二至丸促進(jìn)圍絕經(jīng)期婦女成骨細(xì)胞增殖的分子機(jī)制

劉振濤 張怡元 林煜 王武煉 馮爾宥 林麗瓊 肖莉莉

廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科，福建 福州 350007

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)指主要由雌激素水平降低引起的骨質(zhì)疏松，為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，即骨形成與骨吸收均較活躍。臨床主要表現(xiàn)為骨折風(fēng)險和骨痛增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至出現(xiàn)死亡。

PMOP的中醫(yī)病因病機(jī)為腎虛脾虛血瘀等, 尤以腎虛的關(guān)系密切[1-2]。腎主骨生髓，骨質(zhì)疏松的首責(zé)在于腎虛, 治療當(dāng)以補(bǔ)腎為主[3]。骨質(zhì)疏松相關(guān)的腎虛證型有腎陽虛、腎陰虛和腎陰陽兩虛之分，目前中藥復(fù)方的基礎(chǔ)研究大多圍繞腎陽虛證展開。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，患者除了表現(xiàn)為腎陽虛證外，另有相當(dāng)一部分病人表現(xiàn)為腎陰虛證[4-6]，甚至有高達(dá)82%的病人比例見諸報端[7]。

臨床觀察證明,滋補(bǔ)腎陰可對腎陰虛型PMOP患者有理想的治療效果[8-9]。相關(guān)研究證明：滋補(bǔ)腎陰代表方二至丸可明顯提高腎陰虛骨質(zhì)疏松模型大鼠骨礦含量、骨密度和骨影面積，升高血清中雌二醇水平[10-14]，進(jìn)而改善骨質(zhì)疏松。因此我們隨機(jī)收集臨床42至50歲不同年齡段符合納入標(biāo)準(zhǔn)的圍絕經(jīng)期婦女松質(zhì)骨，分離培養(yǎng)體外成骨細(xì)胞，通過觀察二至丸干預(yù)前后圍絕經(jīng)期婦女成骨細(xì)胞數(shù)量，骨形態(tài)蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、雌激素受體α(estrogen receptor α,ER-α)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)水平變化，來探究二至丸對骨質(zhì)疏松的影響及作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗試劑和儀器

堿性磷酸酶AKP測定劑盒(南京建成生物工程研究所)，骨鈣素(OCN)酶聯(lián)免疫吸附測試試劑盒(SC公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒RR037Q， SYBRPremix Ex TaqTM PCR Kit RR42LR(TaKaRa公司)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(BB16/BB5060型，德國Heraus公司)，BT224半自動生化分析儀(意大利生物技術(shù)公司)，7900型實(shí)時定QPCR儀(美國ABI公司)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

取自2013年6月至2014年6月廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科新鮮股骨頸骨折行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，經(jīng)知情同意后取材?；颊呔鶠榕裕挲g42～50周歲，出現(xiàn)月經(jīng)改變現(xiàn)象，伴有出汗、陣發(fā)性潮熱、抑郁、記憶力減退、煩躁不安等圍絕經(jīng)期綜合征的臨床表現(xiàn)。符合《原發(fā)性骨質(zhì)疏松診療指南》[15]中骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床表現(xiàn)以腰背疼痛為主，伴有全身性疼痛，腰膝酸軟無力，并逐步加重，術(shù)前雙能X射線檢查骨密度減少2個標(biāo)準(zhǔn)差以上，血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)P1NP大于41. 6 ng /mL，S-CTX大于0.56 μg /L等。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①有糖尿病、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺等內(nèi)分泌疾病者；②有腎臟疾病和代謝性疾病者；③有骨關(guān)節(jié)腫瘤、結(jié)核、感染等病史者；④有長期服用影響骨代謝的藥物史。

1.4 臨床研究對象分組

符合納入標(biāo)準(zhǔn)病例在測試完骨密度和血清骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(P1NP和S-CTX)后，具體分組如下：絕經(jīng)前骨量正常組、絕經(jīng)前骨量減少組、絕經(jīng)后骨量正常組、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組。各組成骨細(xì)胞的培養(yǎng)條件采用預(yù)實(shí)驗后選取效果最好的25 μg·mL-1二至丸粗提液與含體積分?jǐn)?shù)為15%小牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液。

1.5 人成骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將手術(shù)中取下的股骨頭清除骨表面結(jié)締組織、軟骨，PBS沖洗3次，將松質(zhì)骨剪至1 mm3大小，再用PBS沖洗后，胰酶37℃消化30 min，棄胰蛋白酶，加入Ⅱ型膠原酶，37℃消化1h，收集上清液，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞；加入DMEM培養(yǎng)液(含15%NCS)，吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.95的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 藥物提取

取3000 g女貞子粉碎成粗粉，10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1小時，合并提取液,減壓濃縮回收乙醇,最終將提取液濃縮至3000 mL (每1 mL相當(dāng)于原藥材1 g)，-20 ℃儲藏備用。取3000 g墨旱蓮藥材，10倍量水回流提取2次，每次1小時，合并提取液,減壓濃縮回收水，最終將提取液濃縮至3000 mL(每1 mL相當(dāng)于原藥材1 g)，-20 ℃儲藏備用。臨用前取同體積女貞子、墨旱蓮粗提液混合均勻，得二至丸粗提液。

1.7 人成骨細(xì)胞增殖檢測

根據(jù)預(yù)實(shí)驗選取效果最好的25 μg·mL-1作為二至丸的最終實(shí)驗濃度。各組成骨細(xì)胞以2×103/mL孔密度接種于96孔板內(nèi)，72 h后采用MTT法分析各組成骨細(xì)胞增殖的情況，以酶標(biāo)儀570 nm處測得OD值表示結(jié)果。

1.8 細(xì)胞液中AKP、BMP-2、OCN的測定

分別按照各試劑盒說明書。

1.9 qPCR法檢測BMP-2、OCN和ER-α mRNA的表達(dá)

收集干預(yù)72 h的各組成骨細(xì)胞，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA并計算出RNA的濃度，根據(jù)濃度計算出需要逆轉(zhuǎn)錄的RNA的體積后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。BMP-2、OCN和ER-α的擴(kuò)增引物由上海生工公司合成。反轉(zhuǎn)錄后在ABI7900上按照說明書進(jìn)行mRNA擴(kuò)增，在得到擴(kuò)增曲線與CT值后，設(shè)復(fù)孔取平均值，每個樣本指標(biāo)重復(fù)3次。使用7900 system SDS 軟件計算數(shù)據(jù)，進(jìn)行組間相對量的比較。

表1 PCR所用引物序列Table 1 The primer sequences for PCR

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理分析

2 結(jié)果

2.1 二至丸對人成骨細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測發(fā)現(xiàn)干預(yù)前各組細(xì)胞增殖能力依次為絕經(jīng)前骨量正常組最佳、絕經(jīng)后骨量正常組次之、絕經(jīng)前骨量減少組再次之、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組最差，各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；采用濃度為25 μg·mL-1二至丸粗提液干預(yù)后，各組成骨細(xì)胞的增殖能力較干預(yù)前顯著上升，其中絕經(jīng)前骨量正常組最佳、絕經(jīng)后骨量正常組次之、絕經(jīng)前骨量減少組再次之、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組最差，絕經(jīng)后骨量正常組與絕經(jīng)前骨量減少組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，各組與同組干預(yù)前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 二至丸對人成骨細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effects of EZW on the proliferation

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較eP<0.05

2.2 二至丸對人成骨細(xì)胞細(xì)胞液中AKP表達(dá)的影響

采用比色法檢測培養(yǎng)液，結(jié)果顯示干預(yù)前各組細(xì)胞液中AKP濃度從高到低依次為：絕經(jīng)前骨量正常組最高、絕經(jīng)后骨量正常組次之、絕經(jīng)前骨量減少組再次之、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組最低。絕經(jīng)后骨量正常組與絕經(jīng)前骨量減少組著異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；采用二至丸粗提液干預(yù)后，各組成骨細(xì)胞液中AKP的表達(dá)較干預(yù)前顯著上升，各組與同組干預(yù)前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 二至丸對人成骨細(xì)胞細(xì)胞液中AKP表達(dá)的影響Table 3 Effects of EZW on the expression of AKP in culture

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較，eP<0.05

2.3 二至丸對人成骨細(xì)胞細(xì)胞液中BMP-2、OCN表達(dá)的影響

采用ELISA法檢測培養(yǎng)液，結(jié)果顯示，干預(yù)前，絕經(jīng)前骨量正常組細(xì)胞液中BMP-2、OCN濃度最高、絕經(jīng)后骨量正常組次之、絕經(jīng)前骨量減少組再次之、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組最低，各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；采用二至丸粗提液干預(yù)后，各組成骨細(xì)胞細(xì)胞液中BMP-2、OCN濃度較干預(yù)前顯著上升，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、表5。

表4 二至丸對人成骨細(xì)胞細(xì)胞液中BMP-2表達(dá)的影響Table 4 Effects of EZW on the expression of BMP-2 in culture fluid of

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較，eP<0.05

2.4 二至丸對人成骨細(xì)胞BMP-2、OCN和ER-α mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示：干預(yù)前，絕經(jīng)前骨量正常組細(xì)胞液中BMP-2、OCN和ER-α mRNA表達(dá)最高、絕經(jīng)后骨量正常組次之、絕經(jīng)前骨量減少組再次之、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組最低，絕經(jīng)后骨量正常組與絕經(jīng)前骨量減少組無顯著差異，其余各組組間比較較均有顯著性差異(P<0.05)，干預(yù)后各組成骨細(xì)胞BMP-2、OCN和ER-α mRNA的表達(dá)均高于干預(yù)前，各組組間比較均有顯著性差異(P<0.05)。見表6、表7、表8。

表5 二至丸對人成骨細(xì)胞細(xì)胞液中OCN表達(dá)的影響Table 5 Effects of EZW on the expression of OCN in

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較，eP<0.05

表6 二至丸對人成骨細(xì)胞BMP-2mRNA表達(dá)的影響Table 6 Effects of EZW on the expression of BMP-2 mRNA

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較，eP<0.05

表7 二至丸對人成骨細(xì)胞OCNmRNA表達(dá)的影響Table 7 Effects of EZW on the expression of OCN mRNA

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較，eP<0.05

3 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的主要發(fā)病機(jī)制在于骨吸收大于骨形成，成骨細(xì)胞在骨重建過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)在骨代謝的研究中非常重要，不僅可為篩選骨代謝相關(guān)疾病提供細(xì)胞模型，還是研究骨代謝機(jī)制的重要手段之一。目前，人成骨細(xì)胞的主要來源為新生兒顱骨[13]和成人松質(zhì)骨[14]，由于新生兒顱骨來源的成骨細(xì)胞增殖分化較旺盛，與骨質(zhì)疏松患者的成骨能力差異較大，且取材不符合倫理學(xué)的要求，因此我們選用圍絕經(jīng)期成人骨折后的松質(zhì)骨標(biāo)本，且均經(jīng)患者同意，簽署知情同意書。后用胰蛋白酶多次消化取得的成骨細(xì)胞，更接近于骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞功能狀態(tài)，數(shù)量較多，形態(tài)多樣，生長穩(wěn)定，有明顯的成骨細(xì)胞特征，研究結(jié)果可能更接近于臨床。本實(shí)驗隨機(jī)收集臨床符合納入標(biāo)準(zhǔn)的圍絕經(jīng)期婦女松質(zhì)骨培養(yǎng)出原代成骨細(xì)胞，連續(xù)傳代增殖，純度較高，有穩(wěn)定的細(xì)胞生物學(xué)特征，具有良好的細(xì)胞增殖分化與成骨活性[16]。

表8 二至丸對人成骨細(xì)胞ER-α mRNA表達(dá)的影響Table 8 Effects of EZW on the expression of

注：與同組干預(yù)前比較，aP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量正常組比較，bP<0.05；與同時期絕經(jīng)前骨量減少組比較，cP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨量正常組比較，dP<0.05；與同時期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組比較，eP<0.05

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明,絕經(jīng)后雌激素水平下降，骨量丟失，是公認(rèn)的PMOP發(fā)生的關(guān)鍵性因素[17]，有統(tǒng)計顯示，大于50歲的女性因骨質(zhì)疏松所致骨折風(fēng)險可增加20%[18]。絕經(jīng)后婦女因卵巢功能減弱，雌激素水平降低，導(dǎo)致骨骼中鈣結(jié)合能力下降，破骨細(xì)胞的骨吸收能力增強(qiáng)，骨質(zhì)丟失速度增快，引起骨量減少、骨脆等[19]。雌激素主要通過結(jié)合雌激素受體(ER)作用于骨組織，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生長，調(diào)控骨吸收和骨形成的平衡，因此,ER在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的樞紐作用[20]。雌激素受體之一ER-α與雌激素結(jié)合后，可發(fā)揮促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)[21]。本實(shí)驗的檢測發(fā)現(xiàn)：二至丸干預(yù)后各組的ER-α mRNA表達(dá)明顯高于干預(yù)前各組。由此推測二至丸可能通過上調(diào)成骨細(xì)胞ER-α mRNA的表達(dá)，基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)一步升高，直接加速成骨細(xì)胞增殖分化，或間接地激活胞外信號調(diào)控激酶，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，抑制成骨細(xì)胞凋亡。藥理實(shí)驗證實(shí),滋補(bǔ)腎陰中藥可提高血清雌二醇水平,而雌激素水平下降與骨質(zhì)疏松的發(fā)生顯著相關(guān)[22-23],所以二至丸可能通過提高血清雌激素水平,來增加骨密度、骨礦含量和骨影面積,改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥狀。

同時，本實(shí)驗還運(yùn)用比色法、RT-PCR法和ELISA法檢測AKP蛋白、BMP-2mRNA、BMP-2蛋白、OCNmRNA和OCN蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)：二至丸干預(yù)前后這些物質(zhì)的表達(dá)均有明顯改變，且干預(yù)后明顯高于干預(yù)前(P<0.05)。骨鈣素(OCN)屬于一種主要由成骨細(xì)胞合成分泌的具有促進(jìn)成骨作用的γ-羧谷氨酸包含蛋白，大部分沉積于骨基質(zhì)，維持骨的正常礦化，是骨基質(zhì)礦化的必需因子，只有小部分釋放入血[24]，骨中含量與血中含量成正相關(guān)性，可直接反映成骨細(xì)胞的活動狀態(tài)和骨鈣化的速率[25-26]，是成骨細(xì)胞中期的功能性標(biāo)志物，可以作為骨質(zhì)疏松動態(tài)變化的評價指標(biāo)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)由成骨細(xì)胞分泌酸性糖蛋白[27]，是唯一可以單獨(dú)誘導(dǎo)骨組織形成的局部生長因子。其中BMP-2是誘導(dǎo)成骨和刺激成骨細(xì)胞分化活性最強(qiáng)的BMPs之一[28]，具有啟動成骨的全部潛能。堿性磷酸酶(AKP)是成骨細(xì)胞分泌的一種胞外酶，主要功能是在成骨時水解磷酸脂，為羥基磷灰石的沉積提供必要的磷酸，同時水解焦磷酸鹽，使其對骨鹽形成的抑制作用得到解除，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，利于成骨[29-30]，是細(xì)胞骨化所必須的的酶,其表達(dá)活性是成骨細(xì)胞增殖和早期分化的明顯標(biāo)志之一。由檢測結(jié)果可得：二至丸能夠通過某種未知的作用促進(jìn)成骨基因BMP-2、OCN以及AKP蛋白的表達(dá)，促進(jìn)骨形成。

藥理研究發(fā)現(xiàn)，二至丸的主要成分女貞子和墨旱蓮中含有萜類、黃酮類和香豆草醚類化合物等物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與雌二醇相似而具有雌性激素樣作用[31-32]，對成骨細(xì)胞增殖和分化均有促進(jìn)作用，能有效地防治骨質(zhì)疏松，又可避免為機(jī)體帶來其他副作用。由此，本研究結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測其機(jī)制，可能是二至丸中含有類雌激素樣物質(zhì)能夠有效促進(jìn)成骨細(xì)胞中ER-α表達(dá)并結(jié)合，繼而提升BMP-2、OCN以及AKP基因和蛋白表達(dá)量，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖分化和成骨功能。

綜上，本實(shí)驗在細(xì)胞水平觀察了二至丸對成骨細(xì)胞增殖分化的影響，發(fā)現(xiàn)其治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制與其促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的效用切實(shí)相關(guān)，為二至丸治療骨質(zhì)疏松癥提供了理論和實(shí)驗依據(jù)。然而其促進(jìn)成骨細(xì)胞增值分化抗骨質(zhì)疏松的具體成分和分子機(jī)制并不十分清楚，在下一步的研究中，我們將從這一方面著手，為本實(shí)驗所反映的現(xiàn)象作進(jìn)一步的論證和分析。