高脂飲食對(duì)ApoE-/-小鼠血漿及主動(dòng)脈視黃醇結(jié)合蛋白4表達(dá)的影響及意義

郝廣華，汪南平，黃雅姿，趙蓓蕾，張 弘，韓振華

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710004；2北京大學(xué)心血管研究所，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；*通訊作者，E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

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高脂飲食對(duì)ApoE-/-小鼠血漿及主動(dòng)脈視黃醇結(jié)合蛋白4表達(dá)的影響及意義

郝廣華1，汪南平2*，黃雅姿2，趙蓓蕾2，張 弘2，韓振華1

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710004；2北京大學(xué)心血管研究所，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；*通訊作者，E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

目的 觀察高脂飲食對(duì)apoE-/-小鼠血漿及主動(dòng)脈RBP4水平的影響，探討其意義。 方法 8周齡C57 BL/6及apoE-/-小鼠分為4組：C57 BL/6小鼠普食組，C57 BL/6小鼠高脂組，apoE-/-小鼠普食組，apoE-/-小鼠高脂組。喂養(yǎng)不同周數(shù)(0,1,2,3,4周)后取血漿用于脂質(zhì)和血糖的測(cè)定，應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)血漿及附睪脂肪組織RBP4的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)主動(dòng)脈RBP4的表達(dá)。 結(jié)果 與C57BL/6小鼠普食組及apoE-/-小鼠普食組相比，喂養(yǎng)4周apoE-/-高脂組小鼠血漿膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及血糖(GLU)升高(P<0.05)，其血漿及脂肪組織RBP4的表達(dá)水平也升高(P<0.05)。apoE-/-高脂組小鼠的主動(dòng)脈RBP4的免疫陽(yáng)性表達(dá)較C57BL/6高脂組小鼠及apoE-/-普食組小鼠增加，且主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見(jiàn)到明顯的RBP4表達(dá)。 結(jié)論 高脂飲食誘導(dǎo)apoE-/-小鼠血漿、脂肪組織及主動(dòng)脈RBP4表達(dá)升高，RBP4可能參與了代謝綜合征，特別是血管病變的病理過(guò)程。

視黃醇結(jié)合蛋白； 高脂飲食； 胰島素抵抗； 代謝綜合征； 動(dòng)脈粥樣硬化

肥胖是一個(gè)威脅公眾健康的重大問(wèn)題，也是胰島素抵抗和心血管疾病流行的重要危險(xiǎn)因素。脂肪組織產(chǎn)生大量的脂肪因子，如抵抗素(resistin)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、脂聯(lián)素(adiponectin)等，參與并影響心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1,2]。

視黃醇結(jié)合蛋白-4(retinol-binding protein 4，RBP4)是維生素A的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是一種新的脂肪因子，與肥胖和胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)，被認(rèn)為是預(yù)測(cè)代謝綜合征的一個(gè)新指標(biāo)[3,4]。循環(huán)中RBP4與多種心血管疾病危險(xiǎn)因素如體質(zhì)量、腰圍、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)及收縮壓呈正相關(guān)，而與血漿高密度脂蛋白(HDL)呈負(fù)相關(guān)[5,6]。而且，循環(huán)中RBP4在臨床確診的動(dòng)脈粥樣硬化患者中增高，其水平與頸動(dòng)脈斑塊大小具有相關(guān)性[7]。提示RBP4可能與代謝綜合征及動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)。但迄今為止，RBP4在動(dòng)脈粥樣硬化中的直接作用仍未揭示。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)高脂飲食對(duì)apoE-/-小鼠血漿及及主動(dòng)脈RBP4表達(dá)的影響，探討RBP4與代謝綜合征，特別是血管病變的關(guān)系。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

8周齡雄性apoE-/-小鼠58只，SPF級(jí)，體質(zhì)量17-25 g；8周齡野生型雄性C57BL/6小鼠56只，體質(zhì)量17-25 g，均由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。兔RBP4抗體由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院營(yíng)養(yǎng)科學(xué)研究所劉勇教授惠贈(zèng)。兔抗β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。ECL發(fā)光試劑及RIPA裂解液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。蛋白酶抑制劑complete購(gòu)自Roche applied science公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及胰島素抵抗模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組：C57BL/6普食小鼠組(C57 C)：野生型C57BL/6小鼠(n=32)，喂食普通飼料；C57BL/6高脂小鼠組(C57 HF)：C57BL/6小鼠(n=24)喂食高脂飼料(1.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、15%脂肪、其余為普通飼料)；apoE-/-普食小鼠組(apoE-/-C，n=26)，喂食普通飼料；apoE-/-高脂小鼠組(apoE-/-HF，n=32)，喂食高脂飼料(1.5%膽固醇、0.5%膽酸鹽、15%脂肪、其余為普通飼料)。

1.3 血液標(biāo)本的采集及血糖和血脂的檢測(cè)

分別于普通飼料或高脂飼料喂養(yǎng)0，1，2，3，4周時(shí)，禁食12 h，以0.6%戊巴比妥鈉0.2-0.4 ml通過(guò)腹腔注射麻醉。經(jīng)眼眶后靜脈叢取血0.5 ml(處死動(dòng)物前)，立即離心(3 000 r/min，10 min)，取血清用于脂質(zhì)(TC、TG)和血糖的測(cè)定，其余血清-70 ℃保存?zhèn)溆?。血清TC、TG使用酶比色法，血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.4 脂肪組織采集

于實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取血后打開(kāi)腹腔，經(jīng)左心室灌注0.1 mol/L PBS后分離并取出主動(dòng)脈及附睪脂肪組織，清洗后立即置于液氮中保存，用于后續(xù)分析。

1.5 Western blot檢測(cè)血漿及脂肪組織RBP4水平

血漿樣品用0.1 mol/L PBS稀釋20倍，按照4 ∶1(V/V)的比例加入上樣緩沖液，煮沸10 min，離心。用裂解液(RIPA)裂解脂肪組織后提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白含量。稀釋蛋白樣品為10 μg/μl，加入上樣緩沖液，煮沸10 min，離心。血漿蛋白樣品及脂肪組織樣品分別進(jìn)行8% SDS-PAGE凝膠電泳并電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉緩沖液封閉1 h，滴加兔抗RBP4抗體(1 ∶500)、β-actin抗體(1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜，生物素化山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1-3 min；常規(guī)方法顯影定影，拍照后采用Gel Doc 2000系統(tǒng)行拍照及灰度分析。

1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)主動(dòng)脈RBP4表達(dá)

取胸主動(dòng)脈依次經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液及蔗糖溶液處理，OCT包埋后制成冰凍組織。經(jīng)冰凍切片機(jī)制成7 μm切片，0.01 mmol/L的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)抗原熱修復(fù)，正常山羊血清抗體封閉后，加入兔抗RBP4抗體(1 ∶500)，4 ℃過(guò)夜后，DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)中用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠血脂及血糖

apoE-/-小鼠普食(apoE-/-HF-0W)時(shí)TC較同齡C57BL/6普食小鼠(C57 HF-0W)高。C57BL/6小鼠高脂4周(C57 HF-4W)TC較同類(lèi)普食組小鼠(C57 C-4W)顯著增高。喂養(yǎng)4周時(shí)apoE-/-高脂小鼠(apoE-/-HF-4W)與C57BL/6高脂小鼠(C57 HF-4W)及同周齡的apoE-/-普食小鼠(apoE-/-HF-4W)相比，其TC，TG及血糖均顯著升高。TG及血糖在除apoE-/-高脂4周組小鼠外的組別中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清脂質(zhì)及血糖比較 (mmol/L)

Table 1 Plasma lipid and glucose profiles in apoE-/-and C57BL/6 mice (mmol/L)

組別nTCTGGLUC57HF-0W71.46±0.111.10±0.2612.98±0.58apoE-/-HF-0W76.25±0.38*1.42±0.2511.82±1.07C57C-4W81.50±0.090.99±0.2111.05±0.95apoE-/-C-4W77.53±0.44#1.62±0.3813.19±1.05C57HF-4W83.76±0.20#0.92±0.2012.06±0.74apoE-/-HF-4W837.52±0.57+△4.22±0.43+△23.62±1.97+△

與C57 HF-0W比較,*P<0.05;與C57 C-4W比較,#P<0.05;與C57 HF-4W比較,+P<0.05;與apoE-/-C-4W比較,△P<0.05

2.2 小鼠血漿RBP4水平

實(shí)驗(yàn)中采用的兔抗RBP4抗體對(duì)小鼠血清RBP4具有較高的特異性，在實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)到1個(gè)21 kD的條帶(見(jiàn)圖1)。隨著高脂飼料喂養(yǎng)周數(shù)的增加，C57BL/6小鼠血清RBP4表達(dá)水平升高(見(jiàn)圖1)。高脂飼料喂養(yǎng)不同周數(shù)的apoE-/-小鼠血漿RBP4水平顯著高于同周齡C57BL/6高脂小鼠。高脂飲食以時(shí)間依賴性方式增加apoE-/-小鼠血漿RBP4水平。血漿蛋白的考馬斯亮藍(lán)染色在此實(shí)驗(yàn)中作為上樣內(nèi)參。

與C57 HF-0W比較,*P<0.05;同時(shí)間與C57 HF 比較,#P<0.05圖1 各組小鼠血漿RBP4水平Figure 1 Comparison of plasma RBP4 between C57BL/6 and apoE-/- mice after different treatment

2.3 脂肪RBP4表達(dá)水平

C57BL/6高脂組小鼠附睪脂肪組織RBP4表達(dá)水平較同周齡普食組飼料小鼠明顯增高(見(jiàn)圖2)。高脂飼料開(kāi)始喂養(yǎng)前(apoE-/-HF-0W)的apoE-/-小鼠附睪脂肪組織RBP4表達(dá)水平顯著高于同周齡C57BL/6普食小鼠組。高脂飲食4周則進(jìn)一步增加了apoE-/-小鼠脂肪RBP4表達(dá)水平。

與C57 C-4W比較,*P<0.05;與C57 C-0W比較,#P<0.05;與apoE-/-HF-0W比較,△P<0.05圖2 各組小鼠脂肪組織RBP4水平Figure 2 Comparison of RBP4 expression in epididymal adipose tissues among C57BL/6 and apoE-/- mice

2.4 主動(dòng)脈RBP4的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，普食8周的C57BL/6小鼠主動(dòng)脈壁的內(nèi)皮細(xì)胞、SMCs及血管外膜均有較弱的RBP4陽(yáng)性表達(dá)，高脂8周的C57BL/6小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、SMCs及血管外膜RBP4表達(dá)增加(見(jiàn)圖3)。apoE-/-小鼠高脂8周時(shí)除了與C57BL/6高脂8周小鼠具有相似的RBP4陽(yáng)性表達(dá)外，在其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊部位可觀察到明顯的RBP4免疫陽(yáng)性，且主要分布于脂質(zhì)富集部位。陰性對(duì)照組免疫組織化學(xué)染色未見(jiàn)明顯陽(yáng)性染色。

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈RBP4表達(dá)Figure 3 Expression of RBP4 in aorta of mice after different treatment

3 討論

流行病學(xué)研究顯示，肥胖與心血管疾病特別是高血壓病、冠心病等密切相關(guān)。脂肪組織是一個(gè)內(nèi)分泌器官，能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，被稱(chēng)為脂肪因子(adipokines)。脂肪因子通過(guò)調(diào)控糖脂代謝及胰島素敏感性，參與胰島素抵抗及代謝綜合征的病理生理過(guò)程[1]。RBP4是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，屬于lipocalin家族成員，主要由肝臟和脂肪組織合成后分泌入血液，與transthyretin(血液中3種甲狀腺激素結(jié)合蛋白之一)1 ∶1結(jié)合，形成蛋白復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖、2型糖尿病、糖耐量受損、有2型糖尿病家族史的健康者或其他胰島素抵抗相關(guān)疾病者中RBP4血清水平升高，且與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)。運(yùn)動(dòng)或抗糖尿病藥物干預(yù)可降低血清RBP4。并且，RBP4基因單核苷酸多態(tài)性與胰島素抵抗的遺傳密切相關(guān)。因此有人提議將RBP4作為診斷代謝綜合征的一個(gè)生物標(biāo)記[4,8]。

apoE-/-小鼠是研究胰島素抵抗較理想的動(dòng)物模型，高脂血癥是其重要的表型特征。本實(shí)驗(yàn)顯示有胰島素抵抗表型的8周齡apoE-/-小鼠比同周齡C57BL/6小鼠的基礎(chǔ)血漿RBP4水平升高，而高脂飲食可以時(shí)間依賴性方式增加apoE-/-小鼠的血漿RBP4水平。先前研究顯示，RBP4在多種肥胖和胰島素抵抗模型小鼠血清中水平升高，與糖代謝和胰島素抵抗密切相關(guān)。其機(jī)制可能是上調(diào)肝臟組織糖異生酶如磷酸烯醇丙酮酸激酶和磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶的表達(dá)，增加葡萄糖的基礎(chǔ)產(chǎn)生量，并通過(guò)改變PI3K活性損傷骨骼肌的胰島素信號(hào)[9]。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂飲食可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠血漿及附睪脂肪組織RBP4表達(dá)升高。既往研究表明沒(méi)有胰島素抵抗和2型糖尿病的肥胖者，循環(huán)RBP4水平升高。而且，輕度肥胖者中血漿RBP4水平與體質(zhì)量指數(shù)相關(guān)[10]。這些結(jié)果提示高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖也可使血漿RBP4水平升高，而且此誘導(dǎo)作用可能不依賴于是否存在胰島素抵抗。本實(shí)驗(yàn)中，apoE-/-小鼠的基礎(chǔ)血漿RBP4水平升高，推測(cè)可能與小鼠的胰島素抵抗表型有關(guān)，而高脂飲食誘導(dǎo)RBP4水平進(jìn)一步升高則可能與高脂誘發(fā)小鼠肥胖及體脂分布變化有關(guān)。

除此之外，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到高脂飲食可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠附睪RBP4水平升高，apoE-/-小鼠喂食高脂飲食后附睪RBP4表達(dá)進(jìn)一步升高。提示脂肪組織產(chǎn)生的RBP4是血漿中高水平的RBP4的重要來(lái)源。既往研究提示RBP4是脂肪組織特異性表達(dá)的因子，特別是與內(nèi)臟脂肪有關(guān)[11]。而且，在不同的脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子如adiponectin、leptin、visfatin中，RBP4被認(rèn)為是最有力的預(yù)測(cè)內(nèi)臟脂肪大小的脂肪因子[11.12]。

脂肪因子在心血管疾病發(fā)展中具有重要作用。血清RBP4水平與腹型肥胖、胰島素抵抗、高TG水平以及血壓呈顯著正相關(guān)，而與血清HDL以及脂聯(lián)素水平呈顯著負(fù)相關(guān)[1,8,13]。并且，RBP4水平與2型糖尿病以及VLDL升高的冠狀動(dòng)脈疾病患者或健康者VLDL以及LDL濃度顯著相關(guān)[3,14]。而且，循環(huán)中RBP4在臨床確診的動(dòng)脈粥樣硬化患者中增高，其水平與頸動(dòng)脈斑塊大小具有相關(guān)性[15]，提示RBP4可能與動(dòng)脈粥樣硬化疾病相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)直接觀察到RBP4表達(dá)于小鼠的主動(dòng)脈組織，高脂飲食可增加主動(dòng)脈組織RBP4表達(dá)，特別是在粥樣硬化斑塊部位可觀察到RBP4蛋白表達(dá)。我們以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RBP4通過(guò)PI3K-Akt通路誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移[16]。提示血管特別是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中高表達(dá)的RBP4可能通過(guò)影響SMCs的功能進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明，apoE-/-小鼠血漿、附睪組織及主動(dòng)脈RBP4的基礎(chǔ)水平升高，而且，高脂飲食進(jìn)一步誘導(dǎo)RBP4增高，提示RBP4可能作為一個(gè)重要的脂肪因子參與代謝綜合征，特別是肥胖及胰島素抵抗及血管病變的病理生理過(guò)程。本研究將為理解與肥胖相關(guān)疾病發(fā)生的可能機(jī)制提供新的證據(jù)。

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Effect of high fat diet on RBP4 expression in plasma and aorta of apoE-/-mice

HAO Guanghua1,WANG Nanping2*,HUANG Yazi2,ZHAO Beilei2,ZHANG Hong2,HAN Zhenhua1

(1DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2InstituteofCardiovascularScienceandKeyLaboratoryforMolecularCardiology,MinistryofEducation,PekingUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:npwang@bjmu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the effect of high fat diet on RBP4 expression in plasma and aorta of apoE-/-mice.MethodsThe 8-week-old C57BL/6 and apoE-/-mice were divided into four groups:C57BL/6 control group(fed with normal diet)and C57BL/6 high-fat diet group(C57 HF),apoE-/-control group and apoE-/-high-fat diet group(apoE-/-HF).Plasma lipids were detected after different feeding time by enzymic colorimetric method.Glucose was determined using glucose oxidase method.The protein levels of RBP4 in plasma and epididymal adipose tissue were analyzed by Western blot.RBP4 expression of aorta was determined using immunohistochemistry.ResultsIn comparison with C57 mice and apoE-/-control mice,plasma levels of total cholesterol(TC),triglyceride(TG)and glucose(GLU)significantly increased after high-fat diet for 4 weeks in apoE-/-HF mice(P<0.05),and the expression of RBP4 in plasma and adipose tissue was also increased in apoE-/-HF mice(P<0.05).In comparison with C57 HF mice and apoE-/-control mice,RBP4 immunopositive blots were obviously increased in the aorta of apoE-/-HF mice,with strong positive staining in atherosclerotic lesions.ConclusionHigh-fat diet increases RBP4 expression in plasma,adipose tissue and aorta of apoE-/-mice,suggesting that RBP4 may participate in pathology of metabolic syndrome,especially the vascular disease.

retinol binding protein 4； high fat diet； insulin resistance； metabolic syndrome； atherosclerosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30900693)；陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF021)

郝廣華，女，1978-05生，博士后，主治醫(yī)師，E-mail：guanghua-h@163.com

2016-12-29

R543

A

1007-6611(2017)04-0306-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.002