椒樣薄荷脫毒苗的規(guī)?；a(chǎn)研究

郭丹麗 王自健 蔣新明 路喆 李敏 徐盼盼 王樸

摘要[目的]更新伊犁地區(qū)的椒樣薄荷品種，對(duì)伊犁地區(qū)椒樣薄荷進(jìn)行提純及復(fù)壯。[方法]采用組培技術(shù)對(duì)椒樣薄荷品種進(jìn)行莖尖脫毒、離體快繁及大規(guī)模生產(chǎn)。以椒樣5號(hào)為材料，研究大規(guī)模生產(chǎn)下椒樣薄荷莖尖分化、增殖、生根的最適激素濃度。[結(jié)果]可使用白砂糖和瓊脂條代替蔗糖、瓊脂，降低經(jīng)濟(jì)成本；大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，最適椒樣薄荷增殖培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.10 mg/L NAA。[結(jié)論]大規(guī)模組培不同階段所使用基本培養(yǎng)基不同，激素組合也不同，大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)以經(jīng)濟(jì)節(jié)約為主；利用莖尖快繁技術(shù)可快速更新?lián)Q代椒樣薄荷品種。

關(guān)鍵詞椒樣薄荷；脫毒苗；組織培養(yǎng)；提純；復(fù)壯

中圖分類號(hào)S567.23+5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）17-0122-02

Abstract[Objective]To update the peppermint cultivated varieties in Yili area， purify and rejuvenate Yili peppermint. [Method]Shoot tip detoxification， in vitro rapid propagation and mass production of peppermint varieties were conducted by tissue culture technology.Using No.5 pepper as the material， the optimum hormone concentration of peppermint tip differentiation， proliferation and rooting in large scale production was studied.[Result]Sugar and agar bars can be used instead of sucrose and agar to reduce economic costs. In mass production， the optimum proliferation medium of peppermint was 1/2 MS+0.5 mg/L 6BA+0.01 mg/L NAA， and the optimum rooting medium was 1/2 MS+0.10 mg/L NAA. [Conclusion]The basic medium used in different stages of tissue culture was different， and the hormone combinations were different. The technique of rapid propagation of stem tip can be used to quickly update peppermint varieties.

Key wordsPeppermint；Virusfree seedling；In vitro culture；Purify；Rejuvenation

基金項(xiàng)目兵團(tuán)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目（2016AC027）；兵團(tuán)科技支疆項(xiàng)目（2014AB010）；師域發(fā)展創(chuàng)新支持計(jì)劃（2015AF011）。

作者簡(jiǎn)介郭丹麗（1989—），女，新疆伊犁人，助理研究員，從事特色作物遺傳育種研究。*通訊作者，研究員，從事特色作物研究。

收稿日期2017-04-13

新疆椒樣薄荷的栽培種植已有50多年的歷史，種植面積占到全國(guó)種植面積的85%以上，已成為我國(guó)最重要的椒樣薄荷栽培基地。由于椒樣薄荷的栽培歷史悠久，品種更新速度慢，再加上容易感染病毒，伊犁地區(qū)種植的椒樣薄荷優(yōu)良性狀退化，嚴(yán)重影響了椒樣薄荷的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，制約了薄荷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前國(guó)內(nèi)主要采用莖尖剝離方式來(lái)脫去危害薄荷的主要病毒[1]，此方法可有效解決因病毒病而導(dǎo)致的產(chǎn)量、品質(zhì)下降問(wèn)題，不僅可以短時(shí)間內(nèi)獲得大量的無(wú)病毒苗，還保證了各品種的優(yōu)良性狀。莖尖脫毒方法已被廣泛地運(yùn)用到甘蔗[2]、馬鈴薯[3]、人參果[4]等多種植物中，脫毒效果十分明顯。為了改善品種退化、病毒病等嚴(yán)重影響伊犁地區(qū)椒樣薄荷產(chǎn)業(yè)發(fā)展問(wèn)題，該試驗(yàn)針對(duì)伊犁地區(qū)椒樣薄荷主栽品種開(kāi)展脫毒及組織培養(yǎng)研究，探索在大規(guī)模培養(yǎng)條件下椒樣薄荷莖尖成苗的培養(yǎng)基配方。利用莖尖脫毒對(duì)伊犁地區(qū)種植的椒樣薄荷進(jìn)行提純復(fù)壯，大規(guī)?？焖偕a(chǎn)椒樣薄荷脫毒種苗，為解決伊犁地區(qū)椒樣薄荷品種退化問(wèn)題、大規(guī)模生產(chǎn)椒樣薄荷原原種苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為伊犁地區(qū)主要種植的薄荷品種椒樣5號(hào)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基制備。

以MS為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖3%、瓊脂0.7%，pH調(diào)至5.8，在121 ℃高溫下滅菌20 min，等溫度壓力降下來(lái)后，取出培養(yǎng)瓶置于超凈工作臺(tái)上。

1.2.2外植體消毒。

選取椒樣5號(hào)生長(zhǎng)健壯的匍匐莖段，流水沖洗30 min，然后剪取帶腋芽莖段或莖尖1 cm左右，70%乙醇浸泡40 s，0.1%升汞消毒浸泡5～6 min，取出材料用無(wú)菌蒸餾水沖洗5～6次，每次1 min，沖洗完畢用無(wú)菌濾紙吸干水分待用。

1.2.3建立無(wú)菌區(qū)。

將消毒后的材料用剪刀剪一個(gè)斜面，將莖段或莖尖（新剪的切口斜面）放置到事先配制好的普通MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，溫度（24±2）℃，光照2 500 lx，光照時(shí)間16 h/d。3 d后觀察，如果發(fā)現(xiàn)瓶?jī)?nèi)有霉菌或細(xì)菌污染的材料應(yīng)及時(shí)清理，注意要整瓶移走清理，避免污染其他瓶苗。

1.2.4莖尖脫毒。

待瓶苗新的幼芽長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，可進(jìn)行脫毒工作。在無(wú)菌條件下使用解剖鏡觀察，采用鑷子剝?nèi)ザ嘤嗟娜~片，露出生長(zhǎng)點(diǎn)，用解剖刀切取0.2～0.5 mm的莖尖，放到不同濃度6-BA（1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、020 mg/L）組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。20 ℃暗培養(yǎng)22～26 h后，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)溫度為70 ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照時(shí)間16 h/d的條件下培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計(jì)成活率和脫毒率。

1.2.5優(yōu)化培養(yǎng)基。

以MS為基本培養(yǎng)基，將MS培養(yǎng)基中的蔗糖用普通的白砂糖代替，瓊脂粉用普通的瓊脂條代替，其余成分不變，配制成優(yōu)化后的MS基本培養(yǎng)基。分別用普通培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)幼芽，20 d后觀察其生長(zhǎng)情況。

1.2.6繼代培養(yǎng)。

將長(zhǎng)出的嫩芽接種到增殖培養(yǎng)基上，以MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA（0.5、1.0 mg/L）和NAA（0.01、0.05 mg/L）的激素組合。在培養(yǎng)溫度為28 ℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間16 h/d條件下培養(yǎng)，每5 d觀察1次，25 d后各處理隨機(jī)統(tǒng)計(jì)5瓶，觀察幼苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.7生根培養(yǎng)。

將伸長(zhǎng)的側(cè)芽剪成5～8 cm的莖段，接種到添加6-BA（0、0.5 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.50 mg/L）的1/2 MS培養(yǎng)基上，20 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，各處理隨機(jī)統(tǒng)計(jì)5瓶。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素組合對(duì)椒樣薄荷脫毒成活的影響

切取椒樣薄荷莖尖0.2～0.5 mm后，放到不同激素配比的培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)，由表1可知，不同激素配比均可誘導(dǎo)莖尖分化出椒樣薄荷幼苗，激素水平不同對(duì)其誘導(dǎo)小苗的成活個(gè)數(shù)有較大的影響，2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA激素處理最有利于莖尖幼苗的成活。不同激素配比對(duì)誘導(dǎo)出的幼苗脫毒率沒(méi)有明顯影響。

2.2椒樣薄荷基本培養(yǎng)基的優(yōu)化

由于該研究為大規(guī)模工廠化育苗做準(zhǔn)備，一切以成本最小化為標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)將基本培養(yǎng)基中的蔗糖換為白砂糖，瓊脂粉換為瓊脂條，其他成分不變。對(duì)椒樣薄荷進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)椒樣薄荷組培苗的影響不大。故椒樣薄荷的增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)采用改良之后的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。

2.3不同激素組合對(duì)椒樣薄荷繼代繁殖的影響

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，將幼苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后椒樣薄荷莖節(jié)明顯伸長(zhǎng)并發(fā)出少量葉芽，15 d后側(cè)芽不斷伸長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)良好，20 d后部分外植體莖段基部膨大處有少量根系長(zhǎng)出。25 d后側(cè)芽長(zhǎng)度一般為5～9 cm，平均有2～4個(gè)莖節(jié)。由表2可以看出，25 d后不同處理側(cè)芽生長(zhǎng)情況均比較良好，MS基本培養(yǎng)基中側(cè)芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)要優(yōu)于1/2 MS基本培養(yǎng)基中，但二者不存在顯著性差異，所有莖段基部膨大，未出現(xiàn)愈傷組織，部分處理有少量根系生成。外援添加激素可改變外植體的新增莖節(jié)數(shù)，以激素處理0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA為最好。

2.4不同激素組合對(duì)椒樣薄荷生根的影響

增殖培養(yǎng)下，1/2 MS培養(yǎng)基對(duì)椒樣薄荷的增殖率沒(méi)有顯著影響，暗示無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)椒樣薄荷的生長(zhǎng)差異不大，再加上大量培養(yǎng)時(shí)從節(jié)約成本考慮，生根培養(yǎng)將以1/2 MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)。接種10 d后，6個(gè)處理莖段基部均長(zhǎng)出白色根系，繼續(xù)生長(zhǎng)，到接種20 d時(shí)，每株6～9條根，差異不是很明顯，具體根系生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。經(jīng)比較，生根階段采用1/2 MS+0.10 mg/L NAA有利于根系生長(zhǎng)。

3結(jié)論與討論

該研究采用莖尖處理對(duì)椒樣薄荷進(jìn)行脫毒，切取0.2～0.5 mm莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，成活率、脫毒率最高，均為77.7%。謝文申等[1]使用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法對(duì)野薄荷進(jìn)行脫毒，切取0.3～0.5 mm莖尖培養(yǎng)，其成活率為50%，而脫毒率可達(dá)80%，可能是由于莖尖培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基不同引起的。同張倩等[5]的研究一樣，該研究發(fā)現(xiàn)在繼代和增殖培養(yǎng)過(guò)程中，使用1/2 MS基本培養(yǎng)基就可以滿足椒樣薄荷所需的營(yíng)養(yǎng)，有效節(jié)約了生產(chǎn)成本。

由于過(guò)高濃度的激素處理會(huì)使組培苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，該研究采用較低濃度的激素進(jìn)行增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)低劑量的激素處理椒樣薄荷，未出現(xiàn)椒樣薄荷玻璃化現(xiàn)象，且新增的莖節(jié)數(shù)也較多，激素水平為0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA時(shí)增殖達(dá)到最優(yōu)，激素水平為0.10 mg/L NAA時(shí)生根水平達(dá)到最優(yōu)。該研究對(duì)椒樣薄荷進(jìn)行大規(guī)模的組織培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果與王小敏等[6]的研究結(jié)果有少許出入，可能是由于椒樣薄荷對(duì)激素的要求較低，只需要少量的植物激素就可滿足分化增殖條件，也可能是使用的基本培養(yǎng)基不同造成的。

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