水稻抗稻瘟病基因Pi25、Pi56（t）、Pit和Pita的分子鑒定

梅文強劉佩釬+洪博文+穆?lián)Q青+秋丙子+沙愛華+郭嗣斌

摘要：根據(jù)抗病基因在抗病材料和感病材料中的SNP位點設(shè)計引物，通過PCR擴增或CAPS標(biāo)記，對16份水稻材料中的4個抗病基因Pi25、Pi56（t）、Pit和Pita進行了鑒定。結(jié)果表明，9份水稻材料中攜帶Pi25，6份材料中攜帶Pita，1份材料中攜帶Pit（雜合型），無材料攜帶Pi56（t）。

關(guān)鍵詞：稻瘟病；抗病基因；分子鑒定

中圖分類號：S338 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6604-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.070

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一種世界性的稻作病害，在世界各個水稻生產(chǎn)國每年都有不同程度的發(fā)生[1]，每年因稻瘟病導(dǎo)致的生產(chǎn)損失約占總產(chǎn)量的10%～15%[2]。稻瘟菌小種具有高度的變異性，隨著抗性基因的持續(xù)利用，病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)會不斷發(fā)生變化，出現(xiàn)新的生理小種，從而導(dǎo)致小種?；剐詥适В鄶?shù)抗性品種在種植幾年后會逐漸喪失抗病性[3]。因此，鑒定和發(fā)掘新的抗病基因是有效解決稻瘟病的新途徑。

隨著水稻品種稻瘟病抗性基因的不斷鑒定，截至2014年，在不同的稻種資源中鑒定的稻瘟病主效抗病基因超過86個，微效基因（Quantitative trait loci，QTL）約350個[4，5]，分布于水稻的12條染色體。這些已鑒定的稻瘟病抗性基因絕大部分都是顯性的，其中45%來源于粳稻，51%來源于秈稻，剩下4%來源于野生稻[6，7]。雖然通過發(fā)掘和鑒定抗病基因能夠使水稻品種對稻瘟病的抗性不斷增強，但由于稻瘟菌生理小種的高度變異性，所以有必要鑒定更多的稻瘟病抗性基因，并將這些抗病基因進行聚合。

現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使得研究者可以采用方便快捷的方法鑒定植物材料中是否存在抗病基因，如單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）和酶切擴增多態(tài)性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）。SNP的原理是兩條相鄰的寡核苷酸與模板退火，只有當(dāng)其在接合處與模板完全匹配時才會在聚合酶的作用進行擴增，因而等位基因特異性寡核苷酸能夠探察多態(tài)性位點堿基的性質(zhì)[8]。CAPS原理在于不同的單核苷酸多態(tài)性序列對應(yīng)著不同的限制性核酸內(nèi)切酶（RE）識別和切割不同位點，稻瘟病抗病基因和感病基因之間SNP的差異導(dǎo)致RE切割得到不同大小的片段，由此可以判斷水稻材料的抗或感病性[9]。

本研究選擇16份部分?jǐn)y帶有稻瘟病抗病基因Pi1、Pi2、Pi9、Pi24、Pi25的水稻材料，采用PCR方法或CAPS標(biāo)記鑒定這些材料中是否還含有新的抗病基因Pi25、Pi56（t）、Pit、Pita，以便拓寬這些材料在稻瘟病抗病育種中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的16份水稻材料，編號為505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、谷梅2號、三黃占。已知510、511和512攜帶Pi1，513和514攜帶Pi2，505、509、517和518攜帶Pi9，谷梅2號攜帶Pi24、Pi25，其他材料抗病基因未知。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 以文獻[10]報道的編號為ta5和t256引物對檢測Pit和Pit（a）基因。其中敏感引物對序列分別為ta5-SF/R和t256-SF/R，抗性引物對序列為ta5-RF/R和t256-RF/R。檢測Pi56（t）的引物對分別為CRG4-1F/R、CRG4-3F/R，采用文獻[9]報道的引物序列。檢測Pi25的引物對為CAP1F/R，采用文獻[11]報道的引物序列。引物序列信息見表1。

1.2.2 基因組DNA提取、PCR擴增及酶切 用CTAB法提取水稻基因組DNA，1%的瓊脂糖凝膠檢測水稻基因組DNA。CAP1、CRG4、t256、ta5 4對引物的PCR擴增體系均為：2 μL DNA模板、0.5 U Taq聚合酶、2 μL 10×PCR緩沖液、1.6 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL正向引物（10 μmol/L）和0.5 μL反向引物（10 μmol/L），ddH2O補足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。CRG4、t256和ta5引物的PCR擴增產(chǎn)物直接取10 μL在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。取10 μL CAP1 PCR擴增產(chǎn)物加入2 μL酶切緩沖液，1 μL HincⅡ限制性內(nèi)切酶，補ddH2O 7 μL至20 μL體系，37 ℃酶切4 h后，取10 μL酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi25基因的檢測

CAP1引物PCR擴增產(chǎn)物片段大小為406 bp。PCR產(chǎn)物用HincⅡ酶切，抗病基因位點可以切開，而感病基因位點無法切開。根據(jù)酶切產(chǎn)物的帶型，就可以確定是否攜帶有Pi25抗病基因。從圖1可以看出，16份水稻材料中508、516、517、518 4份材料PCR產(chǎn)物可以被HincⅡ酶切成小片段，另外，509、510、514、515、谷梅2號PCR產(chǎn)物也可以被HincⅡ識別酶切，因此這9份材料中攜帶有Pi25抗病基因（表2）。

2.2 Pi56基因的檢測

通過兩對引物組合CRG4-1和CRG4-3鑒定Pi56抗病和感病基因型。CRG4-1引物組合PCR擴增出2 kb產(chǎn)物為抗病基因型，擴增出1 521 bp為感病基因型。CRG4-3引物組合無PCR擴增產(chǎn)物為抗病基因型，擴增出725 bp為感病基因型。兩對引物必須組合相互印證，才能確定是否為抗病基因型或感病基因型。從圖2中可以看出，有的材料擴增出1 521 bp片段，有的擴增出725 bp片段，沒有同時滿足既擴增出2 kb片段又無725 bp片段的材料，故未從16份水稻材料中鑒定出Pi56（t）抗病基因型（表2）。

2.3 Pit基因的檢測

通過t256抗病引物組合t256-R/RF和感病引物組合t256-R/SF對16份水稻材料進行Pit基因的鑒定，根據(jù)對應(yīng)于抗病基因位點或感病位點基因引物擴增的相應(yīng)片段，就可以確定是否攜帶有Pit抗病基因。由圖3可以看出，16份水稻材料中僅有516中用抗病引物組合擴增出322 bp片段，但同時感病引物組合也擴增出322 bp片段（泳道17、18），故516中攜帶Pit雜合基因，其余材料均不含抗病基因（表2）。

2.4 Pita基因的檢測

通過ta5抗病引物組合ta5-R/RF和感病引物組合ta5-R/SF對16份水稻材料進行Pita基因的鑒定，根據(jù)對應(yīng)于抗病基因位點或感病位點基因引物擴增的相應(yīng)片段，就可以確定是否攜帶有Pita抗病基因。16份材料中509、510、511、514、516和517中僅抗病引物組合可以擴增出515 bp片段（圖4），為攜帶純合抗病基因型，其余材料中有些僅感病基因型引物可以擴增出產(chǎn)物，有些感病基因型引物和抗病基因型引物均能擴增，但抗病基因型引物擴增較弱，可能為雜合型或非特異性擴增，將這些材料都記為非抗病基因型（表2）。

3 小結(jié)與討論

稻瘟病在世界范圍內(nèi)對水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害的病害，控制稻瘟病較好的方法是發(fā)掘廣譜稻瘟病抗性基因或主效QTL，通過聚合育種，得到廣譜持久抗病的水稻品種[11]，因此，抗性基因分析以及抗源篩選就顯得尤為重要[12-15]。本研究通過對16份水稻材料進行抗病基因的基因型分型和鑒定，確定了這16份材料是否攜帶抗病基因以及抗病基因的類型。

4個基因的引物中，用來檢測Pi25的CAPS標(biāo)記和用于檢測Pit的引物t256擴增效果較好，能清晰地鑒別抗病基因型和感病基因型。用于檢測 Pi56（t）的引物對CRG4-1和CRG4-3能準(zhǔn)確地判定感病基因型（2對引物分別擴增出1 521 bp和725 bp為感病基因型），但鑒別抗病基因型效果稍差（CRG4-1擴增得到2 kb產(chǎn)物而CRG4-3擴增無725 bp產(chǎn)物為抗病基因型），因為三黃占為抗病基因Pi56（t）的供體，用CRG4-1和CRG4-3引物對從三黃占中均未得到PCR擴增產(chǎn)物，不能判定其為抗病基因型，故用這兩對引物組合未能從16份材料中鑒定出抗病基因型。究其原因，可能與PCR擴增條件或其他一些未知因素影響有關(guān)。用于鑒別Pita的引物對ta5在本研究中效果也不太好，用此引物對除了能明確判定6份材料為攜帶純合抗病基因型外，因為一些非特異擴增的影響，導(dǎo)致其他一些材料無法判定為雜合抗病基因型或感病基因型。

利用4個抗病基因的引物組合成功地從16份水稻材料中鑒定出6份材料攜帶Pita抗病基因型、9份材料攜帶Pi25抗病基因型和1份材料攜帶Pit抗病基因。當(dāng)然，這些僅僅是從分子水平的初步鑒定結(jié)果，這些材料中的抗病基因是否發(fā)揮作用，還需要用相應(yīng)的稻瘟病菌生理小種接種后進一步鑒定。

參考文獻：

[1] DEANR A，TALBOT N J，EBBOLE D J，et al.The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthegrisea[J].Nature，2005，434：980-986.

[2] 孫國昌，杜新法，陶榮祥，等.水稻稻瘟病防治策略和21世紀(jì)研究進展[J].植物病理學(xué)報，1998，28（4）：289-292.

[3] 沈 瑛，朱培良，袁筱萍.中國稻瘟病菌的遺傳多樣性[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1993，23（3）：203-204.

[4] LIU Y，LIU B，ZHU X Y，et al.Fine-mapping and molecular marker development for Pi56（t），a NBS-LRR gene conferring broad-spectrum resistance to Magnaportheoryzae in rice[J].TheorAppl Genet，2013，126：985-998.

[5] BALLINI E，MOREL J，DROC G，et al. A genome-wide meta-anaiysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance[J].Molecular Plant-Microbe Interaction，2008，21（7）：859-868.

[6] 楊勤忠，林 菲，馮淑杰，等.水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1601-1615.

[7] SHARMA T R，RAI A K，GUPTA S K，et al.Rice blast management through host-plant resistance retrospect and prospect[J].Agricultural Research，2012，1（1）：37-52.

[8] 張 羽，張曉娟，楊鳳嬌，等.水稻稻瘟病抗性基因Pi-ta的SNP檢測方法[J].中國水稻科學(xué)，2013，27（3）：325-328

[9] 王惠梅，陳 潔，施勇烽，等.稻瘟病抗性基因Pi25特異性CAPS 標(biāo)記的開發(fā)與驗證[J].作物學(xué)報，2012，38（11）：1960-1968.

[10] HAYASHI K，YOSHIDA H，ASHIKAWA I. Development of PCR-based allele-specific and InDel marker sets for nine rice blast resistance genes[J].Theor Appl Genet，2006，113：251-260.

[11] 廖新華，梁 斌，王建軍，等.云南稻種抗稻瘟病品種資源的抗譜研究[J].植物病理學(xué)報，2000，30（1）：90.

[12] 杜曉宇，劉建國.南充市稻瘟病重發(fā)成因分析及治理對策研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（19）：151-152，155.

[13] 萬賢宗.宣州區(qū)2008年雜交中稻穗頸瘟流行原因淺析[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2009，15（1）：150-151.

[14] 楊健源，陳 深，曾列先，等.稻瘟病主效抗性基因?qū)V東省秈稻稻瘟病菌的抗性評價[J].中國水稻科學(xué)，2008，22（2）：190-196.

[15] 梁康逕，黃利興，游年順，等.水稻系列不育系對稻瘟病的抗性分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科版），2010，39（5）：449-454.