質(zhì)和細(xì)胞壁變化的影響。以期為糙皮側(cè)耳的貯藏、保鮮及運(yùn)輸加工提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)新鮮糙皮側(cè)耳采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌培養(yǎng)中心，品種為‘早秋615’。選取菌蓋充分展開，邊緣緊收，菌蓋直徑5 cm左右，自然色澤，下凹部分開始出現(xiàn)白色毛狀物的糙皮側(cè)耳適時(shí)采收，采后迅速運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 本試驗(yàn)共分為2 個(gè)處理：（1）1 ℃低溫處理：糙皮側(cè)耳存放于聚乙烯（PE）保鮮袋中，自然敞口，放入1 ℃冰箱中貯藏；（2）5 ℃低溫處理：糙皮側(cè)耳在自然敞開的PE保鮮袋中于5 ℃冰箱中貯藏。2 個(gè)處理的試驗(yàn)材料分別貯藏6 d 后，轉(zhuǎn)至模擬貨架期（20 ℃）溫度的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏3 d，每天測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 測定項(xiàng)目及方法 （1）硬度。硬度測定使用CT3質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行檢測，方法采用TPA 質(zhì)構(gòu)分析對(duì)糙皮側(cè)耳菇蓋進(jìn)行測定分析，設(shè)置目標(biāo)為4.0 mm、觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載0.07 N、測試速度0.50 mm/s、返回速度0.5 mm/s、探頭選取TA44型號(hào)、夾具選取TA-RT-KIT型號(hào)。

（2）失重率。將糙皮側(cè)耳平均稱質(zhì)量，每個(gè)處理分成4份，每天測定質(zhì)量變化。

失重率（%）＝（貯藏前質(zhì)量-貯藏后質(zhì)量）/貯藏前質(zhì)量×100%。

（3）MDA 含量。參考曹健康等[15]的方法做適當(dāng)修改。取0.5 g 樣，研磨并定容至5 mL，4 500 r/min 離心10 min，提取上清液加TBA，沸水浴10 min 迅速冷卻，4 500 r/min 下離心10 min，取上清液測OD532和OD600吸光度。

（4）POD、CAT 活性。參照Hu 等[16]的方法。取0.5 g 樣，加PBS 研磨成勻漿，4 000 r/min 離心15 min，上清液為粗酶提取液，用來測定POD 和CAT 活性。POD 活性測定：加入3 mL 反應(yīng)混合液和1 mL 酶液，混合液加PBS 作為對(duì)照，立即秒表計(jì)時(shí)，測OD470吸光度，以每分鐘A470變化0.01 為一個(gè)POD 活性單位（U）。CAT活性測定：反應(yīng)液為0.2 mL粗酶液加1.5 mL PBS和1 mL蒸餾水，對(duì)照管沸水浴1 min。逐管加入1 mol/L H2O2，立即秒表計(jì)時(shí)，測OD240吸光度，以每分鐘A240變化0.01為一個(gè)CAT活性單位（U）。

（5）Cx 活性。參照劉德海等[17]的方法做適當(dāng)修改。取0.5 g 樣，用蒸餾水研磨并定容至25 mL，酶液稀釋10 倍。取4 支試管，各加入羧甲基纖維素鈉溶液2 mL，50 ℃保溫3 min，向空白管加入DNS 2.5 mL，測定管各加入酶液0.5 mL，立即50 ℃保溫30 min，再于空白管中加0.5 mL 酶液。3 支樣品管各加2.5 mL DNS，沸水浴10 min，以空白管調(diào)零，測OD540吸光度值。

（6）糙皮側(cè)耳石蠟切片制作。每隔24 h從20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中各取1 ℃、5 ℃低溫處理糙皮側(cè)耳1枚，在菌蓋處剪下0.5 cm×0.5 cm 大小部位，放入標(biāo)本瓶。倒入FAA 固定液浸沒材料，于4 ℃冰箱中固定24 h以上。隨后將糙皮側(cè)耳組織取出，將目的部位組織修平整放于脫水盒內(nèi)，將脫水盒放進(jìn)吊籃里于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水浸蠟。將浸好蠟的糙皮側(cè)耳組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋，最后將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)切片，用苯胺藍(lán)染液對(duì)切片進(jìn)行染色，中性樹膠進(jìn)行封片[28]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 和SPSS17.0 進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)差異顯著性分析。數(shù)據(jù)在0.05 水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳硬度的影響

由圖1 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，兩處理的硬度均呈現(xiàn)下降趨勢。5 ℃冷藏的糙皮側(cè)耳在貨架期3 d 內(nèi)緩慢下降，且貯藏1 d 后硬度高于1 ℃貯藏糙皮側(cè)耳，差異性不顯著。1 ℃貯藏的糙皮側(cè)耳硬度在貨架期0～1 d迅速下降，隨后變化平穩(wěn)。由此可知，5 ℃冷藏后的糙皮側(cè)耳在貨架期較1 ℃能更好地抑制硬度的下降，保持糙皮側(cè)耳的硬度。

2.2 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳失重率的影響

由圖2 可知，在貨架期間糙皮側(cè)耳的失重率始終處于上升趨勢，5 ℃處理大于1 ℃處理。在貨架期0～1 d，兩處理糙皮側(cè)耳失重率上升幅度變化差異較小，隨著貨架期的延長，5 ℃冷藏后的糙皮側(cè)耳失重率上升更快，且在貨架期第3天顯著高于1 ℃貯藏糙皮側(cè)耳。綜上可知，1 ℃低溫貯藏后的糙皮側(cè)耳能更好的抑制貨架期失重率的上升。

圖1 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳硬度的影響Fig.1 Effect of different treatments on the firmness of Pleurotus ostreatus

圖2 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳失重率的影響Fig.2 Effects of different treatments on the weight loss rate of Pleurotus ostreatus

2.3 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳MDA含量的影響

由圖3 可知，在貨架期間，5 ℃冷藏后的糙皮側(cè)耳MDA 含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢且明顯大于1 ℃貯藏處理組，在貨架期第1 天達(dá)到最大峰值，隨后迅速下降。1 ℃處理組糙皮側(cè)耳MDA 含量在整個(gè)貯藏期間逐漸上升，在貨架期第3天顯著高于5 ℃處理組。由此可知，1 ℃低溫處理后的糙皮側(cè)耳在貨架期MDA含量不斷增加，在第3天超過5 ℃貯藏糙皮側(cè)耳。

2.4 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳POD活性的影響

由圖4可知，隨著貨架期的延長，5 ℃冷藏處理的糙皮側(cè)耳POD 活性在0～1 d迅速增加，1～2 d變化平穩(wěn)，2～3 d 又快速上升。1 ℃處理的糙皮側(cè)耳在貨架期0～3 d 保持較低且平穩(wěn)的變化，顯著低于5 ℃處理組。由此可知，5 ℃處理后的糙皮側(cè)耳POD活性較高，抗氧化能力較強(qiáng)。

圖3 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳MDA含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on the content of MDA in Pleurotus ostreatus

圖4 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳POD活性的影響Fig.4 Effects of different treatments on POD activity in Pleurotus ostreatus

2.5 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳CAT活性的影響

隨著貨架期時(shí)間的延長，1 ℃處理組糙皮側(cè)耳CAT活性迅速下降，在0～2 d高于5 ℃，隨后低于5 ℃處理組。5 ℃處理糙皮側(cè)耳變化平穩(wěn)，在貨架期0～1 d緩慢下降，1～2 d保持平穩(wěn)，2～3 d緩慢上升（圖5）。根據(jù)相關(guān)性分析，在整個(gè)貨架期間，兩處理差異性顯著。綜上所知，在貨架期前2 d，1 ℃低溫處理有更高的CAT活性，2 d后，5 ℃貯藏糙皮側(cè)耳CAT活性更高。

2.6 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳Cx活性的影響

由圖6 可知，1 ℃處理的糙皮側(cè)耳Cx 活性在貨架期間先增加再下降，后保持平穩(wěn)。5 ℃處理在0～1 d迅速下降，1～2 d 逐漸上升，2～3 d 再次下降。在第0 天，5 ℃處理Cx 活性顯著高于1 ℃處理，隨后快速下降，且顯著低于1 ℃處理，2 d后逐漸上升超過1 ℃。在貨架期第3天，5 ℃處理再次低于1 ℃。綜上可知，在貨架期0～2 d，1 ℃低溫處理糙皮側(cè)耳能保持較高的Cx活性，貯藏2～3 d，1 ℃處理變化平穩(wěn)，5 ℃冷藏后的糙皮側(cè)耳Cx活性逐漸降低且低于1 ℃處理。

圖5 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳CAT活性的影響Fig.5 Effects of different treatments on CAT activity in Pleurotus ostreatus

圖6 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳Cx活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on Cx activity in Pleurotus ostreatus

2.7 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響

由圖7可知，隨著貨架期的延長，糙皮側(cè)耳子實(shí)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得雜亂無序，模糊不清。在剛結(jié)束冷藏第0天時(shí)，1 ℃貯藏的糙皮側(cè)耳子實(shí)體細(xì)胞間隙較5 ℃貯藏糙皮側(cè)耳排列有序、結(jié)構(gòu)更加清晰。隨著轉(zhuǎn)至常溫貨架期（20 ℃）以后，1 ℃冷藏處理糙皮側(cè)耳細(xì)胞間隙變化更明顯，排列出現(xiàn)雜亂無章（圖7c、7d），細(xì)胞壁胞間結(jié)構(gòu)變得疏松，細(xì)胞之間相互分離。此結(jié)果與1 ℃冷藏糙皮側(cè)耳在貨架期間Cx活性更高相符合。在貨架期第3天，兩處理糙皮側(cè)耳細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)都變得模糊不清，且1 ℃處理糙皮側(cè)耳細(xì)胞壁更加雜亂，已無法分辨細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)（圖7g、7h）。由此可知，5 ℃處理糙皮側(cè)耳在貨架期間能保持更好的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。

圖7 不同處理對(duì)糙皮側(cè)耳石蠟切片的影響Fig.7 Effects of different treatments on paraffin sections of Pleurotus ostreatus

3 討論與結(jié)論

糙皮側(cè)耳采后品質(zhì)迅速下降，低溫貯藏能夠有效延長糙皮側(cè)耳的貯藏保鮮期，但經(jīng)低溫貯藏一段時(shí)間轉(zhuǎn)入常溫貨架期，糙皮側(cè)耳的生理發(fā)生了一系列的變化。兩種溫度處理冷藏后轉(zhuǎn)入貨架期的糙皮側(cè)耳失重率迅速上升；硬度、CAT 活性呈現(xiàn)下降趨勢；5 ℃冷藏的糙皮側(cè)耳POD 活性逐漸上升，1 ℃糙皮側(cè)耳仍保持在極低的狀態(tài)；1 ℃處理的糙皮側(cè)耳MDA 含量不斷上升，5 ℃處理先增加后下降；Cx 活性在貨架前期表現(xiàn)為相反的變化趨勢，1 ℃處理先增后降，5 ℃處理糙皮側(cè)耳先降后升，貨架后期，1 ℃冷藏糙皮側(cè)耳保持平穩(wěn)，5 ℃處理下降。

硬度是反映糙皮側(cè)耳品質(zhì)的重要指標(biāo)，且受貯藏溫度的影響[18]。隨著貨架期的延長，兩處理組的糙皮側(cè)耳硬度均呈現(xiàn)下降趨勢。在0～1 d，1 ℃處理的糙皮側(cè)耳硬度迅速下降，后變化平穩(wěn)，而5 ℃冷藏的糙皮側(cè)耳在整個(gè)貨架期間硬度下降緩慢。在貨架期0～1 d，1 ℃硬度大于5 ℃，在1～3 d，5 ℃高于1 ℃，維持較高的品質(zhì)，這可能是由于低溫導(dǎo)致了1 ℃貯藏糙皮側(cè)耳木質(zhì)素積累，硬度增加，反應(yīng)在貨架期間。貨架后期，糙皮側(cè)耳失水萎蔫，子實(shí)體干枯，同時(shí)也表現(xiàn)為失重率的增加，這與李麗梅等[12]的結(jié)論相一致。

丙二醛（MDA）含量是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷，MDA含量越低，抗氧化性越強(qiáng)[19]。在貨架期間，5 ℃貯藏糙皮側(cè)耳的MDA含量呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，最終低于1 ℃，而1 ℃冷藏糙皮側(cè)耳的MDA含量始終不斷上升，表明5 ℃處理可以降低MDA含量，減緩膜的損傷。過氧化物酶（POD）作為組織老化的一種生理指標(biāo)，可以催化食用菌組織內(nèi)低濃度的過氧化氫（H2O2）氧化，使組織免受毒害[20]。在整個(gè)貨架期間，5 ℃處理糙皮側(cè)耳POD活性明顯高于1 ℃，表明隨著貨架期的延長，5 ℃貯藏的糙皮側(cè)耳抗氧化能力較強(qiáng)，而1 ℃的POD活性始終處于極低水平。早期研究表明POD作為木質(zhì)素生物合成中的關(guān)鍵酶，POD活性的增加導(dǎo)致糙皮側(cè)耳的木質(zhì)化，并表現(xiàn)為糙皮側(cè)耳組織硬度增加[21]，這與5 ℃貯藏糙皮側(cè)耳貨架期硬度較高的結(jié)論相一致。CAT作為一種抗氧化酶，在活性氧防御系統(tǒng)中扮演著重要的角色[22]，較高的CAT活性可以延緩糙皮側(cè)耳的褐變程度，保持更好的貯藏品質(zhì)[23]。在貨架期間，1 ℃貯藏糙皮側(cè)耳的CAT活性逐漸下降，而5 ℃變化較平穩(wěn)，在貨架期2～3 d逐漸增加并高于1 ℃處理，這表明5 ℃貯藏可以維持較穩(wěn)定的CAT活性，且在貨架期后期保持較高的抗氧化能力和貯藏品質(zhì)。

細(xì)胞壁是維持細(xì)胞形態(tài)的支撐物質(zhì)，食用菌的成熟、軟化、衰老與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及成分的變化密切相關(guān)[24]。纖維素是構(gòu)成食用菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和骨架的主要成分之一，纖維素酶使纖維素降解，從而導(dǎo)致菇體軟化[26]。在貨架期間，5 ℃處理糙皮側(cè)耳的纖維素酶（Cx）整體上低于1 ℃，在貨架期0～2 d，1 ℃處理的糙皮側(cè)耳Cx活性顯著大于5 ℃處理，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)損壞更加嚴(yán)重，反應(yīng)在對(duì)糙皮側(cè)耳菌褶細(xì)胞壁的石蠟切片，5 ℃處理糙皮側(cè)耳的子實(shí)體細(xì)胞間隙較1 ℃排列有序，結(jié)構(gòu)更加清晰。隨著貨架期的延長，1 ℃處理糙皮側(cè)耳細(xì)胞間隙變化更加明顯，排列更雜亂無章，這可能是由于細(xì)胞壁在細(xì)胞壁水解酶的作用下降解，使細(xì)胞壁胞間結(jié)構(gòu)變得疏松，細(xì)胞之間相互分離[25]。

本試驗(yàn)探究了不同貯藏溫度對(duì)糙皮側(cè)耳冷藏后貨架期品質(zhì)和細(xì)胞壁變化的影響，結(jié)果表明，5 ℃貯藏后的糙皮側(cè)耳可以維持較高的硬度、POD 活性，降低Cx 活性和MDA 含量，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)更規(guī)整、有序。而1 ℃貯藏的糙皮側(cè)耳在冷藏階段發(fā)生了木質(zhì)素的積累，木質(zhì)化程度更高，反應(yīng)在貨架期間，導(dǎo)致貨架期的品質(zhì)下降。因此，5 ℃貯藏糙皮側(cè)耳能更好地維持糙皮側(cè)耳冷藏后的貨架期品質(zhì)。