一測多評法同時(shí)測定降脂減肥保健品中兒茶素類活性成分的含量Δ

謝靜，韋杰，周璐煒，何金蓮，王乾龍，杜蕾蕾（.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都60083；.中國科學(xué)院成都生物研究所湖州生物資源利用與開發(fā)創(chuàng)新中心，浙江湖州33000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都637）

·藥物分析與檢定·

一測多評法同時(shí)測定降脂減肥保健品中兒茶素類活性成分的含量Δ

謝靜1＊，韋杰1，周璐煒1，何金蓮1，王乾龍2，杜蕾蕾3#（1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都610083；2.中國科學(xué)院成都生物研究所湖州生物資源利用與開發(fā)創(chuàng)新中心，浙江湖州313000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都611137）

目的：建立同時(shí)測定減肥降脂保健品中兒茶素類活性成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，以表沒食子基兒茶素沒食子酸酯（EGCG）為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其與沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子基兒茶素沒食子酸酯（GCG）和沒食子酰表兒茶素（ECG）的相對校正因子（RCF），通過RCF計(jì)算樣品中EGC、C、EC、GCG、ECG的含量，以外標(biāo)法測定的EGC、C、EC、GCG和ECG含量作實(shí)測值；采用向量夾角余弦法評估實(shí)測值與計(jì)算值之間的相似性。結(jié)果：EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.006 5～0.130 5mg/m L（r＝0.999 8）、0.000 5～0.010 7mg/m L（r＝0.999 7）、0.002 0～0.040 0 mg/m L（r＝0.999 9）、0.015 3～0.305 3mg/m L（r＝0.999 8）、0.000 8～0.015 5mg/m L（r＝0.999 8）、0.004 0～0.079 2mg/m L（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為95.07%～100.35%（RSD＝1.94%，n＝6）、95.24%～101.87%（RSD＝2.79%，n＝6）、96.08%～103.86%（RSD＝3.01%，n＝6）、97.51%～101.06%（RSD＝1.45%，n＝6）、96.01%～101.66%（RSD＝2.27%，n＝6）、96.20%～102.89%（RSD＝2.71%，n＝6）。實(shí)測值與計(jì)算值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于減肥降脂保健品中兒茶素類活性成分的含量測定。

減肥；保健品；兒茶素；一測多評法；高效液相色譜法

以兒茶素成分為主的茶多酚提取物對人體健康有積極影響[1]，尤其是其具有降糖降脂等多種活性，常作為降脂減肥的功能原料用于保健品中[2]。目前，對含茶多酚保健品的質(zhì)控方法仍以比色法測定為主[3]。雖然有較多文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜法（HPLC）外標(biāo)法測定藥材及其制劑中兒茶素成分的含量[4-5]，但由于兒茶素類多為成對光學(xué)異構(gòu)體，純化困難，價(jià)格較昂貴，從而導(dǎo)致文獻(xiàn)所報(bào)道的外標(biāo)法在生產(chǎn)和檢驗(yàn)實(shí)際工作中應(yīng)用有限。近年來提出的一測多評法可克服此不足[6]。一測多評法通過測定1個(gè)成分（對照品供應(yīng)充足、易得者）與其他組分（對照品難供應(yīng)、昂貴者）之間的相對校正因子（RCF），而實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同時(shí)測定。一測多評法已收錄入2015年版《中國藥典》并應(yīng)用于多種藥材中有效成分的定量分析[7]，本研究即基于一測多評建立的技術(shù)指南[8]，建立了以表沒食子基兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測定含表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒食子基兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、沒食子酰表兒茶素（Epicatechin gallate，ECG）含量的一測多評法，用于保健品中6種兒茶素成分的質(zhì)量評價(jià)與控制。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010型HPLC儀，含LC-20AD二元高壓泵、DGU-20A3R自動脫氣機(jī)、SIL-20A自動進(jìn)樣器、MSDM 20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率：200W，頻率：40 kHz）；GA110型電子分析天平（美國Ohaus公司）。

1.2 藥品與試劑

某減肥膠囊（A公司，批號：150921，規(guī)格：0.30 g/粒，無茶多酚標(biāo)示量）；某減肥膠囊（B公司，批號：612165005，規(guī)格：0.45 g/粒，茶多酚標(biāo)示量：14.1%）；某減肥膠囊（C公司，批號：20160407，規(guī)格：0.40 g/粒，茶多酚標(biāo)示量：3.67%）；某減肥茶（D公司，批號：150502，規(guī)格：2 g/袋，茶多酚標(biāo)示量：5.0%）；某左旋多酚片（E公司，批號：151001，規(guī)格：0.80 g/片，茶多酚標(biāo)示量：4.04%），上述5批樣品編號為S1～S5；EGC對照品（批號：PS14110601）、C對照品（批號：PS15042901）、EGCG對照品（批號：PS15042701）、EC對照品（批號：PS15050901）、GCG對照品（批號：PS14102902）、ECG對照品（批號：PS1410202）均購自成都普思生物科技股份有限公司，純度均＞98.5%；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理

化合物的量與其檢測器響應(yīng)值在一定線性范圍內(nèi)成正比（f＝A/C）。在多成分同時(shí)分析時(shí)，通過選取其中一種成分為內(nèi)標(biāo)物，建立該成分與其他成分之間的RCF（fkm）：

其中，Ck、Cm分別為內(nèi)標(biāo)物、待測物的濃度，Ak、Am分別為內(nèi)標(biāo)物、待測物的檢測器響應(yīng)值。通過RCF，計(jì)算出樣品中其他待測成分的含量：

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Wonda CractODS-2（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：0.5%乙酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～40m in，10%→30%B）；流速：1.0m L/m in；檢測波長：280 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以EGCG峰計(jì)不少于10 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram s

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液分別取待測成分對照品各適量，加50%甲醇溶液制成EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG質(zhì)量濃度分別為6.2、5.1、9.5、5.8、4.9、4.7mg/m L的單一對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液取樣品（膠囊取內(nèi)容物、片劑粉碎、袋泡茶直接取樣）200mg，精密稱定，置于50m L量瓶中，加50%甲醇溶液45m L，超聲提取15m in，靜置至室溫，加50%甲醇溶液定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

將“2.3.1”項(xiàng)下EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG對照品溶液以10∶1∶2∶25∶1.5∶8（V/V/V/V/V/V）的比例混合，得工作溶液Ⅰ（EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG質(zhì)量濃度分別為0.130 5、0.010 7、0.040 0、0.305 3、0.015 5、0.079 2mg/m L），加50%甲醇溶液逐級稀釋得工作溶液Ⅱ～Ⅴ。精密量取上述工作溶液Ⅰ～Ⅴ各10μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/m L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equationsand linear ranges

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S2）適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG峰面積的RSD分別為0.55%、0.76%、0.47%、0.39%、0.51%、0.36%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S2）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16 h時(shí)按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG峰面積的RSD分別為1.02%、0.87%、1.15%、1.33%、0.79%、1.26%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（編號：S2）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，EGC、C、EC、EGCG、GCG和ECG峰面積的RSD分別為1.83%、1.45%、1.92%、1.76%、2.06%、1.13%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（編號：S2）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 RCF的計(jì)算

以EGCG為內(nèi)標(biāo)，按“2.1”項(xiàng)下公式計(jì)算，結(jié)合“2.4”項(xiàng)下系列混合對照品溶液所得峰面積數(shù)據(jù)，計(jì)算EGCG對EGC、C、EC、GCG和ECG的RCF。結(jié)果，EGCG對EGC、C、EC、GCG和ECG的RCF分別為0.54、0.35、0.41、0.89、0.60。

2.10 一測多評法的系統(tǒng)應(yīng)用性考察

2.10.1 不同流速考察精密量取“2.4”項(xiàng)下工作溶液Ⅰ適量，分別考察0.8、1.0、1.3m L/m in的流速對RCF的影響，結(jié)果，EGCG對EGC、C、EC、GCG和ECG RCF的RSD分別為1.63%、1.39%、2.11%、2.53%、1.96%（n＝3），表明流速對RCF無顯著影響。

2.10.2 不同柱溫考察精密量取“2.4”項(xiàng)下工作溶液Ⅰ適量，分別考察柱溫為25、35、40℃對RCF的影響。結(jié)果，EGCG對EGC、C、EC、GCG和ECG RCF的RSD分別為1.05%、1.21%、1.73%、2.06%、1.64%（n＝3），表明柱溫對RCF無顯著影響。

2.10.3 不同進(jìn)樣量考察精密量取“2.4”項(xiàng)下工作溶液Ⅰ5、10、20μL，考察不同進(jìn)樣量對RCF的影響。結(jié)果，EGCG對EGC、C、EC、GCG和ECG RCF的RSD分別為1.21%、1.29%、1.43%、1.81%、1.67%（n＝3），表明進(jìn)樣量對RCF無顯著影響。

2.11 樣品含量測定

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Resultsof recovery tests（n＝6）

取5批樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，計(jì)算EGC、C、EC、GCG和ECG的實(shí)測值和計(jì)算值之間的夾角余弦值[9]，結(jié)果見表3（表中ES為實(shí)測值，QAMS為計(jì)算值，Cir為夾角余弦值）。結(jié)果表明，兩種方法所得含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of contents determ ination of sam p les（n＝3，%）

3 討論

本研究針對添加茶多酚的降脂減肥保健品中的兒茶素類成分進(jìn)行定量分析，對一測多評法的技術(shù)適用性和實(shí)踐可行性進(jìn)行了充分的探討。結(jié)果表明，一測多評法計(jì)算出的結(jié)果與常規(guī)外標(biāo)法測得的結(jié)果之間具有較高的相似度，表明一測多評法可實(shí)現(xiàn)以較易獲得的、便宜的EGCG為內(nèi)標(biāo)，通過確定RCF計(jì)算其余5種兒茶素的含量，實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)；而且一測多評法具有實(shí)驗(yàn)室間差別小的特點(diǎn)，方法成功建立后，可以在不同部門、不同單位之間直接使用，適合于藥品生產(chǎn)企業(yè)及監(jiān)管部門等的大批量常規(guī)檢測。

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ContentsDeterm ination of Catechins Active Components in Lipid-lowering Slimm ing Health Productsby Quantitative AnalysisofMulti-Componentsvia Single Marker

XIE Jing1，WEI Jie1，ZHOU Luwei1，HE Jinlian1，WANG Q ianlong2，DU Leilei3（1.College of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China；2.Huzhou Center for Biological Resources Utilization and Innovation，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Zhejiang Huzhou 313000，China；3.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

OBJECTIVE：To establish the method for contents determ ination of catechins active components in lipid-lowering slimm ing health products.METHODS：HPLC method was adopted.Using epigallocatechin gallate（EGCG）as a reference，relative correction factor（RCF）of EGCG to gallocatechin（EGC），catechin（C），epicatechin（EC），gallocatechin gallate（GCG）and galloylepicatechin（ECG）were calculated.The contents of EGC，C，EC，GCG and ECG in 5 batches of samples were calculated through RCF.The contents of EGC，C，EC，GCG and ECG determ ined by external standard method were used asmeasured value. The sim ilarity of the value determ ined by external standard method w ith the value calculated by quantitative analysis ofmulti-components via single marker method（QAMS）was evaluated w ith vector included angle cosinemethod.RESULTS：The linear ranges of EGCG，EGC，C，EC，GCG and ECG were 0.006 5-0.130 5 mg/m L（r＝0.999 8）、0.000 5-0.010 7 mg/m L（r＝0.999 7）、0.002 0-0.040 0 mg/m L（r＝0.999 9）、0.015 3-0.305 3 mg/m L（r＝0.999 8）、0.000 8-0.015 5 mg/m L（r＝0.999 8）、0.004 0-0.079 2 mg/m L（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility testswere all lower than 2.0%.The recoverieswere 95.07%-100.35%（RSD＝1.94%，n＝6）、95.24%-101.87%（RSD＝2.79%，n＝6）、96.08%-103.86%（RSD＝3.01%，n＝6）、97.51%-101.06%（RSD＝1.45%，n＝6）、96.01%-101.66%（RSD＝2.27%，n＝6）、96.20%-102.89%（RSD＝2.71%，n＝6），respectively.There was no significant difference between measured value and calculated value.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for contents determ ination of catechinsactive components in lipid-lowering slimm ing health products.

Sli mm ing；Health products；Catechins；Quantitative analysis ofmulti-components via singlemarkermethod；HPLC

R 917

A

1001-0408（2017）18-2529-04

2016-07-23

2016-10-08）

（編輯：張靜）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81503361）；四川省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.16ZA0299）

＊講師。研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。電話：028-62308658。E-mail：aggie-xj@163.com

#通信作者：講師。研究方向：天然藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：028-85224504。E-mail：934534055@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.18.23