復(fù)方芪麻膠囊的質(zhì)量標(biāo)準研究Δ

孫冬梅，林曉燕，李素梅，江潔怡，羅文匯，陳雪（.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州50095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣東第二中醫(yī)院，廣州50405）

復(fù)方芪麻膠囊的質(zhì)量標(biāo)準研究Δ

孫冬梅1＊，林曉燕1，2，李素梅1，江潔怡1，羅文匯1，陳雪1，2（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣東第二中醫(yī)院，廣州510405）

目的：建立復(fù)方芪麻膠囊的質(zhì)量標(biāo)準。方法：采用薄層色譜法（TLC）對制劑中黃芪、天麻、化橘紅和川芎進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定制劑中天麻素和對羥基苯甲醇的含量：色譜柱為Waters XBridge C18，流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97，V/V），流速為1.0m L/min，檢測波長為220 nm，柱溫為25℃，進樣量為10μL。結(jié)果：黃芪、天麻、化橘紅和川芎的TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。天麻素、對羥基苯甲醇檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為7.97～59.76μg/m L（r＝0.999 5）、4.27～32.04μg/m L（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜1.0%；加樣回收率分別為98.98%～100.11%（RSD＝0.35%，n＝9）、98.74%～100.23%（RSD＝0.43%，n＝9）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準可用于復(fù)方芪麻膠囊的質(zhì)量控制。

復(fù)方芪麻膠囊；質(zhì)量標(biāo)準；薄層色譜法；高效液相色譜法

復(fù)方芪麻膠是由黃芪、天麻、茯苓、法半夏、化橘紅、澤瀉、川芎7味中藥經(jīng)水煎濃縮制備而成，具有健脾益氣、化痰通絡(luò)的功效，用于治療高血壓氣虛痰濁型。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二中醫(yī)院多年臨床使用證實，其具有確切的療效，但一直沒有完善的質(zhì)量標(biāo)準，缺乏定性鑒別和含量測定項目。為全面有效地控制該制劑質(zhì)量，并確保臨床用藥的安全有效，本試驗采用薄層鑒別法（TLC）對黃芪、天麻、化橘紅和川芎4味藥材進行定性鑒別，同時采用高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中天麻素和對羥基苯甲醇含量，為其質(zhì)量標(biāo)準的制定提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695-2489型HPLC儀，包括DAD檢測器（美國Waters公司）；AT-201型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：700W，頻率：40 kHz）；HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金控市科技儀器有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；L-500型離心機（上海利鑫堅離心機有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方芪麻膠囊（廣東省第二中醫(yī)院制劑室自制，批號：140301、140302、140303，規(guī)格：0.5 g/粒）；天麻對照藥材（批號：120944-200507）、黃芪對照藥材（批號：110781-200613）、化橘紅對照藥材（批號：121165-200502）、川芎對照藥材（批號：120918-201110）、天麻素對照品（批號：110807-200205，純度：98%）、黃芪甲苷對照品（批號：110781-200613，純度：98%）、柚皮苷對照品（批號：110722-201111，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對羥基苯甲醇對照品（美國Sigma-Alderich公司，批號：BCBM 1771V，純度：99%）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芪取樣品內(nèi)容物3.5 g，加水40m L，加熱使溶解，以半徑為0.89 cm、3 000 r/m in離心5m in，取上清液用水飽和的正丁醇振搖提取2次（每次30m L），合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次（每次30m L），棄氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5m L使溶解，放冷；經(jīng)大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50m L洗脫，棄去水液；以40%乙醇溶液30m L洗脫，棄去洗脫液；再以70%乙醇溶液80m L洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇2m L使溶解，作為供試品溶液[1-2]。另取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1mg/m L的對照品溶液。再取黃芪對照藥材3 g，加水50m L，煮沸30m in，濾過，濾液加水飽和的正丁醇振搖提取，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按復(fù)方芪麻膠囊處方和工藝制備缺黃芪的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][3]試驗，吸取上述4種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸-水（10∶20∶11∶5，V/V/V/V）于10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視，同時置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1。

2.1.2 天麻取樣品內(nèi)容物1.5 g，加70%乙醇溶液5 m L，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取天麻素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/m L的對照品溶液。再取天麻對照藥材0.5 g，加70%乙醇溶液5m L，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液[4]。按復(fù)方芪麻膠囊處方和工藝制備缺天麻的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][3]試驗，吸取上述4種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（9∶1∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖2。

圖1 黃芪的薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram sof Radix astragali

圖2 天麻的薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogramsof Gastrodia elata

2.1.3 化橘紅取樣品內(nèi)容物2 g，加水30m L使溶解，以半徑為0.89 cm、3000 r/m in離心5m in，取上清液，用乙酸乙酯振搖提取2次（每次20m L），合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1m L使溶解，作為供試品溶液。另取柚皮苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1mg/m L的對照品溶液。再取化橘紅對照藥材1 g，加水100m L，微沸30m in，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液[5-6]。按復(fù)方芪麻膠囊處方和工藝制備缺化橘紅的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][3]試驗，吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，對照品溶液4μL，對照藥材溶液2 μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105℃加熱1min，置紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖3。

圖3 化橘紅的薄層色譜圖1～3.供試品；4.對照藥材；5.對照品；6.陰性對照Fig 3 TLC chromatogramsof Pummelo Peel1-3.test samples；4.reference substance；5.substance control；6.negative control

2.1.4 川芎取樣品內(nèi)容物5 g，加甲醇30m L，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20m L使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30m L，合并乙酸乙酯液，用5%碳酸氫鈉溶液振搖提取2次，每次30m L，合并5%碳酸氫鈉溶液，加稀硫酸調(diào)pH至1，用乙醚振搖提取2次，每次30m L；合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1m L使溶解，作為供試品溶液。另取川芎對照藥材2 g，加水100m L，微沸1 h，濾過，濾液濃縮至約5m L，加硅藻土適量吸附，蒸干，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加甲醇30m L，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液[7]。按復(fù)方芪麻膠囊處方和工藝制備缺川芎的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][3]試驗，吸取上述3種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶4∶0.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以含1%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱3～4m in，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖4。

圖4 川芎的薄層色譜圖Fig 4 TLC chromatogram sof Ligusticum chuanxiong

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱：Waters XBridge C18（250mm× 4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97，V/V）；流速：1.0m L/m in；檢測波長：220 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL[7]。

2.2.2 混合對照品溶液的制備精密稱取待測成分對照品適量，置于50m L量瓶中，加乙腈-水（3∶97，V/V）溶解并定容，制成天麻素、對羥基苯甲醇質(zhì)量濃度分別為0.199 2、0.106 8mg/m L的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備取粉碎均質(zhì)后的樣品1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入40%乙醇溶液50m L，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30m in，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，加40%乙醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10m L，濃縮至近干，殘渣加乙腈-水（3∶97，V/V）溶解，轉(zhuǎn)移至25m L量瓶中，加乙腈-水（3∶97，V/V）定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備按復(fù)方芪麻膠囊處方和工藝制備缺天麻的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖5。結(jié)果，陰性對照色譜圖在對照品色譜圖相應(yīng)的位置上無對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性較好。

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chrom atogram s

2.2.6 線性關(guān)系考察分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5m L，分別置于5m L量瓶中，加乙腈-水（3∶97，V/V）定容，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得天麻素、對羥基苯甲醇回歸方程分別為y＝1.74×103x+5.63×103（r＝0.999 5）、y＝3.44×103x－6×103（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，天麻素、對羥基苯甲醇檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為7.97～59.76、4.27～32.04μg/m L。2.2.7精密度試驗取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，天麻素、對羥基苯甲醇峰面積的RSD分別為0.28%、0.45%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：140301）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，天麻素、對羥基苯甲醇峰面積的RSD分別為0.20%、0.16%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗精密稱取同一批樣品（批號：140301）適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，天麻素、對羥基苯甲醇峰面積的RSD分別為0.82%、0.67%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗取已知含量樣品（批號：140301）適量，每份1.5 g，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Resultsof recovery test（n＝9）

2.2.11 樣品含量測定取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，m g/g）Tab 2 Results of contents determ ination of sam p les（n＝3，mg/g）

本試驗對復(fù)方芪麻膠囊中黃芪、化橘紅、天麻、川芎均進行了TLC鑒別，結(jié)果表明方法專屬性強，分離度良好，無拖尾現(xiàn)象；在茯苓、澤瀉、法半夏鑒別中，筆者按2015年版《中國藥典》（一部）茯苓、澤瀉、法半夏項下方法均進行了鑒別，結(jié)果在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，但陰性有干擾，故未列入本次考察。

筆者分別比較了柱溫為20、25、30℃，流速為0.8和1.0m L/min條件下的色譜分離效果。結(jié)果表明，柱溫為25℃，流速為1.0m L/m in時基線平穩(wěn)，分離效果較好。筆者共考察了3種不同品牌的色譜柱[Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），Waters Xbridge C18（250mm× 4.6mm，5μm），Merk Hibar?250-4，6（250mm×4.6mm，5μm）]，結(jié)果，Waters Xbridge C18分離效果較好。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準可用于復(fù)方芪麻膠囊的質(zhì)量控制。

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Study on Quality Standard for Compound Qima Capsules

SUN Dongmei1，LIN Xiaoyan1，2，LISumei1，JIANG Jieyi1，LUO W enhui1，CHEN Xue1，2（1.Guangdong Provincial Institute of TCM Engineering Technology Research/Guangdong Provincial Key Lab of Research and Development in TCM，Guangzhou 510095，China；2.Guangdong Second Chinese Medical Hospital Affiliated to Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Compound qima capsules.METHODS：TLC was used for the qualitative identification of Radix astragali，Gastrodia elata，Pummelo Peel and Ligusticum chuanxiong.HPLC method was adopted for the contents determ ination of gastrodin and gastrodigenin.The determ ination wasp performed on W aters XBridge C18column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（3∶97，V/V）at the flow rate of 1.0 m L/m in.The detection wavelength was set at 220 nm，column temperature was 25℃and sample size was 10μL.RESULTS：The TLC spots of R.astragali，G. elata，Pummelo Peel and L.chuanxiong were clear and well separated w ithout the interference of negative samples.The linear ranges of gastrodin and gastrodigenin were 7.97-59.76μg/m L（r＝0.999 5），4.27-32.04μg/m L（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and repeatability tests were all lower than 1.0%.Recoveries of them were 98.98%-100.11%（RSD＝0.35%，n＝9），98.74%-100.23%（RSD＝0.43%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：Established method can be used for quality control of Compound qima capsules.

C ompound qima capsules；Quality standard；TLC；HPLC

R 917

A

1001-0408（2017）18-2553-04

2016-08-19

2016-10-23）

（編輯：張靜）

廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥強省專項（No.粵中醫(yī)辦函〔2015〕102號）

＊主任中藥師，教授。研究方向：中藥質(zhì)量評價。E-mail：1026866717@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.30