3-溴丙酮酸聯(lián)合索拉菲尼對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王 云，倪 敏，汪 念，丁體龍，張 配，劉 浩，魏 偉，鄭海倫，馬 勇,*

(1安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032；2解放軍第123醫(yī)院藥械科；3解放軍第123醫(yī)院肝病中心；4蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心；5蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科；△共同第一作者；*通訊作者，E-mail:my4973966@163.com；#共同通訊作者，E-mail:alanhailun@163.com)

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3-溴丙酮酸聯(lián)合索拉菲尼對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王 云1,2，倪 敏2△，汪 念2，丁體龍3，張 配4，劉 浩4，魏 偉1，鄭海倫5#，馬 勇1,3*

(1安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032；2解放軍第123醫(yī)院藥械科；3解放軍第123醫(yī)院肝病中心；4蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心；5蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科；△共同第一作者；*通訊作者，E-mail:my4973966@163.com；#共同通訊作者，E-mail:alanhailun@163.com)

目的 探討3-溴丙酮酸(3-BrPA)聯(lián)合索拉菲尼(SOR)對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2增殖和凋亡的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。 方法 首先采用MTT法檢測(cè)不同濃度3-BrPA(20，40，80，160，320 μmol/L)、索拉菲尼(2，4，8，16，32 μmol/L)以及100 μmol/L 3-BrPA與索拉菲尼(2，4，8，16，32 μmol/L)聯(lián)合對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2作用24 h的增殖抑制作用。之后將肝癌細(xì)胞分為對(duì)照組、3-BrPA組、SOR組、3-BrPA+SOR組，PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2凋亡；DAPI染色檢測(cè)SMMC7721、HepG2細(xì)胞核的變化；Western blot檢測(cè)SMMC7721、HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。 結(jié)果 3-BrPA、索拉菲尼以及兩藥聯(lián)合作用于SMMC7721、HepG2細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率隨濃度增高而降低(P<0.05)。100 μmol/L 3-BrPA與索拉菲尼聯(lián)合作用于SMMC7721、HepG2細(xì)胞24 h的存活率顯著高于同濃度的索拉菲尼單獨(dú)處理(P<0.05)。100 μmol/L 3-BrPA與16 μmol/L索拉菲尼聯(lián)合誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的凋亡率為(47.4±5.02)%、(46.2±4.14)%，顯著高于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(P<0.05)。DAPI染色結(jié)果顯示3-BrPA+SOR組細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核皺縮濃集，呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，或細(xì)胞核呈分葉、碎片狀，且明顯多于單獨(dú)用藥組；Western blot結(jié)果顯示3-BrPA+SOR組明顯下調(diào)SMMC7721細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)無明顯影響。 結(jié)論 3-BrPA能增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的增殖抑制作用，且能增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

肝癌； 3-溴丙酮酸； 細(xì)胞凋亡； 索拉菲尼； Bcl-2； Bax

肝癌是十分常見的惡性腫瘤，惡性程度高，易侵襲轉(zhuǎn)移。手術(shù)治療是肝癌的主要手段，但因發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于中晚期，多出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，非手術(shù)治療在肝癌的治療中占有重要地位。索拉非尼(SOR)是多激酶抑制劑，是被證實(shí)能顯著延長(zhǎng)晚期肝癌患者總生存期的藥物，也是被FDA批準(zhǔn)用于晚期肝癌系統(tǒng)化療的藥物[1]。索拉菲尼存在患者耐藥現(xiàn)象，成為其在臨床應(yīng)用中的一大障礙[2-5]。因此，研究其耐藥機(jī)制，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性十分重要[6]。糖酵解抑制劑3-溴丙酮酸(3-BrPA)能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)重要臟器功能無明顯影響，且能殺死對(duì)常見化療藥物不敏感的腫瘤細(xì)胞，有望成為理想的抗腫瘤新藥[7-9]。本研究探討3-BrPA聯(lián)合索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制，以期為肝癌的治療提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基與糜蛋白酶購自美國(guó)Gibco公司；索拉菲尼購自美國(guó)Selleck公司；MTT購自碧云天公司；3-BrPA、PI購自美國(guó)Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國(guó)Amresco公司；山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG與β-actin購自合肥BioSharp公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國(guó)Millipore公司；Bcl-2與Bax購自英國(guó)Abcam公司。

CO2培養(yǎng)箱(Themo公司，美國(guó))；IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；BioTek酶標(biāo)儀(SynergyHT公司，美國(guó))；AccuriC6流式細(xì)胞儀(Becton Dicknson公司，美國(guó))；ChemDocXRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞株SMMC7721、HepG2由中山大學(xué)惠贈(zèng)，蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理實(shí)驗(yàn)室保存。SMMC7721、HepG2細(xì)胞使用含有10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，貼壁后更換培養(yǎng)液。2-3 d待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底即可傳代。傳代時(shí)先用PBS漂洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞變圓后終止消化，收集細(xì)胞懸液于離心管中。900 r/min離心4 min，棄上清后用培養(yǎng)液重懸傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)肝癌細(xì)胞存活率

將肝癌細(xì)胞接種于96孔板，7×103個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的3-BrPA(20，40，80，16，320 μmol/L)，索拉菲尼(2，4，8，16，32 μmol/L)以及用100 μmol/L 3-BrPA預(yù)處理2 h聯(lián)合索拉菲尼(2，4，8，16，32 μmol/L)，設(shè)陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入15 μl的MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h。結(jié)束后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，37 ℃放置20 min。振蕩5 min用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=(藥物組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡

將肝癌細(xì)胞接種于12孔板，2×105個(gè)/孔，培養(yǎng)18-24 h待細(xì)胞覆蓋板底70%棄去培養(yǎng)液，加入濃度為100 μmol/L 3-BrPA、16 μmol/L索拉菲尼以及用100 μmol/L 3-BrPA預(yù)處理2 h加入16 μmol/L索拉菲尼聯(lián)合處理細(xì)胞，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。結(jié)束后收集各組細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入75%預(yù)冷乙醇固定，4 ℃存放過夜。檢測(cè)前1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入600 μl PI緩沖液重懸混勻，4 ℃避光放置2 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核變化

將肝癌細(xì)胞接種于12孔板，2×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h加入濃度為100 μmol/L 3-BrPA、16 μmol/L索拉菲尼以及用100 μmol/L 3-BrPA預(yù)處理2 h加入16 μmol/L索拉菲尼聯(lián)合處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h吸除培養(yǎng)液，用PBS溶液洗滌細(xì)胞1次，每孔加入1.0 ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞5 min，PBS洗滌3次，每孔加入600 μl DAPI染色液避光反應(yīng)15 min，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。

1.6 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

將肝癌細(xì)胞接種于6孔板，5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h加入濃度為100 μmol/L的3-BrPA、16 μmol/L的索拉菲尼以及用100 μmol/L3-BrPA預(yù)處理2 h加入16 μmol/L索拉菲尼聯(lián)合處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收集各組細(xì)胞，2 500 r/min離心10 min，棄上清，加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。用細(xì)胞裂解液稀釋各組蛋白至等濃度，每組取50 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉4 h，用TPBS洗滌后加入一抗室溫孵育2 h，TPBS洗膜后二抗孵育2 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影后獲取條帶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3-BrPA增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的增殖抑制作用

不同濃度的3-BrPA(20，40，80，16，320 μmol/L)、索拉菲尼(2，4，8，16，32 μmol/L)以及兩藥聯(lián)合使用作用于SMMC7721、HepG2細(xì)胞24 h細(xì)胞存活率隨濃度增高而降低(P<0.05，見圖1)。100 μmol/L 3-BrPA與索拉菲尼(2，4，8，16，32 μmol/L)聯(lián)合作用于SMMC7721、HepG2細(xì)胞24 h的存活率明顯低于索拉菲尼組(P<0.05，見圖1C)。

與對(duì)照組(0μmol/L)比較,*P<0.05;與圖1B中同濃度SOR比較,#P<0.05圖1 3-BrPA、索拉菲尼及兩藥聯(lián)合對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞存活率的變化Figure1 ChangesoftheviabilityofHepG2andSMMC7721cellsaftertreatedwith3-BrPA,sorafenib,ortheircombinedtreatment

2.2 3-BrPA增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的凋亡

100 μmol/L 3-BrPA、16 μmol/L索拉菲尼以及兩藥聯(lián)合能明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的凋亡(見圖2)，100 μmol/L 3-BrPA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的凋亡率分別為(13.1±3.03)%、(15.3±2.66)%， 16 μmol/L索拉菲尼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的凋亡率分別為(10.1±3.04)%、(11.8±3.89)%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩藥聯(lián)合聯(lián)合誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的凋亡率分別為(47.4±5.02)%、(46.2±4.14)%，顯著高于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(P<0.05，見圖3)。

圖2 3-BrPA,索拉菲尼及兩者聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡影響的PI單染結(jié)果Figure 2 PI staining results of effect of 3-BrPA,sorafenib and their combination on apoptosis of SMMC 7721 and HepG2

與對(duì)照組比較,*P<0.05；與3-BrPA組比較，#P< 0.05；與SOR組比較，△P<0.05圖3 3-BrPA與索拉菲尼以及兩者聯(lián)用時(shí)SMMC7721和HepG2細(xì)胞的凋亡率變化Figure 3 Changes of the cell apoptosis rate of HepG2 and SMMC7721 cells after treated with 3-BrPA,sorafenib or their combination

將100 μmol/L 3-BrPA，16 μmol/L索拉菲尼，以及100 μmol/L 3-BrPA聯(lián)合16 μmol/L索拉菲尼處理SMMC7721、HepG2細(xì)胞24 h，DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化。結(jié)果顯示：聯(lián)合組細(xì)胞核皺縮濃集，呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞核呈分葉、碎片狀，且明顯多于單獨(dú)用藥組(見圖4)。2.3 3-BrPA對(duì)索拉菲尼誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG2相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

人肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2給予不同的刺激后收集蛋白，Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組Bcl-2的表達(dá)降低(見圖5A)，聯(lián)合用藥組SMMC7721細(xì)胞Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量為0.43±0.05，低于對(duì)照組和單獨(dú)用藥組(P<0.05)，而聯(lián)合用藥組對(duì)HepG2細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)影響不明顯(見圖5B)。同時(shí)，3-BrPA與索拉菲尼對(duì)Bax的表達(dá)無明顯影響(見圖5C)。

3 討論

索拉菲尼是治療晚期肝癌的一線藥物，能顯著改善晚期肝癌患者的生存期[1]。索拉菲尼主要從兩個(gè)途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，一是索拉菲尼可以通過抑制血管生成相關(guān)的受體，如血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)等，抑制腫瘤血管的生成，發(fā)揮間接抗腫瘤作用。二是索拉菲尼可以通過抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)揮直接抗腫瘤作用[10]。然而，單獨(dú)使用索拉菲尼患者易發(fā)生耐藥現(xiàn)象[11]，肝癌細(xì)胞的糖酵解水平是其對(duì)索拉菲尼耐藥的潛在標(biāo)志[12]，如果抑制糖酵解，可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)其凋亡[13]。3-BrPA與丙酮酸化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，抑制己糖激酶活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解，降低ATP的生成從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，3-BrPA對(duì)肝癌、乳腺癌、胰腺癌等具有良好的抗腫瘤作用，且能殺傷對(duì)常見化療藥物不敏感的腫瘤細(xì)胞，以及增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[14]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)MTT結(jié)果，繪制3-BrPA的劑量-效應(yīng)曲線，選擇低于半數(shù)抑制濃度(IC50)的100 μmol/L 3-BrPA聯(lián)合索拉菲尼作用于肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2后，明顯增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，并隨著藥物劑量的增大，索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)。

圖4 DAPI染色檢測(cè)3-BrPA與索拉菲尼以及兩者聯(lián)合使用對(duì)SMMC7721和HepG2細(xì)胞核的影響Figure 4 Changes of HepG2 and SMMC7721 cell nuclei after treated with 3-BrPA,sorafenib and their combination by DAPI staining

與對(duì)照組比較,*P<0.05;與3-BrPA組比較,#P<0.05;與SOR組比較,△P<0.05圖5 3-BrPA、索拉菲尼以及兩者聯(lián)合使用對(duì)SMMC7721和HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響Figure5 Effectsof3-BrPA,sorafenibandtheircombinationonproteinexpressionofBcl-2andBaxinHepG2andSMMC7721cells

細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)死亡過程，其中涉及基因的激活、表達(dá)、調(diào)控等一系列的細(xì)胞生命活動(dòng)。細(xì)胞凋亡可以被多種內(nèi)在或外在的刺激誘發(fā)，是細(xì)胞對(duì)刺激的應(yīng)答反應(yīng)。大部分的抗腫瘤藥物也是通過誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)為胞質(zhì)濃縮、核染色質(zhì)凝縮、細(xì)胞膜內(nèi)陷和凋亡小體形成。為了進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題根據(jù)MTT的結(jié)果，選擇了100 μmol/L 3-BrPA和16 μmol/L索拉菲尼聯(lián)用，通過流式單染和DAPI染色檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡明顯增加，凋亡率明顯高于單用3-BrPA或索拉菲尼組，且聯(lián)合用藥組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核分葉、碎片明顯增多，核縮濃呈亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞凋亡明顯。

Bcl-2家族蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡，其成員具有雙重功能，其中Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL等蛋白抗凋亡，而Bax、Bak、Bad等蛋白具有促凋亡作用。Bcl-2蛋白定位表達(dá)于線粒體膜上，是目前發(fā)現(xiàn)的抗凋亡作用很強(qiáng)的蛋白之一。它在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中處于終末部分，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和抗腫瘤治療具有重要意義[15]。Bcl-2抗凋亡的機(jī)制是Bcl-2能夠增強(qiáng)線粒體膜電位，抑制線粒體鈣離子的釋放，使核酸內(nèi)切酶無法活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。Bax在細(xì)胞中廣泛存在，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激引發(fā)凋亡時(shí)，Bax與線粒體膜結(jié)合，兩個(gè)Bax蛋白相互聚合形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。如果Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞中Bcl-2蛋白增多，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，比同源二聚體更穩(wěn)定，抑制Bax的凋亡作用[16]。因此，Bcl-2/Bax比值最終決定了細(xì)胞的存亡。為了研究3-BrPA增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，通過Western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)3-BrPA與索拉菲尼聯(lián)合時(shí)，Bax蛋白表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但趨勢(shì)不明顯。在SMMC7721細(xì)胞中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)被明顯下調(diào)，但在HepG2細(xì)胞中Bcl-2的下調(diào)不明顯。

本研究證明了3-BrPA具有增強(qiáng)索拉菲尼對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721、HepG2的增殖抑制作用，且能增強(qiáng)索拉菲尼誘導(dǎo)的凋亡，其機(jī)制可能是通過下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來發(fā)揮作用。具體的分子機(jī)制以及在動(dòng)物模型中聯(lián)合應(yīng)用的效果還有待進(jìn)一步的研究。該研究結(jié)果將為臨床應(yīng)用索拉菲尼治療晚期肝癌提供新的思路和策略。

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Effects of 3-bromopyruvate combined with sorafenib on proliferation and apoptosis of human hepatic carcinoma cellsinvitro

WANG Yun1,2,NI Min2△,WANG Nian2,DING Tilong3,ZHANG Pei4,LIU Hao4,WEI Wei1,ZHENG Hailun5#,MA Yong1,3*

(1InstituteofClinicalPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofAntiinflammatoryandImmunopharmacologyofEducationMinistry,Hefei230032,China;2DepartmentofPharmacy,123thHospitalofPLA;3DepartmentofLiverDiseases,123thHospitalofPLA;4FacultyofPharmacy,BengbuMedicalCollege，AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals;5DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege;△Co-firstauthor;*Correspondingauthor,E-mail:my4973966@163.com;#Co-correspondingauthor,E-mail:alanhailun@163.com)

ObjectiveTo investigate the effects of 3-bromopyruvate(3-BrPA)combined with sorafenib(SOR)on the proliferation and apoptosis of human hepatic carcinoma cellsinvitroand its related molecular mechanism.MethodsMTT assay was used to detect the viability of hepatic carcinoma HepG2 and SMMC7721 cells after exposed to different concentrations of 3-BrPA(20,40,80,160,320 μmol/L),SOR(2,4,8,16,32 μmol/L),and 100 μmol/L 3-BrPA combined with SOR(2,4,8,16,32 μmol/L).Then the experiment was divided into four groups:control group,3-BrPA group,SOR group,and 3-BrPA+SOR group.The apoptosis rate of cells was assessed using flow cytometry with PI staining，DAPI staining was performed to demonstrate the cell nucleus changes,and the expression of Bcl-2 and Bax was analyzed using Western blot.ResultsThe cell viability of HepG2 and SMMC7721 cells decreased in a concentration-dependent manner after treated with 3-BrPA,SOR,and 100 μmol/L 3-BrPA combined with SOR,respectively(P<0.05).The survival rates of HepG2 and SMMC7721 cells after treated with 100 μmol/L 3-BrPA combined with SOR for 24 h were lower than that of the single dose of SOR(P<0.05).The apoptotic rate was (47.4±5.02)% in SMMC7721 cells and (46.2±4.14)% in HepG2 cells after combined treatment for 24 h,which were also significantly higher than that of cells treated with 3-BrPA or SOR(P<0.05).DAPI staining showed that HepG2 and SMMC7721 cell nucleus became significantly condensed and fragmented in 3-BrPA+SOR group.Bcl-2 protein in SMMC7721 cells was down-regulated clearly in 3-BrPA+SOR group(P<0.05).Conclusion3-BrPA can inhibit the proliferation of HepG2 and SMMC7721 cells and enhance sorafenib-induced cell death,which may be caused by down-regulating Bcl-2.

hepatic carcinoma; 3-bromopyruvate; apoptosis; sorafenib; Bcl-2; Bax

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2015A177)

王云，男，1984-09生，碩士，E-mail:214903722@qq.com 倪敏，女，1984-03生，學(xué)士，E-mail:pfczhou@163.com

2016-11-17

R735.7

A

1007-6611(2017)04-0310-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.003