徐州四種市售食用菌的分子鑒定

胡揚(yáng)楠　張揚(yáng)　蘭慧芳　殷婷婷　蔣秋改　談思源　曾健康　溫洪宇

摘 要：本文通過擴(kuò)增食用菌的ITS序列對徐州市售雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇的分類學(xué)地位進(jìn)行了研究，將4種食用菌的ITS序列與Eztaxon數(shù)據(jù)庫中真菌模式菌株數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，選取親緣關(guān)系最近物種的ITS序列，采用Clustalx 1.8軟件和MEGA5.0軟件構(gòu)建分子發(fā)育樹。研究結(jié)果為雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇的ITS序列長度分別為677bp、672bp、605bp和643bp；4種食用菌與親緣關(guān)系最近物種構(gòu)建的分子發(fā)育樹表明，雙孢蘑菇與模式菌株Agaricus bisporus（登錄號：AJ133385）序列相似性為100%；香菇與模式菌株Lentinula edodes（登錄號：JQ797414）序列相似性為100%；杏鮑菇與模式菌株P(guān)leurotus ostreatus（登錄號：AB733143）序列相似性為100%；草菇與模式菌株Volvariella volvacea（登錄號：AY636049）序列相似性為99%。初步確定雙孢蘑菇為蘑菇屬的Agaricus bisporus；香菇為香菇屬的Lentinula edodes；杏鮑菇為側(cè)耳屬的Pleurotus ostreatus；草菇為小包腳菇屬的Volvariella volvacea。

關(guān)鍵詞：食用菌；ITS序列；分子鑒定

中圖分類號：S646 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160912001

我國食用菌種質(zhì)資源豐富，而傳統(tǒng)食用菌的分類鑒定主要是基于菌絲、孢子和子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征。真菌形態(tài)特征易受到培養(yǎng)條件的影響，許多子實(shí)體類型難以獲得，增加了分類鑒定的難度。真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，簡稱ITS）是位于真菌核糖體RNA上18S和28S基因之間的片段，其兩側(cè)分別是18S RNA基因和28S RNA基因[1]，長度一般為650～750bp。White等于1990年設(shè)計(jì)了ITS1、ITS4、ITS5 3對可用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌的特異性鑒定引物[2]，此后ITS序列分析技術(shù)在真菌分類和鑒定的研究中得到廣泛應(yīng)用。如李晶等采用形態(tài)學(xué)鑒定方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合將1種野生食用菌鑒定為金山巨菇（Tricholoma sp.）[3]，雷瓊等也采用同樣的方法將一種大型食用菌鑒定為硫磺菌（Laetiporus sulphureus）[4]。本研究通過市售食用菌子實(shí)體的形態(tài)特征進(jìn)行觀察，結(jié)合ITS 序列分析初步確定分類學(xué)地位，為食用菌種質(zhì)資源提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試雙孢蘑菇、香菇、杏鮑菇和草菇購自徐州市銅山新區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，編號分別為W1、W2、W3和W4。

1.2 子實(shí)體形態(tài)觀察

取完整子實(shí)體，觀察并描述菌蓋、菌褶和菌柄等。

1.3 DNA提取

將新鮮的子實(shí)體烘干后粉碎成粉末并過篩，儲存?zhèn)溆?。稱取適量樣品粉末，放入研缽中加入液氮碾磨充分破碎細(xì)胞，將碾磨碎粉轉(zhuǎn)入離心管中，樣品DNA的提取方法參照改進(jìn)的CTAB法[5]進(jìn)行。提取的總DNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增

采用通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -

3'）與ITS4（5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'）[2]擴(kuò)增食用菌的ITS序列。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min； 94℃變性40S，55℃退火45S，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4℃條件下保存。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產(chǎn)物的純化和測序

采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）從瓊脂糖凝膠電泳中回收DNA。具體步驟參照試劑盒說明。經(jīng)膠回收純化后的PCR產(chǎn)物送至南京斯普金生物科技有限公司完成測序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序所得W1，W2，W3，W4 4種食用菌的ITS序列與Eztaxon數(shù)據(jù)庫中真菌模式菌株數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，選取親緣關(guān)系最近物種的ITS序列，采用Clustalx 1.8軟件和MEGA5.0軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建分子發(fā)育樹[6]，重復(fù)取樣1000次[7] 。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體形態(tài)觀察

食用菌子實(shí)體形態(tài)見圖1，具體特征如下：

W1：菌蓋近半球形，白色，光滑；菌肉白色，厚；菌褶褐色至黑褐色，密，窄；菌柄近圓柱形，白色，光滑；具菌環(huán)，單層，膜質(zhì)。

W2：菌蓋扁平，邊緣內(nèi)卷，表面淺褐色至深褐色，邊緣常有毛狀或絮狀鱗片；菌肉白色，稍厚；菌褶白色，密；菌柄中生，白色，彎曲。

W3：菌蓋圓碟狀，淺褐色；菌褶延生，密集，乳白色；菌柄偏生，中實(shí)，棒狀，表面平滑，無菌環(huán)。

W4：菌蓋近鐘形，中部稍凸起且色深，邊緣完整；菌褶著生于菌蓋下方，稍密；菌柄著生于菌蓋下方中央，白色稍帶黃色。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于ITS基因序列，對W1，W2，W3，W4與親緣關(guān)系近的模式菌株進(jìn)行分子發(fā)育學(xué)分析，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。結(jié)果表明：W1與模式菌株Agaricus bisporus （登錄號：AJ133385）聚為一支，置信度為100%，ITS序列相似性為100%，初步確定食用菌W1為蘑菇屬的雙孢蘑菇Agaricus bisporus；W2與模式菌株Lentinula edodes（登錄號：JQ797414）聚為一支，置信度為100%，序列相似性為100%，初步確定食用菌W2為香菇屬的Lentinula edodes；W3與模式菌株P(guān)leurotus ostreatus（登錄號：AB733143）聚為一支，置信度為100%，序列相似性為100%，初步確定食用菌W3為側(cè)耳屬的Pleurotus ostreatus；W4與模式菌株Volvariella volvacea（登錄號：AY636049）聚為一支，置信度為100%，序列相似性為99%，初步確定食用菌W4為小包腳菇屬的Volvariella volvacea。

3 討論

食用菌具有較高的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和市場價(jià)值。本文4種食用菌均為徐州市場常見菌類，且具有種植技術(shù)成熟，菌體產(chǎn)量高等特點(diǎn)，有較高的食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。食用菌采收以后，組織柔嫩，含水量高，后熟作用強(qiáng)，容易變質(zhì)，不耐貯藏[8]，徐州地處江蘇北部，擁有便捷的交通運(yùn)輸業(yè)，使得市售食用菌的種類眾多，加之徐州食用菌種植歷史悠久，栽培經(jīng)驗(yàn)豐富，發(fā)展優(yōu)勢明顯[9]。加強(qiáng)食用菌種質(zhì)資源的鑒定和挖掘?qū)τ诎l(fā)展食用菌產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定具有易于觀察和比較優(yōu)勢，但其主要根據(jù)基因的表型進(jìn)行研究，缺乏多態(tài)性指標(biāo)，且容易受到多種因素的影響，尤其是地域分隔會造成食用菌種內(nèi)的形態(tài)多樣性較高的現(xiàn)象，給種和親緣種的鑒定帶來一定的難度和分歧[3]。本文結(jié)合ITS序列分析對常見菌進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明4種食用菌分別是蘑菇屬的雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），香菇屬的香菇（Lentinula edodes），側(cè)耳屬的杏鮑菇（Pleurotus ostreatu），小包腳菇屬的草菇（Volvariella volvacea），研究結(jié)果系統(tǒng)完善了徐州市常見食用菌的種質(zhì)資源，為進(jìn)一步篩選優(yōu)種、提高產(chǎn)量、優(yōu)化母種等研究提供了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]趙歡，吳衛(wèi)，鄭有良，等.核糖體DNA ITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009（4）：959-962.

[2]White T J， Burns T ， Lee S.Analysis of phylogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C].PCR protocols： A Guide to Methods and Applications. New York ：Academic，1990，15-22.

[3]李晶，林冬梅，林占熺，等.一種野生食用菌的分子及形態(tài)學(xué)鑒定[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（8）：110-111， 115.

[4]雷瓊，汪儉，范曉丹，等.1株野生大型食用菌的分子鑒定與同源性分析[J]. 長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2013（35）： 7，52-55，68.

[5]臧金平，連賓，袁生.簡便易行的食用菌菌絲體基因組DNA提取法[J].食品科學(xué)， 2005，26（3）：66-68.

[6]Saitou N， Nei M. The neighbor-joining method： a new method for reconstructing phylogenetic tree[J].Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.

[7]Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies：An approach using the bootstrap[J].Evolution，1985，39（4）：783-791.

[8]葉自新. 蘑菇保鮮及防止其變色的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，1982（05）：32-38.

[9]陸正麗，秦越華. 徐州市食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢與策略[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（14）：93，96.

作者簡介：胡揚(yáng)楠（1993-），女，大學(xué)本科，研究方向：食用菌種質(zhì)資源；溫洪宇，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)。