DSCR4基因在母胎間的甲基化差異及其臨床價(jià)值

麻妙艷,乞艷華,周 琦,鄔晉芳,周 妮,閆桂花

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)

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DSCR4基因在母胎間的甲基化差異及其臨床價(jià)值

麻妙艷1,乞艷華1,周 琦1,鄔晉芳2*,周 妮2,閆桂花2

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院超聲科,西安 710004;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;*通訊作者,E-mail:wjf2yuan@126.com)

目的 探討孕婦外周血中游離胎兒DSCR4基因的母胎甲基化差異,分析u-DSCR4基因的含量與孕周的相關(guān)性。 方法 共收集研究對(duì)象外周血樣本76例(包括健康未妊娠組10例,正常早、中、晚妊娠組各12例,唐篩高危組20例,正常產(chǎn)后10例),用甲基化特異性PCR方法擴(kuò)增DSCR4基因,定性檢測(cè)在各組中的擴(kuò)增情況,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行定量檢測(cè),分析各組中的u-DSCR4基因的含量變化。 結(jié)果 未妊娠組均未檢出u-DSCR4基因;正常妊娠組u-DSCR4基因檢出率為72.2%。中期妊娠、晚期妊娠組其含量分別是早期妊娠的1.75倍、2.50倍。孕有不同性別胎兒的母體血漿中u-DSCR4基因含量無(wú)顯著性差異。唐氏血清學(xué)篩查高危組u-DSCR4基因檢出率為75%,其含量是正常中期妊娠組的2.95倍。超聲篩查異常組u-DSCR4基因檢出率為75%,其含量與正常早期妊娠組相比較無(wú)明顯差異。 結(jié)論 DSCR4基因是具有母胎表觀遺傳學(xué)差異的可靠胎兒特異性標(biāo)志物,其含量隨孕周的增加而升高、與胎兒性別無(wú)關(guān),在唐氏血清學(xué)高危組有增高趨勢(shì)。

DSCR4； 甲基化; 唐氏綜合征

人類常見染色體異常疾病中,21三體綜合征發(fā)病率較高,在活產(chǎn)兒染色體病中占70%[1],本文選取唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域(Down’s syndrome critical region,DSCR)具有母胎甲基化差異的DSCR4基因?yàn)槟康幕騕2],在胎兒組織中呈低甲基化狀態(tài)(表示為u-DSCR4),而在相應(yīng)的母體自身組織中呈高甲基化狀態(tài)(表示為m-DSCR4),探索21三體發(fā)生潛在風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記,進(jìn)行有關(guān)孕婦外周血中u-DSCR4基因含量研究,希望能為唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2016-03～2016-09就診于本院的正常妊娠婦女36例,唐氏綜合征篩查高危孕婦20例,10例健康未妊娠女性志愿者,10例正常產(chǎn)后48 h健康婦女。所有研究對(duì)象均無(wú)內(nèi)外科及腫瘤相關(guān)疾病,年齡<35歲,體質(zhì)量<100 kg。入組標(biāo)準(zhǔn):①妊娠組:首次、單胎妊娠,自然受孕,無(wú)妊娠并發(fā)癥;②健康未妊娠組:無(wú)孕產(chǎn)史;③產(chǎn)后組:首次妊娠,正常分娩。本研究已取得所有研究對(duì)象的知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)可。將各組平均年齡進(jìn)行單因素方差分析,差異不顯著,各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表1)。

表1 各組研究對(duì)象的年齡和孕周比較

Table 1 Comparison of age and gestational weeks among different subjects

分組n平均年齡(歲)平均孕周(周)未妊娠1026.67±1.67正常妊娠 早期1226.44±3.5311.15±0.36 中期1226.80±3.0516.20±1.74 晚期1225.90±4.0038.40±1.43唐篩高危組 血清學(xué)篩查1227.33±3.6316.50±1.52 超聲篩查826.33±2.0611.28±0.05產(chǎn)后48h健康1027.33±4.65

1.2 方法

1.2.1 超聲篩查 使用GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀,選用二維凸陣探頭,頻率為2-5 MHz,檢測(cè)孕早期11-13+6周孕婦胎兒頸項(xiàng)透明層(nutral translucency,NT)厚度,采用NT大于3 mm為篩查異常的陽(yáng)性切斷值[3]。

1.2.2 血清篩查 采用孕中期二聯(lián)血清學(xué)篩查方法進(jìn)行篩查,以AFP+β-HCG為母體篩查標(biāo)記物,使用Au-toDELFIA自動(dòng)時(shí)光分辨檢測(cè)系統(tǒng),試劑盒來(lái)源于PerkinElmer公司,采用LifeCycle統(tǒng)計(jì)軟件處理分析,以大于1/270為陽(yáng)性切斷值[4,5]。

1.2.3 DSCR4檢測(cè)方法 分別抽取各組研究對(duì)象肘靜脈血2 ml,用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取DNA,DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理,甲基化特異性PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系及條件控制嚴(yán)格按照常規(guī)PCR要求進(jìn)行,分別擴(kuò)增u-DSCR4基因、m-DSCR4基因、β-actin基因(內(nèi)參基因),引物按照參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì),擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后觀察,判斷此兩種基因在各組中的擴(kuò)增情況。

以亞硫酸氫鹽處理后的血漿DNA為模板,應(yīng)用染料型SYBR Green I-實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量[7,8]檢測(cè)各妊娠組目的基因u-DSCR4的含量,β-actin為內(nèi)參基因,擴(kuò)增體系及條件控制嚴(yán)格按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR要求進(jìn)行。結(jié)果判定使用Delta-delta Ct相對(duì)定量法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)算公式如下:ΔCt=Ct目的基因u-DSCR4-Ct內(nèi)參基因β-actin；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組；2-ΔΔCt=各組目的基因相對(duì)于對(duì)照組目的基因含量的倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 定性結(jié)果

各組常規(guī)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在所有孕婦外周血中均存在u-DSCR4和m-DSCR4兩個(gè)基因條帶,即既包含非甲基化狀態(tài),也包含高甲基化狀態(tài);而在所有健康未孕及產(chǎn)后48 h健康婦女外周血中僅出現(xiàn)m-DSCR4一種基因條帶,即僅存高甲基化狀態(tài)。提示DSCR4基因在胎兒組織中呈低甲基化狀態(tài),而在相應(yīng)的母體自身組織中呈高甲基化狀態(tài)。亞硫酸氫鹽處理后健康未孕婦女、正常妊娠婦女、產(chǎn)后48 h健康婦女血漿u-DSCR4、m-DSCR4基因的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

1.健康未孕婦女u-DSCR4基因的擴(kuò)增;2.健康未孕婦女m-DSCR4基因的擴(kuò)增;3.正常妊娠婦女u-DSCR4基因的擴(kuò)增;4.正常妊娠婦女m-DSCR4基因的擴(kuò)增;5.產(chǎn)后48 h婦女u-DSCR4基因的擴(kuò)增;6.產(chǎn)后48h婦女m-DSCR4基因的擴(kuò)增;7.陰性對(duì)照?qǐng)D1 各組甲基化特異性PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis results of amplification products by methylation specific PCR

2.2 定量結(jié)果

10例健康未妊娠女性志愿者及10例產(chǎn)后48 h健康婦女樣本中均未擴(kuò)增出目的基因u-DSCR4,但內(nèi)參基因β-actin均見擴(kuò)增,即目的基因不存在于健康的未妊娠婦女及產(chǎn)后婦女體內(nèi)。

36例正常妊娠孕婦外周血中有26例檢出u-DSCR4基因,檢出率為72.2%。孕中、晚期孕婦外周血中u-DSCR4基因檢出量與早期妊娠相比較其差異具有顯著性,中期妊娠u-DSCR4基因的含量是早期妊娠的1.75倍,晚期妊娠u-DSCR4含量是早期妊娠的2.50倍(見表2)。

表2 正常早、中、晚妊娠組u-DSCR4基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)

Table 2 Comparison of relative quantification of u-DSCR4 gene among early,medium and late pregnancy groups

組別n陽(yáng)性平均ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt早期妊娠1279.38±1.350.00±1.35-中期妊娠12108.57±1.19-0.81±1.191.75晚期妊娠1298.06±0.89-1.32±0.892.50

隨訪出生后胎兒性別,共計(jì)男性胎兒17例,女性胎兒14例,失訪5例,在未失訪31例患者中u-DSCR4基因檢出者共20例,其中男胎12例,女胎8例,假設(shè)其他因素相同的條件下將性別因素作為研究因素,發(fā)現(xiàn)孕有不同性別胎兒的母體血漿中u-DSCR4基因含量無(wú)顯著性差異(見表3)。

表3 正常妊娠孕男性胎兒、女性胎兒組u-DSCR4基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)

Table 3 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in plasma of mothers with male or female fetuses

組別n陽(yáng)性平均ΔCtP孕男胎組17128.61±0.38>0.05孕女胎組1488.59±0.50

12例唐氏綜合征篩查高?；颊邫z出u-DSCR4基因者9例,其u-DSCR4基因的含量是正常中期妊娠組含量的2.95倍(見表4)。

表4 正常中期妊娠組和血清學(xué)篩查高危組u-DSCR4基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)

Table 4 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in medium-term pregnancy and serologic screening high-risk pregnancy

組別n陽(yáng)性平均ΔCtΔΔCt2-ΔΔCt中期妊娠12108.57±1.19-0.81±1.19—血清學(xué)高危1297.01±0.54-1.56±0.542.95

8例超聲檢查結(jié)果異?；颊邫z出u-DSCR4基因者6例,其u-DSCR4基因的含量與正常早期妊娠組含量相比較無(wú)明顯差異。

表5 正常早期妊娠組和超聲檢查異常組u-DSCR4基因相對(duì)定量數(shù)據(jù)

Table 5 Relative quantification of the u-DSCR4 gene in early pregnancy and ultrasound abnormal pregnancy

組別n陽(yáng)性平均ΔCtP早期妊娠1279.38±1.35>0.05超聲檢查異常868.50±0.42

3 討論

表觀遺傳改變是細(xì)胞內(nèi)除基因組外的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變,基因型未變而表型卻發(fā)生變化,DNA甲基化修飾是表觀遺傳的重要形式之一。近年來(lái)隨著表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展,2008年Chim等[9]系統(tǒng)研究了21號(hào)染色體上具有母胎甲基化差異的標(biāo)志序列,據(jù)此可以將母體外周血中來(lái)源于21號(hào)染色體的游離DNA片段加以區(qū)別,即能將胎兒DNA從母體DNA背景中區(qū)別出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)中20例非妊娠狀態(tài)女性組均未擴(kuò)增出u-DSCR4基因,僅擴(kuò)增出m-DSCR4基因,而妊娠組擴(kuò)增出兩條基因條帶,證實(shí)了u-DSCR4基因做為胎兒特異性的標(biāo)志是可靠的,是胎兒特有的具有母胎表觀遺傳學(xué)差異的標(biāo)志物,并且產(chǎn)后清除很快,不受前次妊娠的影響,在判斷本次妊娠中具有重要價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)共收集正常妊娠孕婦標(biāo)本36例,其中早、中、晚期妊娠各12例。目的基因相對(duì)定量顯示中期妊娠、晚期妊娠組u-DSCR4的含量分別是早期妊娠的1.75倍,2.5倍,表明正常孕婦血漿中u-DSCR4基因的檢出量隨妊娠進(jìn)展表現(xiàn)出升高趨勢(shì),隨著妊娠進(jìn)展,游離胎兒DNA含量隨之增多。本實(shí)驗(yàn)不能提供妊娠周數(shù)與游離胎兒DNA含量具有線性關(guān)系的證據(jù),如若采用絕對(duì)定量法進(jìn)行檢測(cè),則可能解決這個(gè)問題。絕對(duì)定量法須獲得目的基因u-DSCR4標(biāo)準(zhǔn)品,以精確計(jì)算目的基因u-DSCR4的拷貝數(shù),繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。目前研究孕婦外周血中游離胎兒DNA含量與孕周的關(guān)系多采用橫斷面研究方法,即樣本來(lái)源于同一妊娠階段的不同孕婦,若能夠監(jiān)測(cè)同一孕婦在不同妊娠階段外周血中游離胎兒DNA的含量,將能夠更有力地證明孕婦外周血中游離胎兒DNA含量與妊娠時(shí)期的關(guān)系。

DSCR4基因位于21號(hào)染色體上,故其含量可判斷胎兒21號(hào)染色體數(shù)目是否存在異常。本實(shí)驗(yàn)中唐氏血清學(xué)篩查高危組目的基因u-DSCR4含量較正常中期妊娠組明顯升高,提示u-DSCR4基因有望成為胎兒特異性標(biāo)志物進(jìn)行21-三體的產(chǎn)前診斷,但在母體血漿中的含量與唐氏綜合征的相關(guān)性有待于大樣本隨訪染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn)NT增厚與胎兒染色體異常引起的頸后皮下液體積聚有關(guān),對(duì)胎兒染色體異常等有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值[10],但是也有研究表明即使胎兒染色體正常,也可能出現(xiàn)NT值的異常情況[11]。本研究中超聲異常組孕婦外周血漿中u-DSCR4基因與正常妊娠組相比較并未發(fā)現(xiàn)有顯著差異,提示超聲異常并非唐氏綜合征篩查的特異性指標(biāo),但因樣本量較小,有待于大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述,本研究表明DSCR4基因是具有母胎表觀遺傳學(xué)差異的可靠胎兒特異性標(biāo)志物,其含量隨孕周的增加而升高、與胎兒性別無(wú)關(guān),在唐氏綜合征高危組有增高趨勢(shì)。近年來(lái)母體外周血中胎兒游離DNA的含量與妊娠相關(guān)疾病備受學(xué)者關(guān)注,但有關(guān)DSCR4基因研究的相關(guān)報(bào)道甚少,目前21號(hào)染色體上已發(fā)現(xiàn)具有母胎甲基化差異的基因包含AIRE,POTE及DSCR4基因,迄今為止沒有DSCR4基因含量研究的相關(guān)報(bào)道。孕婦外周血中u-DSCR4與唐氏綜合征的特征性表型尤其是智力低下有密切關(guān)聯(lián)[12],但是如何導(dǎo)致唐氏綜合征特征性表型的機(jī)理尚不明了,我們期待有關(guān)DSCR4基因的研究有突破性的進(jìn)展。

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Methylation difference of DSCR4 gene between maternal and fetal and its clinical value

MA Miaoyan1,QI Yanhua1,ZHOU Qi1,WU Jinfang2*,ZHOU Ni2,YAN Guihua2

(1DepartmentofUltrasound,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wjf2yuan@126.com)

ObjectiveTo investigate the methylation difference of DSCR4 gene between maternal and fetal,and analyze the correlation of u-DSCR4 gene content with the gestational age.MethodsSeventy-six subjects were collected according to the standard,including 10 healthy non-pregnant women,12 normal pregnant women of early pregnancy,12 normal pregnant women of medium pregnancy,12 normal pregnant women of late pregnancy,20 patients with high risk Down’s syndrome,10 women at postpartum 48 h.Methylation specific PCR was used to amplify the u-DSCR4 and m-DSCR4 genes.Real-time quantitative PCR was used to analyze the content of the u-DSCR4 gene and its influencing factors in each group.Results①The u-DSCR4 gene was not detected in non-pregnant women.In normal pregnancy,the detection rate of the u-DSCR4 gene in plasma was 72.2%.The concentration of the u-DSCR4 gene in the medium-term and third-trimester pregnancy was respectively 1.75 times and 2.50 times of early pregnancy.The concentration of the u-DSCR4 gene was not affected by the sex of the fetus.The detection rate in paitents with high serology screening risk of Down’s syndrome was 75%,and the concentration was 2.95 times of the medium-term pregnancy.The concentrations of the u-DSCR4 gene in patients with ultrasound abnormalities had no significant difference from that of the first-trimester pregnancy.ConclusionThe u-DSCR4 gene is a reliable specific marker of fetal with epigenetic differences.Its concentration increases with the time of pregnancy and is also higher in patients with high serology screening risk of Down’s syndrome,and has nothing to do with fetal sex.So it can be used in prenatal genetic diagnosis.

DSCR4; methylation; Down’s syndrome

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目(2015SF126,2016SF014)

麻妙艷,女,1986-03生,碩士,醫(yī)師,E-mail:miaoyanma@126.com

2016-12-29

R596.1

A

1007-6611(2017)04-0374-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.04.016