SMYD2在反復(fù)自然流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用及機(jī)制

楊 慧,張昌軍* ,刁紅錄

(1武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430071;2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心;*通訊作者,E-mail:542690700@qq.com)

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SMYD2在反復(fù)自然流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用及機(jī)制

楊 慧1,2,張昌軍1,2*,刁紅錄2

(1武漢大學(xué)中南醫(yī)院婦產(chǎn)科,武漢 430071;2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心;*通訊作者,E-mail:542690700@qq.com)

目的 探討SMYD2在反復(fù)自然流產(chǎn)(RSA)患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜化細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)P53、LIF的調(diào)節(jié)作用。 方法 將正常人和RSA患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)蛻膜化處理,并分為空白組、蛻膜化組、蛻膜化+抑制劑組,采用real-time PCR檢測(cè)LIF、SMYD2、TRP53 mRNA,細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)SMYD2、P53、P-P53蛋白在子宮內(nèi)膜蛻膜化細(xì)胞的表達(dá)及SMYD2特異性抑制劑AZ505對(duì)其表達(dá)的影響。 結(jié)果 在正常人和RSA患者蛻膜化組中,SMYD2、TRP53 mRNA表達(dá)均較空白組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在正常人和RSA患者蛻膜化+抑制劑組中,LIF mRNA的表達(dá)比蛻膜化組增加,TRP53 mRNA的表達(dá)比蛻膜化組降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而SMYD2 mRNA與蛻膜化組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果可見,正常人和RSA患者蛻膜化組細(xì)胞中SMYD2、 P53和P-P53蛋白信號(hào)均較空白組減弱,SMYD2抑制劑AZ505組正常人和RSA患者細(xì)胞中SMYD2、P53和P-P53蛋白信號(hào)均較蛻膜化組減弱。 結(jié)論 SMYD2通過對(duì)P53和LIF的調(diào)節(jié)作用而參與反復(fù)自然流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜蛻膜化過程。

SMYD2； P53； LIF； 反復(fù)自然流產(chǎn)； 子宮內(nèi)膜； 蛻膜化

反復(fù)自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上自然流產(chǎn)的現(xiàn)象[1],是一種常見的妊娠并發(fā)癥。反復(fù)自然流產(chǎn)的病因非常復(fù)雜,包括胚胎染色體異常、免疫功能異常、內(nèi)分泌異常,以及感染、子宮解剖異常和血栓前狀態(tài)等。然而,臨床上仍有超過55% RSA患者不能明確病因[2]。有研究表明,RSA患者子宮內(nèi)膜具有“超容受性”,其子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程紊亂,致使子宮內(nèi)膜種植窗期延長并且對(duì)胚胎的選擇能力受損[3],從而可能發(fā)生非優(yōu)質(zhì)胚胎植入影響妊娠結(jié)局。

組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(SET and MYND domain containing protein 2,SMYD2)是SMYD家族的一個(gè)成員,它既可以甲基化多種組蛋白也可以甲基化非組蛋白,從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能包括染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控。SMYD2在正常、病變以及腫瘤組織中都有表達(dá),與各個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前,國內(nèi)外尚未有關(guān)于SMYD2和反復(fù)自然流產(chǎn)關(guān)系的研究報(bào)道,本研究主要探討SMYD2在RSA患者子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用及其機(jī)制。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 兔抗SMYD2抗體、鼠抗P53抗體、兔抗P-P53抗體(Abcam公司),山羊抗兔熒光二抗488、抗鼠熒光二抗488、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司),FAST SYBR-Green(Applied biosystems公司),SMYD2特異性抑制劑AZ505(MedChem Express公司),DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基、胰蛋白酶 (HyClone公司),胎牛血清(FBS)、1×HBSS緩沖液(Gibco公司),膠原酶Ⅰ(Roche公司),青鏈霉素(P/G)(Thermo fisher公司),17β-雌二醇(E2)、孕酮(P4)、環(huán)磷腺苷(cAMP)(Sigma公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 所有人子宮內(nèi)膜標(biāo)本在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心通過宮腔鏡獲得,對(duì)照組選擇由于輸卵管因素導(dǎo)致不孕的正常人,實(shí)驗(yàn)組選擇反復(fù)自然流產(chǎn)3次的患者。所有研究對(duì)象月經(jīng)周期正常,無內(nèi)分泌、免疫和代謝疾病,沒有激素相關(guān)疾病并且收集標(biāo)本前3個(gè)月未接受過激素治療?；颊咧橥?研究符合倫理學(xué)并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 為探究SMYD2在子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中的作用,以及其是否依賴于與P53形成信號(hào)通路而發(fā)揮作用,采用real-time PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白在正常人和RSA患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜化細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律和變化。正常人和RSA患者細(xì)胞均設(shè)有空白組、蛻膜化組、蛻膜化+抑制劑組,通過檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子催乳素(prolactin,PRL)在正常人和RSA患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中mRNA的表達(dá)情況驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)蛻膜化處理是否成功。通過檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子PRL mRNA和子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子LIF mRNA的表達(dá)情況驗(yàn)證SMYD2特異性抑制劑AZ505對(duì)蛻膜化的影響。

分組及處理:① 空白組(control):6孔板中加入2 ml/孔2%FBS/DMEM培養(yǎng)基,24孔板中加入1 ml/孔2% FBS/DMEM培養(yǎng)基。②蛻膜化組(E+P+C):6孔板中加入2 ml/孔含10 nmol/L E2、1 μmol/L P4和0.5 mmol/L cAMP的2% FBS/DMEM,24孔板中加入1 ml/孔以上培養(yǎng)基。③蛻膜化+抑制劑組(EPC+AZ505):即為在蛻膜化的基礎(chǔ)上加入1 μmol/L SMYD2特異性抑制劑AZ505。

1.2.2 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cell,ESC)原代培養(yǎng) 將子宮內(nèi)膜組織分離成小段,用含P/G的1×HBSS 清洗3次,轉(zhuǎn)入盛有膠原酶Ⅰ溶液的離心管中,37 ℃水浴搖床中消化1 h,用10%FBS/HBSS終止消化,吹打使細(xì)胞分散成單個(gè),然后用200、400目篩網(wǎng)過濾,按5×105/ml密度接種細(xì)胞,用含P/G的10% FBS/DMEM培養(yǎng),培養(yǎng)到第6代開始相關(guān)檢測(cè)和藥物處理。

1.2.3 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化處理 細(xì)胞培養(yǎng)至第5代后以3×105/ml、1.5×105/ml密度接種于6孔板和放有爬片的24孔板,為第6代細(xì)胞,待細(xì)胞長至80%-90%時(shí)用雌、孕激素和環(huán)磷腺苷聯(lián)合誘導(dǎo)內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化,即用含10 nmol/L E2、1 μmol/L P4和0.5 mmol/L cAMP的2% FBS/DMEM培養(yǎng)細(xì)胞;蛻膜化+抑制劑組即為在以上蛻膜化的基礎(chǔ)上加入 SMYD2特異性抑制劑AZ505,其工作濃度為1 μmol/L。記錄加入培養(yǎng)基的時(shí)間,記為0 h,每48 h更換一次培養(yǎng)基。空白組和蛻膜化組細(xì)胞在0,48,96,144 h用Trizol 1 ml/孔收取6孔板細(xì)胞待提取RNA進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè),蛻膜化+抑制劑組只收取144 h細(xì)胞。24孔板細(xì)胞爬片在144 h用于相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法 24孔板細(xì)胞爬片設(shè)空白組、蛻膜化組、蛻膜化+抑制劑組各3個(gè)孔,細(xì)胞處理后培養(yǎng)至144 h時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用1×PBS 1 ml/孔洗3次,5 min/次。4%多聚甲醛溶液1 ml/孔固定20 min,1×PBS洗3次,5 min/次。0.2% Triton X-100溶液700 μl/孔室溫20 min,1×PBS洗3次,5 min/次。1% BSA溶液500 μl/孔封閉,37 ℃ 孵育1 h。一抗孵育:以SMYD2抗體為例,取干凈載玻片,在載玻片上貼封口膜并滴加3滴1 ∶250兔抗SMYD2抗體,將空白組、蛻膜化組、蛻膜化+抑制劑組爬片細(xì)胞面分別扣蓋在一抗液滴上,4 ℃過夜。以上述方法加1 ∶200兔抗P-P53抗體、1 ∶50鼠抗P53抗體。將爬片放入新的24孔板中,1×PBS洗3次,5 min/次。二抗孵育:在載玻片上貼封口膜并滴加與兔抗SMYD2抗體、兔抗P-P53抗體對(duì)應(yīng)的山羊抗兔熒光二抗488稀釋液(1 ∶400),與鼠抗P53抗體對(duì)應(yīng)的山羊抗鼠熒光二抗488稀釋液(1 ∶400),將對(duì)應(yīng)的爬片細(xì)胞面扣蓋在二抗液滴上室溫孵育1 h。1×PBS洗3次,5 min/次。在新載玻片上滴加5 μl含有DAPI的熒光介質(zhì),將爬片細(xì)胞面扣蓋在液滴上進(jìn)行封片,熒光顯微鏡觀察并照相。

1.2.5 real-time PCR 提取子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜化細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA,然后用FAST SYBR-Green進(jìn)行PCR反應(yīng)。由于甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)在組織中的表達(dá)相對(duì)恒定,故用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行校準(zhǔn)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃變性20 s;95 ℃退火1 s;60 ℃延伸20 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)real-time PCR結(jié)果進(jìn)行絕對(duì)定量統(tǒng)計(jì)。所用引物序列見表1。

表1 引物序列表

Table 1 Primer sequences

引物名稱引物序列 SMYD2上游序列:CCTCGGAGACTGTAAGACTAA下游序列:GCTTGATTTCCTGTACAGCTC P53上游序列:TCCTCAGCATCTTATCCGAG下游序列:AGTGGTTTCTTCTTTGGCTG GAPDH上游序列:GAGATCCCTCCAAAATCAAG下游序列:CTGATGATCTTGAGGCTGTT PRL上游序列:CCTGTCCCACTACATCCATA下游序列:CTCTAGAAGCCGTTTGGTTT LIF上游序列:CAGCCCATAATGAAGGTCTT下游序列:CAACTGGCACAGCTCAAT

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜蛻膜化細(xì)胞中的表達(dá)

通過檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子PRL在正常人和RSA患者ESC蛻膜化48,96,144 h 時(shí)mRNA的表達(dá)情況,可見它在蛻膜化組均比空白組表達(dá)明顯增高(P<0.05,見圖1A、1D),說明本實(shí)驗(yàn)蛻膜化處理是成功的。

real-time PCR結(jié)果可見,在正常人48,96,144 h蛻膜化組SMYD2、TRP53 mRNA均比空白組表達(dá)降低(P<0.05,見圖1B、1C)。在RSA患者,SMYD2 mRNA在蛻膜化48,96,144 h時(shí)比空白組表達(dá)降低(P<0.05,見圖1E),TRP53 mRNA在蛻膜化48,144 h時(shí)比空白組表達(dá)降低(P<0.05),但在96 h時(shí)蛻膜化組與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1F)。SMYD2和TRP53 mRNA在正常人和RSA患者蛻膜化細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

A-C.正常人PRL mRNA,SMYD2 mRNA,TRP53 mRNA表達(dá);D-F.反復(fù)自然流產(chǎn)患者PRL mRNA,SMYD2 mRNA,TRP53 mRNA表達(dá);con：空白組; E+P+C：蛻膜化組(E：雌二醇,P：孕酮,C：環(huán)磷腺苷cAMP);與空白組(con)比較,*P<0.05圖1 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中PRL、SMYD2和TRP53 mRNA表達(dá)Figure 1 The expression of PRL,SMYD2 and TRP53 mRNA in the process of decidualization of ESC

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和蛻膜化細(xì)胞中均檢測(cè)到較強(qiáng)信號(hào)的P53、P-P53、SMYD2。P53蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,P-P53蛋白表達(dá)在細(xì)胞核,且只在細(xì)胞核的特定位置表達(dá),SMYD2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。雌、孕激素聯(lián)合環(huán)磷腺苷誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化后,細(xì)胞由長梭形變圓并出現(xiàn)多核細(xì)胞。在正常人子宮內(nèi)膜蛻膜化細(xì)胞中,P53蛋白信號(hào)較空白組稍微減弱(見圖2A),P-P53和SMYD2蛋白信號(hào)較空白組明顯減弱(見圖2B,2C);RSA患者P53蛋白信號(hào)較空白組稍微減弱(見圖2D),P-P53和SMYD2蛋白信號(hào)較空白組明顯減弱(見圖2E,2F)。P53、P-P53和SMYD2蛋白變化趨勢(shì)在正常人和RSA患者子宮內(nèi)膜蛻膜化細(xì)胞中基本一致。

A1,B1,C1.正常人空白組細(xì)胞；A2,B2,C2.正常人蛻膜化組細(xì)胞；A3,C2,C3.正常人蛻膜化+抑制劑組細(xì)胞；D1,E1,F1.RSA患者空白組細(xì)胞；D2,E2,F2.RSA患者蛻膜化組細(xì)胞；D3,E3,F3.RSA患者蛻膜化+抑制劑組細(xì)胞(藍(lán)色：DAPI所染細(xì)胞核，綠色：蛋白質(zhì)免疫熒光信號(hào));P53蛋白表達(dá)在正常人和RSA患者基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中，P-P53蛋白表達(dá)在正常人和RSA患者基質(zhì)細(xì)胞胞核中，SMYD2蛋白表達(dá)在正常人和RSA患者基質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中；con：空白組 E+P+C：蛻膜化組 EPC + AZ505：蛻膜化+抑制劑組圖2 P53、P-P53和SMYD2蛋白在正常人和RSA患者各組細(xì)胞中的表達(dá) (×200)Figure 2 The expression of SMYD2,P53 and P-P53 protein in decidualized cells of normal controls and RSA patients by immunofluorescence assay (×200)

2.2 SMYD2特異性抑制劑AZ505對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化細(xì)胞中SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究SMYD2在子宮內(nèi)膜蛻膜化中的作用,本實(shí)驗(yàn)在對(duì)ESC蛻膜化處理的同時(shí)加入SMYD2特異性抑制劑AZ505 1 μmol/L。為驗(yàn)證抑制劑AZ505對(duì)蛻膜化的影響,本研究檢測(cè)了蛻膜化標(biāo)志分子PRL mRNA和子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志分子LIF mRNA的表達(dá)情況。用AZ505和EPC同時(shí)處理(AZ505+EPC)后,正常人和RSA患者細(xì)胞中PRL mRNA的表達(dá)均較蛻膜化細(xì)胞(EPC處理)中降低(P<0.05，見圖3A);正常人和RSA患者LIF mRNA的表達(dá)較蛻膜化細(xì)胞中增高(P<0.05，見圖3B)。

real-time PCR結(jié)果顯示,正常人和RSA患者細(xì)胞用抑制劑AZ505和EPC處理后,SMYD2 mRNA的表達(dá)較蛻膜化細(xì)胞無明顯差異(見圖3C);而TRP53 mRNA的表達(dá)較蛻膜化細(xì)胞降低(P<0.05，見圖3D)。

細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示,用抑制劑AZ505和EPC同時(shí)處理細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)較蛻膜化細(xì)胞并無明顯改變。在正常人和RSA患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中加入抑制劑AZ505后,P53蛋白、P-P53蛋白和SMYD2蛋白信號(hào)較蛻膜化組減弱,尤其是SMYD2蛋白,在正常人細(xì)胞核中幾乎看不到熒光信號(hào),在RSA患者細(xì)胞核中只有微弱表達(dá)(見圖2)。

con：空白組; E+P+C：蛻膜化組; EPC + AZ505：蛻膜化+抑制劑組(E：雌二醇; P：孕酮;C：環(huán)磷腺苷cAMP;AZ505：SMYD2特異性抑制劑)；與空白組(con)比較，*P<0.05;與E+P+C組比較，#P<0.05圖3 SMYD2特異性抑制劑AZ505對(duì)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中PRL、LIF、SMYD2和TRP53 mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of inhibitor AZ505 on the expression of LIF,SMYD2 and TRP53 mRNA in the decidualization of endometrial stromal cells

3 討論

反復(fù)自然流產(chǎn)是一種常見的妊娠并發(fā)癥,雖然定義為與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上自然流產(chǎn)的現(xiàn)象,但近年多數(shù)專家認(rèn)為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)的患者再次發(fā)生流產(chǎn)的機(jī)率與3次者相近。由于RSA病因非常復(fù)雜,且仍有超過55%患者病因不明,這使得臨床治療非常艱難。有研究表明,RSA患者與正常人相比子宮內(nèi)膜具有“超容受性”[3],子宮內(nèi)膜種植窗期延長,致使非優(yōu)質(zhì)胚胎植入從而發(fā)生流產(chǎn)。

子宮內(nèi)膜蛻膜化對(duì)胚胎著床和妊娠維持至關(guān)重要,蛻膜化的破壞不僅可以導(dǎo)致著床失敗和早期流產(chǎn),而且在整個(gè)妊娠期都可能會(huì)引起不利結(jié)局[4]。研究表明,小鼠子宮缺失P53基因會(huì)使蛻膜細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞,從而致使蛻膜細(xì)胞過早衰老并引起自發(fā)早產(chǎn)[5]。

目前,關(guān)于SMYD2的研究主要集中在腫瘤和各系統(tǒng)的發(fā)育等方面。在賴氨酸殘基370甲基化p53會(huì)抑制其活性,SMYD2通過抑制p53的腫瘤抑制作用而被認(rèn)為具有癌基因的功能,它是癌癥預(yù)后不良的一個(gè)重要因素[6,7]。研究表明,P53通路中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與不孕有關(guān)。體外受精(invitrofertilization,IVF)的不孕患者中,在第72位密碼子編碼脯氨酸的p53等位基因(p53 P72)比編碼精氨酸的p53等位基因(p53 R72)明顯豐富,對(duì)于35歲以下的IVF患者,P72是著床失敗的危險(xiǎn)因子,攜帶有同型純合子p53 P72基因的患者妊娠率比至少攜帶一個(gè)p53 R72等位基因的患者明顯降低[8]。此外,在利用輔助生殖技術(shù)助孕且有反復(fù)種植失敗和反復(fù)流產(chǎn)病史的不孕患者中普遍存在p53 P72基因[9]。LIF是胚胎植入的關(guān)鍵因子,與子宮內(nèi)膜容受性密切相關(guān)。胚胎著床時(shí)子宮內(nèi)LIF瞬時(shí)表達(dá)升高,敲除LIF的小鼠會(huì)致使胚胎著床失敗[10]。P53通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)LIF的表達(dá)而與哺乳動(dòng)物生殖密切相關(guān),有研究表明,p53-/-的小鼠由于LIF水平下降而使胚胎不能著床,注射外源性LIF后胚胎可以著床[11]。

本研究發(fā)現(xiàn),SMYD2和TRP53 mRNA在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中表達(dá)下降。此外,在體外誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的同時(shí)應(yīng)用SMYD2特異性抑制AZ505來進(jìn)一步了解SMYD2在蛻膜化過程中的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,應(yīng)用抑制劑后,蛻膜化標(biāo)志分子PRL mRNA表達(dá)降低,這說明SMYD2可以影響子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化。然而,抑制劑AZ505并不影響SMYD2 mRNA的表達(dá),細(xì)胞化學(xué)免疫熒光結(jié)果可見,應(yīng)用AZ505后SMYD2蛋白信號(hào)減弱,尤其是細(xì)胞核中的信號(hào)減弱更明顯,這說明AZ505并不影響SMYD2的轉(zhuǎn)錄水平,而是通過抑制其蛋白的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)功能。此外,應(yīng)用AZ505后LIF mRNA表達(dá)升高,TRP53 mRNA和蛋白表達(dá)下降,說明在蛻膜化過程中SMYD2對(duì)LIF和P53有調(diào)節(jié)作用,它可能是通過這種調(diào)節(jié)而在蛻膜化中發(fā)揮作用。

我們通過檢測(cè)SMYD2和P53在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中的表達(dá)以及應(yīng)用特異性抑制劑AZ505后SMYD2、TRP53 mRNA和蛋白以及LIF mRNA的改變,推測(cè)SMYD2在反復(fù)自然流產(chǎn)患者子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中具有重要作用,而且是通過調(diào)節(jié)P53和LIF的表達(dá)而發(fā)揮作用,但其具體作用機(jī)制并不清楚,對(duì)其信號(hào)通路的進(jìn)一步研究將為反復(fù)自然流產(chǎn)患者不良妊娠結(jié)局的原因提供新的思路,為臨床改善妊娠結(jié)局提供新的治療靶點(diǎn)。

[1] 肖世金,趙愛民.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因?qū)W研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2014,30(1):41-45.

[2] Mekinian A,Cohen J,Alijotas-Reig J,etal.Unexplained recurrent miscarriage and recurrent implantation failure:is there a place for immunomodulation[J]? Am J Reprod Immunol,2016,76(1):8-28.

[3] Salker M,Teklenburg G,Molokhia M,etal.Natural selection of human embryos:impaired decidualization of endometrium disables embryo-maternal interactions and causes recurrent pregnancy loss[J].PLoS One,2010,5(4):e10287.

[4] Kommagani R,Szwarc MM,Vasquez YM,etal.The promyelocytic leukemia zinc finger transcription factor is critical for human endometrial stromal cell decidualization[J].PLoS Genet,2016,12(4):e1005937.

[5] Lanekoff I,Cha J,Kyle JE,etal.Trp53 deficient mice predisposed to preterm birth display region-specific lipid alterations at the embryo implantation site[J].Sci Rep,2016,6:33023.

[6] Huang J,Perez-Burgos L,Placek BJ,etal.Repression of p53 activity by Smyd2-mediated Methylation[J].Nature,2006,444 (7119):629-632.

[7] Komatsu S,Ichikawa D,Hirajima S,etal.Overexpression of SMYD2 contributes to malignant outcome in gastric cancer[J].Br J Cancer,2015,112(2):357-364.

[8] Kang HJ,Feng Z,Sun Y,etal.Single-nucleotide polymorphisms in the p53 pathway regulate fertility in humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(24):9761-9766.

[9] Lledo B,Turienzo A,Ortiz JA,etal.Negative effect of P72 polymorphism on p53 gene in IVF outcome in patients with repeated implantation failure and pregnancy loss[J].J Assist Reprod Genet,2014,31(2):169-172.

[10] Chen JR,Cheng JG,Shatzer T,etal.Leukemia inhibitory factor can substitute for nidatory estrogen and is essential to inducing a receptive uterus for implantation but is not essential for subsequent embryogenesis[J].Endocrinology,2000,141 (12):4365-4372.

[11] Hu W,Feng Z,Teresky AK,etal.p53 regulates maternal reproduction through LIF[J].Nature,2007,450(7170):721-724.

Role of SMYD2 in endometrial decidualization of recurrent spontaneous abortion patients and its mechanism

YANG Hui1,2，ZHANG Changjun1,2，DIAO Honglu2

(1DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China；2ReproductiveMedicineCenter,RenminHospitalofHubeiUniversityofMedicine;*Correspondingauthor,E-mail:542690700@qq.com)

ObjectiveTo investigate the expression of SMYD2 in stromal cells and decidual cells of patients with recurrent spontaneous abortion(RSA),and its regulation effect on P53 and LIF expression.MethodsThe endometrial stromal cells of normal and RSA patients was decidualizedinvitro,and the cells were divided into blank control group,decidualization group and decidualization+inhibitor group.Real-time PCR and immunocytochemistry were used to observe the mRNA and protein expression of LIF,SMYD2,P53 in endometrial decidual cells and the effect of SMYD2-specific inhibitor AZ505 on the expression of SMYD2,P53 and LIF.ResultsIn normal and RSA patients,the expression of SMYD2 and TRP53 mRNA in decidualization group was lower than that in blank control group(P<0.05).The level of LIF mRNA was significantly higher in normal controls and RSA patients in decidualization+inhibitor group than that in decidualization group,and the TRP53 mRNA level was lower(P<0.05),however,the level of SMYD2 mRNA showed no statistical difference between two groups.Immunocytochemistry results showed that the SMYD2,P53 and P-P53 protein signals were weaker in decidual cells of normal controls and RSA patients in decidualization group than in blank control group,and the expression of SMYD2,P53 and P-P53 protein in normal and RSA patients was weaker in decidualization+inhibitor group than that in decidualization group.ConclusionSMYD2 may be involved in the process of decidualization of RSA patients by regulating the expression of P53 and LIF.

SMYD2； P53； LIF； recurrent spontaneous abortion； endometrium； decidualization

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015CFB543);湖北醫(yī)藥學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(2014CXX03,FDFR201604);湖北省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)和默克CREATE創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目

楊慧,女,1988-12生,碩士,E-mail:1184404059@qq.com

2016-12-20

R711.71

A

1007-6611(2017)04-0337-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.008