ITS2序列分析在白花蛇舌草鑒定中的應用研究

陳怡君++++++郭曉輝++++++高芳雪++++++王愛華++++++李鋆++++++李外++++++劉萍

[摘要] 目的 對白花蛇舌草和它的混偽品進行分子生物鑒定，保證該藥材的臨床藥效和使用安全。 方法 提取白花蛇舌草及其混偽品的DNA，使用引物進行PCR擴增，獲取ITS2序列的片段，將擴增得到的產物進行雙向測序，運用Condon Code Aligner軟件進行校對拼接，去除低質量區(qū)。用HMMer注釋法保留ITS2序列全長。運用MEGA 5.1軟件對真?zhèn)纹沸蛄羞M行分析，計算真?zhèn)纹返倪z傳距離，構建鄰接（NJ）樹評估真?zhèn)纹分g的親緣關系。采用ITS2數(shù)據(jù)庫預測ITS2二級結構。 結果 白花蛇舌草與混偽品的ITS2序列存在明顯差異。 結論 運用ITS2序列能準確有效鑒別出白花蛇舌草和混淆品。

[關鍵詞] 白花蛇舌草；混偽品；ITS2；分子鑒定

[中圖分類號] R282.12 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0021-04

[Abstract] Objective To ensure the clinical efficacy and safety of Hedyotis diffusa， identify Hedyotis diffusa and its mix adulterants by molecular biological assay. Methods The polymerase chain reaction （PCR） technique which used DNA templates of Hedyotis diffusa and its mix adulterants and ITS2 sequence primers was performed to obtain the ITS2 regions. The amplification products were sequenced bi-directionally. Sequences were assembled by the CodonCode Aligner. ITS2 sequences of plants were obtained integrally by HMMer annotation method and analyzed by MEGA5.1 to calculate genetic distance among Hedyotis diffusa and its mix adulterants. The neighbor-joining （NJ） phylogenetic tree was constructed to evaluate genetic relationship of plants. ITS2 secondary structures were predicted by ITS2 database. Results There was distinct difference on ITS2 sequences between Hedyotis diffusa and its adulterants. Conclusion ITS2 sequence can be used as a effective marker for identifying Hedyotis diffusa and its adulterants.

[Key words] Hedyotis diffusa； Adulterants； ITS2； Molecular identification

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Oldenlandia diffusa）的全草，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛的功效[1]。由于白花蛇舌草在癌癥的治療中效果確切[2]，需求劇增，使其生藥資源日見貧乏，而出現(xiàn)較多混偽品。常見混偽品傘房花耳草、纖花耳草、松葉耳草等與白花蛇舌草同科屬，僅根據(jù)植物外在特點難以鑒別，經常會被當成是白花蛇舌草用于臨床[3-7]。還有商家為了增加利益，摻雜其他不同科屬的漆姑草（石竹科漆姑草屬）、舌雀草（石竹科繁縷屬）在白花蛇舌草中，導致白花蛇舌草的質量下降[8-9]。為保證白花蛇舌草的用藥安全和療效確切，它的準確鑒別是目前一項十分緊迫的任務。近年來，DNA條形碼研究在物種鑒定和植物分類領域體現(xiàn)出較高的準確率，成為熱點研究方向[10-11]。此項技術的核心在于通過比較一段通用DNA序列，對物種在基因水平進行鑒定和高效識別，同傳統(tǒng)的顯微鑒別、理化鑒別、色譜鑒別相比較，DNA條形碼技術重復性好、穩(wěn)定、快速、準確，更為重要的是它深入到分子水平，反映了物種的遺傳特性，這種鑒別方式更加可靠[12-13]。有學者對多種植物樣本進行研究后，提出將DNA條形碼之一的ITS2序列用于植物鑒定的標準序列[14-16]。ITS2因其長度較短，擴增效率高，不同的物種突變位點多，表現(xiàn)出較高的物種分辨率，很適合用于植物鑒定[17-18]。

本研究以白花蛇舌草藥材及纖花耳草、松葉耳草、傘房花耳草、漆姑草、雀舌草等混偽品作為研究對象獲得ITS2序列，穩(wěn)定、準確地鑒別白花蛇舌草藥材及其混偽品，為保障該藥材品種的臨床療效提供了新的鑒定技術手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（CW0531，北京康為世紀生物科技有限公司）；2×Es Taq MasterMix（康為世紀生物科技有限公司）；引物（華大基因科技有限公司合成）；VeritiTM96 PCR儀（杭州博日科技有限公司）；電泳儀（DYY-8C，北京白晶生物科技有限公司）；核酸/蛋白質凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（GSG-2000，中國珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）；DNA分析儀（3730xl，Applied Biosystems）。

1.2 植物材料

材料信息見表1，包括實驗樣品及GenBank下載序列，其中，白花蛇舌草和混偽品實驗樣品采自海南、蘇州、廣東等地，由解放軍總醫(yī)院劉萍主任藥師鑒定，憑證標本保存于解放軍總醫(yī)院海南分院藥劑科中藥標本室。

1.3 植物DNA提取、PCR擴增和測序

將白花蛇舌草和3種混偽品的干燥植物分別用研缽碾成粉末，各取30 mg置離心管中，按照試劑盒說明書提取DNA。收集DNA溶液，-20℃冰箱保存。正向引物為ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'，反向引物為ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'[19]。PCR反應體系包括25 μL 2×ES Taq Master Mix，2 μL正向引物ITS2F，2 μL反向引物ITS3R，9 μL超純水，12 μL模板（基因組DNA），體系配制共為50 μL。使用PCR儀進行擴增，擴增程序：Step1：94℃變性5 min；Step2：94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s（進行40個循環(huán)）；Step3：72℃延伸10 min。PCR產物在0.7%的瓊脂糖凝膠上電泳跑膠，獲得單一條帶后，將PCR產物送至華大基因貿易有限公司利用DNA分析儀進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Codon Code Aligner 6.02（Condon Code Co.，USA）對測序峰圖進行校對拼接，除去序列兩側低質量區(qū)和切除引物。對GenBank下載的和拼接后得到的ITS2序列用HMMer注釋法切5.8 S和28 S端，保留ITS2的全長[20]。然后用軟件MEGA 5.1比較序列變異，計算遺傳距離和構建鄰接（NJ）樹。采用Koetschan等[21]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫預測ITS2二級結構。

2 結果

2.1 序列峰圖

白花蛇舌草（憑證標本號BHS15101）的ITS2序列測序峰見圖1，序列長度為214 bp，其中質量為QV≥20的堿基為214 bp，質量較好，沒有含PolyA（≥5個單堿基重復）和PolyT結構，CG含量為65.9%。

2.2 白花蛇舌草種內序列比對

3條白花蛇舌草ITS2序列，比對后序列長度均為214 bp，GC含量為65.9%～66.8%，均值為66.37%。有2處單堿基變異，為73位點處T-C變異和173位點處T-G變異，白花蛇舌草種內ITS2序列的平均K2P距離為0.0063，最大的K2P距離為0.0094。

2.3 白花蛇舌草與其混淆品序列比對

本實驗白花蛇舌草與其混淆品共15個樣品的ITS2序列的長度范圍為213～223 bp，GC含量范圍為57.7%～69.0%。所有樣品ITS2序列比對后長度為251 bp，其中變異位點為131個，信息位點為107個。白花蛇舌草種內及種間K2P距離見表2。

從表中可以看出白花蛇舌草與同科屬的傘房花耳草、纖花耳草和松葉耳草的種間K2P距離平均值為0.2110，最大K2P距離為0.2784，變異相對較小，其中白花蛇舌草與纖花耳草的遺傳距離最近，最大K2P距離為0.1453；而白花蛇舌草與不同科屬的混偽品雀舌草和漆姑草種間K2P距離平均值為0.6127，最小K2P距離為0.5506，變異較大。

2.4 白花蛇舌草與其混偽品的鄰接樹

從構建的NJ樹可以看出，來自不同序列的白花蛇舌草聚為一支。同一科屬的白花蛇舌草、傘房花耳草、纖花耳草、松葉耳草聚在一起，其中白花蛇舌草與纖花耳草、松葉耳草親緣關系比較近，與纖花耳草最近，與遺傳距離的計算結果相一致，傘房花耳草獨立為一支。不同科屬的石竹科雀舌草和漆姑草獨立聚為一支。見圖2。

2.5 ITS2序列二級結構分析

白花蛇舌草與其混淆品的二級結構見圖3，可以看出，白花蛇舌草與其5個混淆品在二級結構上有明顯的差異。主要差異存在于螺旋Ⅰ和螺旋Ⅲ，還有基部的角度不同。白花蛇舌草二級結構螺旋Ⅰ區(qū)存在5個環(huán)，其中間有個大頸環(huán)。白花蛇舌草二級結構螺旋Ⅰ區(qū)、Ⅲ區(qū)莖環(huán)數(shù)量、大小和位置與其他混淆品也存在明顯不同。白花蛇舌草二級結構螺旋Ⅲ和螺旋Ⅳ區(qū)的夾角與傘房花耳草、松葉耳草、漆姑草、雀舌草的夾角也不同?？v觀在這種結構差異上，傘房花耳草、漆姑草、雀舌草比松葉耳草、纖花耳草表現(xiàn)更明顯，這種親緣關系的遠近與NJ樹的結果一致。說明白花蛇舌草與混偽品在ITS2序列二級結構上存在差異。

3 討論

本實驗研究了正品的白花蛇舌草與外形相似的混淆品傘房花耳草、纖花耳草、松葉耳草、雀舌草、漆姑草在ITS2序列上的差異，結果顯示這種差異不僅體現(xiàn)在ITS2序列堿基種類、數(shù)量上，更體現(xiàn)在ITS2序列科屬差異大小和二級結構上。

白花蛇舌草的種內變異位點和遺傳距離明顯少于種間變異位點和遺傳距離。而在種間遺傳距離中，白花蛇舌草與同科屬混淆品的遺傳距離小于與不同科屬的遺傳距離。同樣在構建的NJ樹中，同科屬的白花蛇舌草、纖花耳草、傘房花耳草、松葉耳草聚在一起，不同科屬的漆姑草、雀舌草獨立聚為一支。這些結果表明，利用ITS2序列不僅能成功地將白花蛇舌草與其混偽品區(qū)分開，還證明了ITS2序列在同科屬植物間的差異是明顯小于不同科屬植物間差異的。耿超等[22]的建澤瀉鑒定研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，通過遺傳距離和構建的NJ樹發(fā)現(xiàn)建澤瀉與澤瀉科澤瀉屬物種距離較近，與澤瀉科其他屬及其混偽品之間遺傳距離較遠。這些研究進一步力證了ITS2序列在物種間突變位點多，表現(xiàn)出較高的分辨率。

本文還進行了ITS2序列二級結構分析，結果顯示白花蛇舌草與傘房花耳草、漆姑草、雀舌草ITS2序列結構上的差異比與松葉耳草、纖花耳草結構差異表現(xiàn)更明顯，且這種親緣關系的遠近與NJ樹的結果一致。說明ITS2序列二級結構的差異也可成為白花蛇舌草鑒別點之一。雖然高婷等[23]的藤梨根分子鑒定證明了藤梨根與其常見混偽品的ITS2二級結構也存在明顯差異，但未就科屬間的細致差異進行深入探索。

從遺傳距離、構建的NJ樹以及ITS2序列二級結構的結果發(fā)現(xiàn)，纖花耳草和白花蛇舌草的親緣關系最近，這就表明白花蛇舌草中很容易摻雜纖花耳草，二者有效成分和功效上的差異還有待研究。

本文對于ITS2序列能否用于白花蛇舌草鑒定做了細致精準的探索，結果表明ITS2序列在白花蛇舌草和混偽品間種間變異大，分辨率高，因此利用其堿基和結構上的差異能夠快速、準確鑒別出白花蛇舌草和它的混偽品。ITS2序列在中藥材鑒定中具有很大的應用價值。

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