基于ITS序列對(duì)紫薇的分子鑒定

馮媛媛+夏珊+曾其國(guó)+馮鴻+薛飛龍+賴(lài)麟

摘要：對(duì)紫薇屬植物細(xì)胞核核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（nrDNA ITS）序列進(jìn)行分析，為紫薇植物的鑒定提供分子依據(jù)。通過(guò)提取紫薇幼苗總DNA，對(duì)nrDNA ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，應(yīng)用軟件BioEdit、DNAMAN進(jìn)行序列分析，MEGA計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建基于K2P模型的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。測(cè)序得到2條nrDNA ITS序列，長(zhǎng)度均為615 bp。序列分析結(jié)果顯示，序列1與紫薇ITS序列相似性達(dá)99.03%，遺傳距離為0.003，聚類(lèi)分析歸為一支;序列2與毛紫薇ITS序列相似性達(dá)98.55%，遺傳距離0.007，聚類(lèi)分析歸為一支。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，基于nrDNA ITS序列分析法，能夠?qū)ψ限睂僦参镞M(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定，從而為紫薇屬的種類(lèi)鑒定和種間親緣關(guān)系提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫薇;分子鑒定;ITS序列;相似性

中圖分類(lèi)號(hào)： S685.990.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0067-02

收稿日期：2014-05-15

基金項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012FZ0049）;四川省科技富民強(qiáng)縣專(zhuān)項(xiàng)行動(dòng)計(jì)劃。

作者簡(jiǎn)介：馮媛媛（1970—），女，江蘇淮安人，博士，講師，主要從事植物發(fā)育生理與分子生物學(xué)研究。E-mail：fyuyang_12@163.com。

通信作者：賴(lài) 麟，碩士，教授，主要從事植物遺傳育種研究。Tel：（028）66772002;E-mail：lailin127@126.com。

紫薇屬（Lagerstroemia Linn.）植物為千屈菜科（Lythraceae）落葉或常綠的灌木或喬木，主要分布在亞洲東部、東南部、南部和澳大利亞的北部。我國(guó)目前共有紫薇屬植物24種，其中4種為我國(guó)特有[1]。紫薇屬植物大多數(shù)種類(lèi)有大而美麗的花，花期長(zhǎng)達(dá)3個(gè)多月，具有較高的觀(guān)賞價(jià)值，在園林綠化中得到廣泛的應(yīng)用。紫薇屬少數(shù)植物被用作傳統(tǒng)藥物，如據(jù)我國(guó)民間記載，紫薇（Lagerstroemia indica L.）有活血、止血、消風(fēng)、清熱、解毒的功能，具有抗流感病毒、抗真菌作用，用于治療產(chǎn)后血崩、洗疥癩癬瘡[2];在菲律賓，大花紫薇（Lagerstroemia speciosa Pers.）的葉被用于治療糖尿病和腎病[3];在印度，小葉紫薇（Lagerstroemia parviflora Roxb.）被作為止咳藥和收斂藥使用[4]。由于部分紫薇在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下外觀(guān)差異極小，僅靠傳統(tǒng)的鑒定方法對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)存有較大爭(zhēng)議，需要分子生物學(xué)提供更多證據(jù)支持[1]。

隨著分子生物學(xué)在物種鑒定領(lǐng)域的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)在植物鑒定方面顯示出了極其重要的作用。在眾多條形碼中，細(xì)胞核核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（nrDNA ITS）序列因具有高分辨率的特點(diǎn)，被廣泛用于被子植物物種鑒定和親緣關(guān)系分析中[5-6]。已有學(xué)者采用RAPD、AFLP等分子標(biāo)記技術(shù)研究紫薇品種和種間親緣關(guān)系[7-8];但與RAPD、AFLP、SSR和SRAP等相比，采用ITS構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，具有省時(shí)、省工和結(jié)果更加可靠等優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究通過(guò)擴(kuò)增待檢測(cè)紫薇屬植物的ITS片段，對(duì)ITS序列進(jìn)行比較分析，對(duì)待檢紫薇進(jìn)行分類(lèi)鑒定，探討紫薇種內(nèi)和種間的遺傳變異以及它們之間的親緣關(guān)系，為紫薇種質(zhì)資源的鑒定及系統(tǒng)學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫薇種子購(gòu)自云南昆明。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、pBLUE-T載體、T4 DNA連接酶購(gòu)自Aidlab公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。

1.2 方法

紫薇種子滅菌萌發(fā)后，采用改良CTAB法[10]提取幼苗總DNA。參照He等的方法[11]，根據(jù)不同物種間同源基因的核酸序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)紫薇屬I(mǎi)TS的通用擴(kuò)增引物：ITS-F：5′-GAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′和ITS-R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，由成都金杰生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性45 s，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，連接到pBLUE-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選后送六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

使用BioEdit軟件編輯ITS序列，DNAMAN軟件比對(duì)分析序列同源性和GC含量，MEGA軟件分析K2P（Kimura-2 parameter）遺傳距離，用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度用自展檢驗(yàn)法（bootstrap test）檢驗(yàn)，共1 000次循環(huán)，以評(píng)價(jià)各分支的系統(tǒng)學(xué)意義與可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薇樣品nrDNA ITS PCR擴(kuò)增

以紫薇樣品總DNA為模板進(jìn)行nrDNA ITS序列的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖1。樣品nrDNA ITS序列PCR條帶大小約750 bp，主條帶清晰，非特異性條帶少。

2.2 ITS序列分析

挑取10個(gè)紫薇樣品各2個(gè)單克隆測(cè)序，獲得樣品nrDNA ITS序列長(zhǎng)度為721 bp，合并相同序列后， 最終得到2條差異

較大的序列。將2條樣品ITS序列在GenBank中進(jìn)行blast，得到與序列1相似性最高的序列是紫薇（AF201689.1），與序列2相似性最高的序列是毛紫薇（Lagerstroemia villosa，AY035755.1）。通過(guò)BioEdit和DNAMAN軟件比對(duì)分析，序列1與紫薇的相似性為99.03%，有6個(gè)變異位點(diǎn);序列2與毛紫薇的相似性為98.55%，有9個(gè)變異位點(diǎn)。ITS序列各部分長(zhǎng)度和GC含量差異見(jiàn)表1。

表1 紫薇樣品ITS序列長(zhǎng)度和GC含量比對(duì)

種類(lèi) ITS序列長(zhǎng)度（ITS1+5.8S+ITS2）

（bp） GC含量（ITS1+5.8S+ITS2）

（%）

樣品序列1 615（236+164+215） 64.4（67.3+56.1+67.4）

紫薇（AF201689.1） 618（236+164+218） 63.8（66.9+56.1+66.1）

樣品序列2 615（236+164+215） 64.4（66.9+56.1+67.9）

毛紫薇（AY035755.1） 618（237+164+217） 63.6（65.9+54.8+67.7）

2.3 紫薇遺傳距離分析

使用MEGA軟件分析2種紫薇樣品序列與高同源性（90%以上）紫薇ITS序列的K2P遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表2。與樣品1距離最小的是紫薇（0.003），其次是毛紫薇和絨毛紫薇（Lagerstroemia tomentasa，AF201688.1），距離分別是0.020和0.015，再次是大花紫薇和Lagerstroemia hirsuta，距離都是0.053，距離最遠(yuǎn)的是小葉紫薇（0.058）。與樣品2距離最小的是毛紫薇（0.007），其次是紫薇和絨毛紫薇，距離分別是0013和0.018，距離較遠(yuǎn)的是大花紫薇、小葉紫薇和L. hirsuta。

2.4 紫薇聚類(lèi)分析

將2條紫薇樣品ITS序列與紫薇屬部分ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化聚類(lèi)分析，外類(lèi)群選取與紫薇屬近緣的八寶樹(shù)屬（Duabanga）[12]，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，ITS序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)上，樣品1和紫薇聚成一類(lèi)，樣品2和毛紫薇聚

表2 紫薇ITS序列種內(nèi)種間K2P遺傳距離

種類(lèi)

遺傳距離

1 2 3 4 5 6 7

2 0.035

3 0.048 0.051

4 0.058 0.064 0.064

5 0.053 0.058 0.053 0.020

6 0.062 0.065 0.056 0.025 0.012

7 0.053 0.058 0.053 0.020 0.003 0.015

8 0.051 0.056 0.056 0.007 0.013 0.018 0.013

注：1.大花紫薇;2.小葉紫薇;3. Lagerstroemia hirsuta;4.毛紫薇;5.紫薇;6.絨毛紫薇;7.樣品1;8.樣品2。

為一類(lèi)。紫薇、毛紫薇、絨毛紫薇聚為一個(gè)分支，大花紫薇、小葉紫薇、L. hirsuta（JX856469.1）聚為另外一個(gè)分支。

3 討論

ITS序列1與紫薇ITS序列相似性為99.03%，遺傳距離為0.003，聚類(lèi)分析將其歸為一支，由此可以確定含有ITS序列1的樣品為紫薇;序列2與毛紫薇ITS序列相似性為9855%，遺傳距離0.007，聚類(lèi)分析歸為同一支，支持率99%，可確定序列2樣品為毛紫薇。此結(jié)果說(shuō)明，可通過(guò)比對(duì)未知紫薇的ITS序列與已有紫薇的ITS序列來(lái)鑒別紫薇種類(lèi)。

本研究對(duì)NCBI中紫薇ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，6種紫薇屬植物被聚為2類(lèi)，大花紫薇、小葉紫薇和L. hirsuta親緣關(guān)系較近，紫薇、毛紫薇和絨毛紫薇親緣關(guān)系較近。根據(jù)外類(lèi)群確定法，大花紫薇、小葉紫薇、L. hirsuta出現(xiàn)較紫薇、毛紫薇、絨毛紫薇早，L. hirsuta在6種紫薇植物中最原始。此結(jié)果與Shi等的研究結(jié)果[12]相似，說(shuō)明ITS序列可以用于研究紫薇的親緣關(guān)系。

本研究供試材料為市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的同一批紫薇種子萌發(fā)后的幼苗，通過(guò)ITS測(cè)序，表明該批紫薇種子中有毛紫薇摻雜，但紫薇樣品ITS序列與NCBI上紫薇ITS序列的差異是否穩(wěn)定還需要收集更多的紫薇樣本加以驗(yàn)證。

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