斑石鯛卵鞭蟲病病原的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

付泉潔 范超 謝國駟 葉仕根 史成銀

摘要 [目的]對嚴(yán)重危害斑石鯛魚苗的卵鞭蟲病病原——渤海分離株（Bohai-1407 isolate）進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。[方法]設(shè)計(jì)4對特異性引物，應(yīng)用PCR方法克隆并測定渤海分離株的核糖體DNA（rDNA）序列；應(yīng)用Blast比對分析渤海分離株rDNA的結(jié)構(gòu)；依據(jù)rDNA序列，分別構(gòu)建10種胚溝科鞭毛蟲和19株眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株/克隆的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析渤海分離株的系統(tǒng)分類地位。[結(jié)果]擴(kuò)增出了渤海分離株的4個(gè)DNA片段，拼接出長度為6 530 bp的rDNA操縱子序列；該操縱子由74 bp的部分外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS）、1 813 bp的小亞基（SSU）、352 bp的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、159 bp的5.8S、698 bp的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）和3 388 bp的大亞基（LSU）串聯(lián)而成，3′端還有46 bp的部分非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（NTS）；渤海分離株與眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲寧德株（Ningde1412）的rDNA序列相似性高達(dá)99.5%；依據(jù)SSU序列建立了包含10種胚溝科鞭毛蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹，渤海分離株與世界各地分離到的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲聚類在一起，將其鑒定為眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲；依據(jù)ITS1和ITS2序列建立了包含19株眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹，渤海分離株與從美國弗羅里達(dá)鹽水池塘中分離到的墨西哥灣分離株FL_21（DQ490260.1）總是聚類在一起。[結(jié)論]斑石鯛卵鞭蟲病的病原——渤海分離株可以鑒定為眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲，該分離株與墨西哥灣分離株FL_21的親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞 斑石鯛；眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲；核糖體DNA；分子鑒定；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào) S941.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0135-06

Molecular Identification and Phylogenetic Analysis of a Pathogenic Dinoflagellate Isolated from Spotted Knifejaw （Oplegnathus puncatus）

FU Quan-jie1， 2， FAN Chao2， 3， XIE Guo-si2， SHI Cheng-yin2* et al

（1. College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian， Liaoning 116023；2. Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control， Ministry of Agriculture， Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao， Shandong 266071；3. College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract [Objective] A pathogenic dinoflagellate （the Bohai-1407 isolate） was isolated from diseased Oplegnathus puncatus. To perform molecular identification and phylogenetic analysis of the Bohai-1407 isolate. [Method] Four pair of specific PCR primers were used to amplify the ribosomal DNA （rDNA） fragments of the Bohai-1407 isolate. The rDNA fragments were cloned and sequenced. The sequences of cloned rDNA fragments were assembled and then analyzed by Blast. The systematic taxonomy of the Bohai-1407 isolate was analyzed by constructed phylogenetic trees based on the rDNA sequences of 10 dinoflagellates in family Blastodiniidae and the rDNA sequences of 19 isolates/clones in species Amyloodinium ocellatum. [Result] Four ribosomal DNA （rDNA） fragments of the Bohai-1407 isolate were amplified. Sequence analysis showed that the sequenced rDNA operon were 6 530 bp in length. The rDNA operon was composed of 74 bp of partial external transcribed spacer （ETS）， 1 813 bp of 18S （also called small subunit， SSU）， 352 bp of internal transcribed spacers 1 （ITS1）， 159 bp of 5.8S， 698 bp of internal transcribed spacers 2 （ITS2） and 3388 bp of 23S （also called large subunit， LSU）， followed by a 46 bp of partial non-transcribed spacer （NTS） in the 3 end. The sequence identity between the Baohai-1407 isolate and the Ningde1412 strain of A. ocellatum was as high as 99.5%. Based on the SSU sequence of 10 dinoflagellates in family Blastodiniidae， a phylogenetic tree was constructed and the Bohai-1407 isolate clustered with isolates of A. ocellatum. Two phylogenetic trees based on the ITS1 and ITS2 sequences of 19 isolates/clones in species A. ocellatum were also constructed. The Bohai-1407 isolate always clustered with the Gulf of Mexico isolate FL_21 （DQ490260.1）. [Conclusion] The pathogenic dinoflagellate （the Bohai-1407 isolate） isolated from diseased O. puncatus was A. ocellatum according to the molecular identification results of rDNA. The Bohai-1407 isolate was most closely related to the Gulf of Mexico isolate FL_21 of A. ocellatum.

Key words Oplegnathus puncatus；Amyloodinium ocellatum；rDNA；Molecular identification；Phylogenetic analysis

斑石鯛（Oplegnathus puncatus）是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海水魚類，其抗逆性強(qiáng)，生長迅速，營養(yǎng)價(jià)值高，具有良好的發(fā)展前景。2014年斑石鯛的規(guī)模化人工繁育在我國獲得成功。因養(yǎng)殖時(shí)間較短，目前國內(nèi)對其病害的報(bào)道較少。2014年夏季在山東某斑石鯛育苗場，多個(gè)養(yǎng)殖池的斑石鯛幼魚突然發(fā)病，3 d之內(nèi)全部死亡。通過病理切片、病原形態(tài)的光鏡和電鏡觀察，初步判斷該病為斑石鯛卵鞭蟲病[1]，其病原為眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲，命名為渤海分離株（Bohai-1407 isolate）。

眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲（Amyloodinium ocellatum）有時(shí)也被稱為淀粉卵甲藻，是一種鞭毛蟲類的原生動(dòng)物，在動(dòng)物分類系統(tǒng)中屬于植鞭綱（Phytomastigophora）腰鞭目（Dinoflagellida）胚溝科（Blastodiniidae）。眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲是常見的魚類寄生蟲之一，能導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類大量死亡，是重要的海洋魚類病原之一[2]。其生活史包括3個(gè)階段：營養(yǎng)體階段、分裂前體階段、渦孢子階段。營養(yǎng)體用假根狀的凸起附著在魚體的鰓和皮膚上[3]。環(huán)境條件適宜時(shí)，該寄生蟲可快速分裂繁殖，幾天內(nèi)即可造成養(yǎng)殖及觀賞魚大量死亡[4-7]。該寄生蟲分布范圍廣，在太平洋、大西洋、墨西哥灣、紅海、地中海等海域均有發(fā)現(xiàn)；其宿主范圍廣泛，可感染20多種經(jīng)濟(jì)魚類[8]。

對病原進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，是有效控制寄生蟲病的前提。鑒定卵渦鞭蟲的傳統(tǒng)方法是通過光鏡或電鏡觀察，依據(jù)渦孢子的形態(tài)特征或甲殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷，但這種方法準(zhǔn)確性不高。近年來，許多學(xué)者開始通過分子系統(tǒng)發(fā)育分析對鞭毛蟲進(jìn)行分類鑒定[9-10]。核糖體RNA是核糖體的重要組分，具有關(guān)鍵的生物學(xué)功能，由位于染色體上的核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）編碼。在真核生物基因組中，18S、5.8S和28S rDNA串聯(lián)在一起，中間被2個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）隔開。18S rDNA也被稱為小亞基rDNA（small subunit rDNA，SSU rDNA），28S rDNA也被稱為大亞基rDNA（large subunit rDNA，LSU rDNA）。SSU rDNA已被廣泛用于鞭毛蟲物種間的分類鑒定，而ITS通常被用于物種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育分析[9-11]。

國內(nèi)關(guān)于眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲的研究較少，且多集中在防治方面[12-15]，對該病原的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析缺乏研究。該研究針對感染斑石鯛的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲渤海分離株，測定了其rDNA的序列，依據(jù)SSU和ITS序列對其分類地位進(jìn)行了分子鑒定，探討了眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲各分離株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

取病癥嚴(yán)重的瀕死病魚魚苗，放在培養(yǎng)皿中。用無菌海水輕輕洗脫魚鰓上附著的寄生蟲營養(yǎng)體，使?fàn)I養(yǎng)體脫落至水中并沉淀。用吸管反復(fù)輕輕吸除水中的雜質(zhì)，直至用顯微鏡觀察幾乎看不到雜質(zhì)。轉(zhuǎn)移底部的營養(yǎng)體至含無菌海水的培養(yǎng)皿中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至分裂后期加入70%乙醇于-20 ℃保存?zhèn)溆肹1]。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲的rDNA序列設(shè)計(jì)4對PCR引物，引物序列見表1。4對引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物前后銜接且有部分重疊，最后可以拼接成完整的rDNA序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 渤海分離株DNA的提取與rDNA的PCR擴(kuò)增

取保存的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲，用天根生化科技（北京）有限公司的海洋生物組織DNA提取試劑盒制備PCR模版，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。采用50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×Taq Buffer 5 μL，5 U/μL 的Taq DNA聚合酶0.25 μL，2 mmol/L的dNTP Mix 4 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，DNA模板1.5 μL，加ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取產(chǎn)物10 μL，用2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果并拍照。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、測序和序列分析

使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的pEASY-T5 Zero Cloning Kit試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將陽性克隆菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，用DNAMAN 8軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，用Blast程序?qū)ζ唇拥男蛄性诰€分析和序列比對。

1.5 眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

從GenBank中下載有代表性的9種胚溝科鞭毛蟲的SSU序列，與拼接后得到的渤海分離株SSU序列一起（表2），用Mega 6.0軟件構(gòu)建最大可能性法（Maximum Likelihood）系統(tǒng)發(fā)育樹，分析渤海分離株在胚溝科鞭毛蟲中的分類地位。從GenBank中下載18個(gè)眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株/克隆的ITS序列，與拼接后得到的渤海分離株ITS序列一起（表3），用Mega 6.0軟件構(gòu)建最大可能性法系統(tǒng)發(fā)育樹，分析渤海分離株與眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲各分離株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 渤海分離株rDNA的PCR擴(kuò)增

使用該研究設(shè)計(jì)的4對PCR引物，成功地從渤海分離株的DNA樣品中擴(kuò)增出4段產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，引物對AO-231F/AO-2934R的PCR產(chǎn)物大小約為2.7 kb，引物對AO-2874F/AO-4961R的PCR產(chǎn)物大小約為2.1 kb，引物對AO-SSU-F/AO-SSU-R的PCR產(chǎn)物大小約為1.4 kb，引物對AO-LSU-F/AO-LSU-R的PCR產(chǎn)物大小約為17 kb（圖1），均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。

2.2 渤海分離株rDNA的序列分析

將挑選出的陽性克隆進(jìn)行序列測定，對測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，得到長度為6 530 bp的渤海分離株rDNA序列。分析發(fā)現(xiàn)，該序列包含了完整的18S、5.8S、28S rDNA操縱子，由74 bp的部分外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（extra transcribed sequence，ETS），1 813 bp的SSU（18S rDNA），352 bp的ITS1，159 bp的5.8S rDNA，698 bp的ITS2和3 388 bp的LSU（23S rDNA）依次串聯(lián)而成，在3′端還含有46 bp的部分非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（non-transcribed spacer，NTS）（圖2）。通過Blast比對這一段6 530 bp的序列，發(fā)現(xiàn)渤海分離株（Bohai-1407 isolate）與眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲寧德株（Ningde1412）的序列相似性為99.5%。

2.3 眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析

依據(jù)SSU序列構(gòu)建的10種胚溝科鞭毛蟲系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3?？梢钥闯觯澈７蛛x株（Bohai-1407 isolate）與眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲各分離株聚類在一起，與胚溝科其他鞭毛蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此可以將渤海分離株鑒定為眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲。該發(fā)育樹還顯示，渤海分離株作為一個(gè)單獨(dú)的分支，與其他眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株所在的分支區(qū)別開來。這意味著與其他眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株相比，渤海分離株的獨(dú)特性更強(qiáng)。

由于SSU序列變異很小，不適合用于眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲各分離株的種內(nèi)分析。因此，該研究依據(jù)變異性相對較高的ITS1和ITS2序列，分別構(gòu)建了包含19個(gè)眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株/克隆的系統(tǒng)發(fā)育樹。

根據(jù)ITS1序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。圖中顯示，19個(gè)眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株/克隆聚類為2個(gè)大的分支A和B。大分支A由13個(gè)分離株/克隆組成，包含渤海分離株（Bohai-1407）、寧德株（Ningde1412）、1個(gè)DC-1克?。ˋocITSC 15）、4個(gè)紅?？寺。≧ed Sea 2-1、2-5、2-6、2-7）、1個(gè)墨西哥灣克隆（FL_21）、2個(gè)亞得里亞海克?。ˋdriatic Sea 3-4、3-7）、3個(gè)地中海克?。∕editerranean Sea 1-4、2-4、3-1）。渤海分離株與從美國弗羅里達(dá)鹽水池塘分離到的1個(gè)墨西哥灣克?。‵L_21）親緣關(guān)系最近，在大分支A中又聚類為一個(gè)小的分支。大分支B由6個(gè)克隆組成，包含3個(gè)DC-1克?。ˋocITSC 6-10-13、3-8-11、18）、1個(gè)墨西哥灣克?。‵L_16）、1個(gè)亞得里亞?？寺。ˋdriatic Sea 3-2）和1個(gè)地中?？寺。∕editerranean Sea 2-1）。

根據(jù)ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。圖中顯示，19個(gè)眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲分離株/克隆也聚類為2個(gè)大的分支A和B。大分支A由10個(gè)分離株/克隆組成，包含寧德株（Ningde1412）、4個(gè)紅海克?。≧ed Sea 2-1、2-5、2-6、2-7）、2個(gè)亞得里亞?？寺。ˋdriatic Sea 3-4、3-7）、3個(gè)地中海克?。∕editerranean Sea 1-4、2-4、3-1）。大分支B由9個(gè)克隆組成，包含渤海分離株（Bohai-1407）、4個(gè)DC-1克?。ˋocITSC 6-10-13、3-8-11、15、18）、2個(gè)墨西哥灣克?。‵L_16、21）、1個(gè)亞得里亞海克?。ˋdriatic Sea 3-2）和1個(gè)地中海克?。∕editerranean Sea 2-1）。渤海分離株與從美國弗羅里達(dá)鹽水池塘分離到的1個(gè)墨西哥灣克隆（FL_21）親緣關(guān)系最近，在大分支B中又聚類為一個(gè)小的分支。

在上述2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中，渤海分離株總是與墨西哥灣株FL_21聚成一個(gè)小的分支，表明該渤海分離株與墨西哥灣分離株FL_21的親緣關(guān)系最近。但這個(gè)小分支在2個(gè)樹中的相對位置不同，分別處于不同的大分支上。此外還有1個(gè)DC-1克?。ˋocITSC 15）在2個(gè)樹中的相對位置也不同，分別處于不同的大分支上。除上述3個(gè)分離株/克隆之外，其余的各分離株/克隆在2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中，均處于相同的大分支上，可以明顯區(qū)分為2個(gè)大的類群。

3 討論與結(jié)論

卵鞭蟲病是一種在全球范圍內(nèi)廣泛流行的魚類寄生蟲病，對魚苗的致死率高，危害嚴(yán)重。該研究針對新發(fā)現(xiàn)的斑石鯛卵鞭蟲病，測定了其病原的rDNA序列，應(yīng)用生物信息學(xué)方法對病原進(jìn)行了分子鑒定，確認(rèn)其病原是眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲。該研究結(jié)果為有效控制斑石鯛卵鞭蟲病提供了重要依據(jù)。

真核生物的rDNA已被廣泛應(yīng)用于物種的分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[10，16]，眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲的rDNA序列也已成為病原分子鑒定的重要依據(jù)[9，11]。在GenBank中已公開了眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲10余個(gè)分離株/克隆的rDNA序列20余條。然而，除感染大黃魚的寧德株（Ningde1412，KU761581.1）外，絕大多數(shù)分離株/克隆的rDNA序列是不足2 000 bp的短序列，未涵蓋完整的SSU和LSU序列。該研究測定了渤海分離株（Bohai-1407 isolate）的rDNA序列，長度達(dá)6 530 bp。該序列涵蓋了渤海分離株完整的SSU、ITS1、5.8S、ITS2和LSU序列，為深入研究眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲rDNA的變異提供了參考資料。

比對眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲渤海分離株與寧德株的rDNA序列，二者的相似性高達(dá)99.5%，這表明感染斑石鯛的渤海分離株和感染大黃魚的寧德株是同一種寄生蟲。依據(jù)10種胚溝科鞭毛蟲SSU序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示，渤海分離株與世界各地分離到的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲聚類在一起。因此，斑石鯛卵鞭蟲病的病原可以鑒定為眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲。

與SSU、5.8S和LSU相比，rDNA中的ITS面對較小的選擇壓力，因此序列變異更大。在該研究測定的6 350 bp的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲rDNA序列中，渤海分離株與寧德株在34個(gè)位點(diǎn)處存在差異，ITS1和ITS2分別占10個(gè)和16個(gè)。因此，ITS更適用于眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育分析[18-19]。該研究依據(jù)眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲ITS1和ITS2序列構(gòu)建的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹，其形態(tài)基本相同。來自世界不同地域的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲19個(gè)分離株/克隆，分別處于2個(gè)大的分支上，即可以明顯區(qū)分為2個(gè)大的類群。但另一方面，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示，來自同一地域的不同分離株/克隆分散于不同的大類群中。上述研究結(jié)果與此前文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致[10-11]。這意味著ITS1和ITS2序列反映的眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲種內(nèi)變異與寄生蟲的分離地域關(guān)系不大。值得注意的是，在依據(jù)ITS1和ITS2構(gòu)建的2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹中，渤海分離株總是與墨西哥灣株FL_21聚成一個(gè)小的分支。但這個(gè)小分支在2個(gè)樹中的相對位置不同，分別處于不同的大分支上。造成這種現(xiàn)象的原因，還有待進(jìn)一步探討。

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