穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在生物樣本中小分子代謝物分析的研究進(jìn)展

何昀潞++羅彥波++陳歡++侯宏衛(wèi)++胡清源+

摘要穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化 （Isotope coded derivatization，ICD）是通過化學(xué)衍生化反應(yīng)對目標(biāo)物的特定官能團(tuán)進(jìn)行同位素標(biāo)記的技術(shù)，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS），可對具有相同標(biāo)記反應(yīng)特性的生物分子進(jìn)行系統(tǒng)分析。該技術(shù)可以有效解決復(fù)雜生物基質(zhì)分析中靈敏度不足與定量分析中同位素內(nèi)標(biāo)化合物有限的問題，近年來在代謝組學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文介紹了ICD方法及試劑的設(shè)計(jì)，對近年來針對羧基、氨基、羰基、巰基和羥基的ICD試劑以及結(jié)合LCMS/MS在生物樣本中小分子代謝物分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了評述。

關(guān)鍵詞同位素標(biāo)記； 衍生化； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 代謝物； 生物樣本； 評述

1引 言

小分子代謝物作為人體內(nèi)生物過程的中間體和終產(chǎn)物，是正常生理過程、病理過程以及對治療干預(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的重要指標(biāo)＼[1＼]。研究體液和組織中小分子代謝物水平的變化，可深入了解代謝通路和疾病機(jī)制并有助于疾病的診療與預(yù)后。但復(fù)雜生物樣本中的代謝物，一般含量較低，基質(zhì)對分析和測定的干擾較大，直接對其進(jìn)行分析往往難以達(dá)到理想的檢測要求。而衍生化可以通過化學(xué)反應(yīng)改變目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，將難于分析檢測的目標(biāo)物定量地轉(zhuǎn)化為更適合特定分析的化合物＼[2＼]。隨著對生命科學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深入，代謝組學(xué)研究中對小分子代謝物的定量分析日益重要?；谕凰貥?biāo)記內(nèi)標(biāo)化合物的同位素稀釋法可獲得精準(zhǔn)可靠的絕對定量分析結(jié)果，但同位素內(nèi)標(biāo)物合成困難且昂貴，商品化的種類有限，難以獲取所有目標(biāo)分析物的同位素內(nèi)標(biāo)是不現(xiàn)實(shí)的，從而限制了該定量方法的廣泛應(yīng)用＼[3＼]。

近年來，為了克服對同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)化合物的依賴，一些課題組采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化（Isotope coded derivatization，ICD）技術(shù)＼[4～7＼]，通過衍生化反應(yīng)分別向生物樣本及其對照組引入化學(xué)結(jié)構(gòu)相同，但質(zhì)量不同的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽，再利用LCMS/MS對兩組樣本進(jìn)行比較，確定目標(biāo)物的含量變化。這種標(biāo)記方法使具有相同官能團(tuán)的一類分析物同時(shí)獲得相應(yīng)的同位素衍生物，將同位素標(biāo)記的分析物作為內(nèi)標(biāo)可以提高定量分析的精確度和準(zhǔn)確度，并解決同位素內(nèi)標(biāo)物獲取困難的問題。此外，ICD借助衍生化反應(yīng)引入的同位素標(biāo)簽，能夠增加分析物的電離效率，改善其在LCMS/MS中的色譜質(zhì)譜行為，提高方法的靈敏度與選擇性＼[8～10＼]?；贗CD的LCMS/MS方法能夠?qū)?fù)雜生物基質(zhì)中具有相同標(biāo)記反應(yīng)特性的生物分子進(jìn)行定量分析、差異分析及譜圖分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。現(xiàn)已有數(shù)篇關(guān)于小分子代謝物＼[3， 11～15＼]和定量蛋白組學(xué)＼[15～17＼]等方面的ICD綜述，而本文是以ICD試劑靶向的目標(biāo)物官能團(tuán)進(jìn)行分類，以ICD試劑為導(dǎo)向，總結(jié)了近幾年報(bào)道的ICD試劑及其結(jié)合LCMS/MS在動物樣本中小分子代謝物的最新進(jìn)展。

2穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化技術(shù)

ICD最早出現(xiàn)在蛋白組學(xué)相對定量研究中，主要用于鑒定和定量分析不同時(shí)期生物樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。隨著新型ICD試劑的不斷出現(xiàn)，該技術(shù)已擴(kuò)展到代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。這種標(biāo)記策略將化學(xué)反應(yīng)與生物分析有機(jī)結(jié)合在一起，產(chǎn)生了更大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

ICD技術(shù)是以待分析物的目標(biāo)基團(tuán)為反應(yīng)活性部位，通過特定的化學(xué)反應(yīng)使其與ICD試劑相連，從而將不同同位素標(biāo)記形式的質(zhì)量差異標(biāo)簽引入到目標(biāo)物中。應(yīng)用ICD進(jìn)行相對定量分析的基本原理是：輕質(zhì)和重質(zhì)同位素標(biāo)記試劑分別與兩份樣本中的目標(biāo)物進(jìn)行衍生化反應(yīng)，按比例混合后進(jìn)入LCMS/MS分析，最后根據(jù)“輕”“重”衍生物產(chǎn)生的離子對的峰面積比值即可對含相同功能基團(tuán)的系列組分進(jìn)行相對定量分析，其工作流程見圖1＼[3＼]。當(dāng)其中一組樣本是濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，將其衍生物作為內(nèi)標(biāo)物，可以實(shí)現(xiàn)樣本中目標(biāo)組分的絕對定量分析。如ICD試劑采用多種同位素編碼的標(biāo)簽，可對目標(biāo)物進(jìn)行多重定量分析標(biāo)記，適用于多組樣本間的同時(shí)比較及生物學(xué)過程的動態(tài)監(jiān)測，提高了分析效率和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。其中利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量分析（iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（TMT）可對多肽的氨基分別實(shí)現(xiàn)八重＼[18＼]和十重＼[19＼]標(biāo)記。Dephoure等＼[20＼]將三重代謝標(biāo)記與六重TMT結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了18組樣本的同時(shí)分析，大大提高了蛋白質(zhì)組相對定量分析的通量。

由于“輕”“重”衍生物只相差幾個(gè)確定的質(zhì)量數(shù)，具有相同的結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)相似，洗脫時(shí)間和質(zhì)譜離子化能力幾近相同，通過比較衍生物的質(zhì)譜響應(yīng)信號，可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)比較樣本中代謝物的差異分析，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)庫搜索，有助于潛在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。ICD還可以有效解決次級代謝物分析時(shí)感興趣的目標(biāo)物與背景峰區(qū)分困難的問題。所有衍生的分析物在質(zhì)譜圖中呈現(xiàn)特定質(zhì)量差值（等于同位素標(biāo)簽的質(zhì)量差×標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量，如：H4/D4標(biāo)記試劑的質(zhì)量差為4 Da×官能團(tuán)數(shù)量）且保留時(shí)間相同的一對峰，而背景峰和未衍生的分析物呈現(xiàn)單峰，從而有利于目標(biāo)物的鑒定＼[21＼]。

ICD試劑的設(shè)計(jì)和選擇是ICD技術(shù)的關(guān)鍵步驟。ICD試劑一般由三部分組成：與目標(biāo)物官能團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；為目標(biāo)物的衍生物提供不同質(zhì)量的同位素標(biāo)簽；用于提高目標(biāo)分析物分離性和可檢測性的性能修飾基團(tuán)，包括質(zhì)子親和、易離子化、帶電荷和疏水基團(tuán)。當(dāng)目標(biāo)物的疏水性提高時(shí)，反相色譜（RPLC）可以采用有機(jī)溶劑比例更高的流動相，這種流動相適合電噴霧電離（ESI）中帶電液滴的產(chǎn)生，因而ESIMS響應(yīng)更高＼[8＼]。理想的ICD試劑需滿足如下要求＼[3， 22＼]：（1）“輕”“重”同位素試劑易合成，且成本較低；（2）衍生化反應(yīng)足夠穩(wěn)健以抵抗各種復(fù)雜的基質(zhì)成分，并在溫和的條件下獲得高產(chǎn)量；（3）特異性地與目標(biāo)物官能團(tuán)反應(yīng)，過量的衍生化試劑或副產(chǎn)物不干擾樣本的分離和檢測；（4）“輕”“重”同位素試劑衍生化的反應(yīng)時(shí)間、過程及產(chǎn)率均相同；（5）“輕”“重”衍生物在色譜分離中同位素效應(yīng)不明顯，色譜行為一致，可以有效地校正保留時(shí)間漂移產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)；（6）衍生物通過低能碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）產(chǎn)生相同的特征子離子或中性碎片（來源于ICD試劑），與母離子結(jié)構(gòu)無關(guān)等。endprint

ICD與 LCMS/MS相結(jié)合具有以下優(yōu)勢，可以在大氣壓化學(xué)電離（APCI）模式下向分析物引入高親電或親核的結(jié)構(gòu)，在ESI模式下引入永久性帶電荷或易離子化的結(jié)構(gòu)，提高檢測靈敏度＼[8＼]；增加高極性和高親水性化合物的疏水能力，使其在RPLC上得以保留并分離；增加分析物的穩(wěn)定性以及低分子量化合物的分子量；標(biāo)記對象廣泛，同時(shí)獲得具有相同標(biāo)記反應(yīng)特性的某類分析物的同位素內(nèi)標(biāo)物；校正基質(zhì)效應(yīng)和每次運(yùn)行間的電離差異，提高定量分析的精確度和準(zhǔn)確度＼[23＼]；易于未知代謝物的鑒定等。

3穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化的應(yīng)用

ICD 結(jié)合LCMS/MS的方法適用于生物樣本中代謝物的定量分析、差異分析及次級代謝物的譜圖分析。本文以ICD試劑靶向的目標(biāo)物官能團(tuán)進(jìn)行分類，重點(diǎn)介紹了針對不同基團(tuán)的ICD試劑并對該方法在動物樣本中羧酸類、胺類、含羰基、含巰基和含羥基代謝物研究中的應(yīng)用進(jìn)行評述。

3.1羧酸類化合物羧酸類化合物在生物分子中占有極大的比例，已被證明與2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征等疾病和生理病理學(xué)紊亂有著極為重要的關(guān)系。羧酸類化合物可在MS負(fù)離子模式下檢測，但靈敏度通常較低，同時(shí)用于分離羧酸類化合物的流動相并不總與ESIMS相容＼[12＼]。因此，常在分析前將其衍生為易離子化、更疏水或堿性的衍生物，使其在ESI或APCI正離子模式下具有更高的靈敏度。常用于靶向羧基的ICD試劑及其應(yīng)用分別示于圖2與表1中。

Guo等＼[31＼]設(shè)計(jì)并合成了一對羧基ICD試劑12C2/13C2對二甲氨基苯甲酰甲基溴（DMPABr，圖2A）。DMPABr衍生物主要包含三個(gè)部分：提高檢測靈敏度的叔胺基團(tuán)，增加疏水性進(jìn)而改善RPLC保留的芳環(huán)以及利于代謝物鑒定和準(zhǔn)確量化的同位素標(biāo)簽。DMPABr衍生物的信號增強(qiáng)了2～4個(gè)數(shù)量級，但胺類可與DMPABr反應(yīng)抑制羧酸類化合物的信號。Peng等＼[24＼]對該方法加以改進(jìn)，在DMPABr標(biāo)記前使用液液萃取富集羧酸化合物。液液萃取在酸性條件下（pH約為1）可有效地分離胺類與羧酸類化合物，并將樣本中降低標(biāo)記效率的水移除＼[24＼]。

2，4二甲氧基6哌嗪基嘧啶（DMPP，圖2B）是一種高專一性的羧基標(biāo)記試劑，在基于碳二亞胺縮合的標(biāo)記條件下，15 s即可實(shí)現(xiàn)快速標(biāo)記且不需要諸如高溫等苛刻的反應(yīng)條件。DMPP具有高質(zhì)子親合能（嘧啶環(huán)）和適中的疏水性，可提高多種含羧基化合物，如小分子有機(jī)酸、脂肪酸、多肽、蛋白質(zhì)等底物的質(zhì)譜響應(yīng)＼[5＼]。H6/D6DMPP試劑已應(yīng)用于尿液＼[5＼]和甲狀腺組織＼[25， 26＼]中脂肪酸的定量分析及差異分析。

二甲基乙二胺（DMED，圖2C）中的叔胺基團(tuán)能夠提高羧酸類化合物的質(zhì)子親和力，使其在ESI源中更易電離。Zhu等＼[27＼]借助H4/D4DMED將血清中19種類花生酸的靈敏度增加了5～138倍，實(shí)現(xiàn)了類花生酸同分異構(gòu)體的色譜分離。該課題組將H4/D4DMED試劑與雙中性丟失掃描（QNLS）相結(jié)合實(shí)現(xiàn)了脂溶性羧酸類代謝物的全面分析，在ESI源中，輕重標(biāo)記的DMED衍生物分別特異性地丟失質(zhì)量為45和49 Da的中性碎片二甲胺，產(chǎn)生含有特定質(zhì)量差（4 Da×羧基數(shù)）且保留時(shí)間相同的離子對，與全掃描模式相比，QNLS能顯著提高檢測準(zhǔn)確度和選擇性，有益于目標(biāo)物的鑒定（圖3）＼[21＼]。

Ogawa等＼[28＼]合成了H4/D41＼[（4二甲基氨基苯基）羰基＼]哌嗪（DAPPZ，圖2D），用于二十碳五烯酸（EPA）和花生四烯酸（AA）的定量分析，衍生物的酰胺鍵斷裂產(chǎn)生特征性產(chǎn)物離子m/z 148。EPA和AA的羧基經(jīng)衍生化后，MS檢測靈敏度分別提高了100和300倍。

Han等＼[29＼]利用12C6/13C63硝基苯肼（3NPH，圖2E）對10種腸道微生物來源的2～6個(gè)碳的短鏈脂肪酸（SCFA）進(jìn)行定量分析，獲得了良好的精密度（≤8.8%）和準(zhǔn)確度（93.1%～108.4%）。但該方法缺乏衍生化后的淬滅步驟，可能導(dǎo)致NPH與殘留乙酸（LCMS系統(tǒng)常見的共溶劑）發(fā)生非預(yù)期反應(yīng)。而Chan等＼[30＼]利用12C6/13C6苯胺（圖2F）對15種SCFAs建立的定量分析方法，優(yōu)化了苯胺衍生化反應(yīng)的淬滅條件，幾乎消除了乙酸的在線衍生。

上述ICD試劑衍生化反應(yīng)簡單易行，標(biāo)記效率高，不僅憑借同位素標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了羧酸類化合物的準(zhǔn)確定量分析，還通過引入質(zhì)子親合能高和疏水性強(qiáng)的基團(tuán)（哌嗪基、嘧啶基和苯環(huán)等），大大提高了質(zhì)譜儀從復(fù)雜生物樣本中檢測羧酸類化合物的能力。與上述LCMS/MS方法相比，ICD較少應(yīng)用于氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GCMS/MS）對羧酸類代謝物的分析中。Bruheim等＼[11＼]綜述了3種ICD結(jié)合GCMS的分析策略，其中H3/D3氯甲酸甲酯（MCF，圖2G）＼[32＼]和H6/D6N（特丁基二甲基硅）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，圖2H）＼[33＼]可用于分析羧酸代謝物。由于氯甲酸烷基酯在水相介質(zhì)中與氨基和/或羧基衍生化快速，衍生物穩(wěn)定，并且可以對氨基和羧基分別進(jìn)行標(biāo)記，最近，Tumanov等＼[34＼]將H3/D3MCF應(yīng)用于大鼠肝臟、血漿和尿液中氨基酸和非氨基有機(jī)酸的定量分析。

3.2胺類化合物

胺類代謝物，如氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)和生物胺等在生物功能中起著重要作用。研究表明，體液中胺類代謝物的失調(diào)與帕金森、阿爾茨海默癥和腎癌等疾病相關(guān)＼[1＼]。胺類物質(zhì)在酸性條件下通常容易質(zhì)子化，在ESIMS正離子模式下能達(dá)到合適的靈敏度，但其堿性、強(qiáng)極性及高水溶性等特點(diǎn)，使其難以在RPLC中保留，離子抑制效應(yīng)嚴(yán)重＼[35＼]。而通過衍生化將胺轉(zhuǎn)化為疏水性更高的化合物，可以使得衍生物在RPLC上更易與干擾物分離且提高檢測靈敏度。圖4與表2分別顯示了靶向氨基的ICD試劑及其應(yīng)用。

丹磺酰試劑在堿性介質(zhì)中可以對一級胺、二級胺和酚羥基實(shí)現(xiàn)快速標(biāo)記，而不包括叔胺和醇羥基類化合物。丹磺?；軌蚋纳品治鑫锏膸щ娦院褪杷?，引入的堿性叔胺基在酸性LC流動相中易離子化，萘基能增加衍生物的疏水性及其在RPLC上的保留＼[36＼]。丹磺酰氯（DNSCl，圖4A）可將胺、氨基酸和苯酚ESI正離子響應(yīng)信號增強(qiáng)1～3個(gè)數(shù)量級＼[4＼]， 該試劑現(xiàn)已應(yīng)用于尿液＼[4， 38～40＼]、 汗液＼[36＼]、 腦脊液＼[37＼]和糞便＼[39＼]等樣本的次級代謝物分析及生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。5二乙基氨基萘1磺酰氯（DENSCl，圖4B）在結(jié)構(gòu)上與DNSCl類似，其中連接到萘基胺的兩個(gè)甲基被乙基替代，乙基可以增加疏水性并提供更強(qiáng)的給電子傾向，使得DENSCl衍生物在離子化時(shí)有更強(qiáng)的表面活性而易生成更多的氣相離子，并具有更高的質(zhì)子親和力＼[41＼]。此外，DENSCl可形成3種同位素質(zhì)量差異標(biāo)簽（12C4/12C213C2/13C4），能同時(shí)對3個(gè)樣本進(jìn)行分析，比DNSCl雙重同位素試劑（12C2/13C2）具備更高的靈敏度和分析速度＼[41＼]。endprint

N羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯為羧酸活性酯， 是一級胺和二級胺的高反應(yīng)性親電試劑， 且具有副產(chǎn)物及過量試劑不干擾分離和檢測的優(yōu)點(diǎn)，除了已實(shí)現(xiàn)商品化的iTRAQ試劑（圖4C）外，近年也開發(fā)了焦谷氨酸NHS酯（PGAOSu，圖4D）＼[7＼]、苯甲酸NHS酯（BZOSu，圖4E）＼[45＼]、4二甲基氨基苯甲酰氨基乙酸NHS酯（DBAANHS，圖4F）＼[44＼]、4甲氧基苯甲酰氨基乙酸NHS酯（MBAANHS，圖4G）＼[44＼]、甲基哌嗪基丁酸NHS酯（MPBS，圖4H）＼[43＼]和二甲基氨基丁酸NHS酯（DMABS，圖4I）＼[43＼]等ICD試劑。Wagner 等＼[45＼]利用12C6/13C6BZOSu相對定量分析含氨基代謝物，未衍生的胺類代謝物大多在1.5 min內(nèi)洗脫，而BZOSu衍生物因苯基的引入，色譜保留增加，分離度改善且具有更高的信號響應(yīng)（圖5）。Toyo′oka課題組開發(fā)了一系列用于手性氨基酸和羧酸次級代謝組學(xué)的衍生化試劑＼[7， 4649＼]。借助手性試劑H5/D5LPGAOSu， 9種疏水性D/L氨基酸在1.7 μm的十八烷基甲硅烷基（ODS）柱上實(shí)現(xiàn)對映體分離＼[7＼]。Zhou等＼[44＼]設(shè)計(jì)并合成了兩種氨基ICD試劑DBAANHS和MBAANHS，由于二甲基氨基在ESI源中更易質(zhì)子化，DBAANHS比MBAANHS提高代謝物靈敏度的能力更顯著。但MBAANHS衍生物在MS3（源內(nèi)CID加MS/MS）中可以產(chǎn)生更多有價(jià)值的碎片離子以提供目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息，從而有助于代謝物的鑒定＼[44＼]。

上述氨基標(biāo)記試劑的衍生條件簡單，衍生物穩(wěn)定且可以顯著增強(qiáng)胺類化合物的離子化效率。但由于丹磺酰基和NHS酯較高的反應(yīng)活性，這些氨基ICD試劑還能與酚羥基類和巰基類化合物發(fā)生反應(yīng)，不能實(shí)現(xiàn)對氨基專一性的標(biāo)記。因此，進(jìn)一步開發(fā)新型氨基特異性ICD試劑是很有必要的。

3.3含羰基化合物

內(nèi)源性含活性羰基的醛和酮，通常與糖代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)，其參與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病及并發(fā)癥和動脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)展＼[50＼]。在使用大氣壓離子化技術(shù)時(shí)，醛和酮的中性羰基會降低離子化效率。通過衍生化反應(yīng)引入帶電荷的結(jié)構(gòu)，可以提高羰基化合物的電離效率，消除脂肪醛和脂肪酮的揮發(fā)性和反應(yīng)性，使其更適于LCMS分析。常用于標(biāo)記含羰基化合物的ICD試劑及其應(yīng)用分別示于圖6與表3中。

羰基ICD試劑吉拉德試劑P（GP，圖6A）主要由能夠改善分析物色譜質(zhì)譜行為的季銨和與羰基反應(yīng)的肼兩部分組成，H5/D5GP已應(yīng)用于血清中含3酮和3β羥基的固醇＼[51＼]及人卵泡液中7種類固醇＼[52＼]的分析。

2肼基1甲基吡啶（HMP，圖6B）可用于含羰基化合物的標(biāo)記，HMP衍生物的電離效率相當(dāng)高且在CID下產(chǎn)生特征性的子離子m/z 108。但由于會形成多個(gè)帶電離子（＼[M-H＼]

Symbolm@@ 和＼[M＼]2+）及其它碎片離子，HMP并不適用于多羰基化合物的衍生化＼[56＼]。Higashi等＼[53＼]利用H3/D3HMP對大鼠腦內(nèi)別孕烯醇酮（AP）及其前體孕烯醇酮（PREG）進(jìn)行量化和差異分析，AP和PREG的靈敏度分別提高了500和3000倍，方法的精密度和準(zhǔn)確度也得以顯著提高。

Tie等＼[54＼]建立了利用美拉肼（T3，圖6C）對內(nèi)源性脂肪醛進(jìn)行全面表征的策略，衍生化在37℃反應(yīng)15 min，衍生化效率>98%，檢測限低至0.1～1.0 pg/mL。T3能增加脂肪醛的疏水性及色譜保留，改善分離度，并通過引入的堿性基團(tuán)大幅增強(qiáng)了離子化效率。

4（2（三甲基銨基）乙氧基）苯胺鹵化物（APC，圖6D）是一種醛基標(biāo)記試劑，其中的苯胺能選擇性地與含醛基化合物快速反應(yīng)，季銨基團(tuán)可以改善MS靈敏度。Yu等＼[55＼]在QNLS下通過特異性地監(jiān)測H4/D4APC衍生物碰撞產(chǎn)生的中性碎片（87和91 Da），實(shí)現(xiàn)了對尿液中含醛基代謝物的非靶向分析。

（A）H5/D5吉拉德試劑P；（B）H3/D32肼基1甲基吡啶；（C）H20/D20美拉肼；（D）H4/D44（2（三甲基銨基）乙氧基）苯胺鹵化物；（E）12C2/12C113C1/13C2N甲氧基N（2氨氧基乙基）丙酸酯；（F）12C2/12C113C1/13C22氨氧基乙基丙酸酯

（A）H5/D5Girard′s reagent P（GP）；（B）H3/D32Hydrazino1methylpyridine（HMP）；（C）H20/D202，4Bis（diethylamino）6hydrazino1，3，5triazine（T3）；（D）H4/D44（2（Trimethylammonio）ethoxy）benzenaminium halide（APC）； （E）12C2/12C113C1/13C2 NMethoxyN（2aminooxyethyl）propionate（MAP）；（F）12C2/12C113C1/13C22Aminooxyethyl propionate（AEP）

GP、HMP和T3這類含有肼基的ICD試劑，衍生化條件相對苛刻（如高溫或酸性介質(zhì)），同時(shí)由于肼還能與小分子羧酸發(fā)生反應(yīng)，標(biāo)記反應(yīng)缺乏特異性＼[57＼]。而APC衍生化反應(yīng)條件溫和（pH 5.7，10℃），無需額外的樣本預(yù)處理步驟，對醛的特異性較高。此外，氨氧基試劑，如N甲氧基N（2氨氧基乙基）丙酸酯（MAP，圖6E）＼[58＼]和2氨氧基乙基丙酸酯（AEP，圖6F）＼[59＼]可用于羰基化合物的GCMS/MS分析中，利用AEP或MAP與羰基發(fā)生肟化反應(yīng)生成的肟醚在電子轟擊源中碎裂生成同位素標(biāo)記的乙基碳鎓離子（m/z 32～34），可實(shí)現(xiàn)多重分析中羰基化合物的鑒定與相對定量分析。

3.4含巰基和羥基化合物

硫醇分析的主要問題在于不穩(wěn)定性，因?yàn)橛坞x的巰基反應(yīng)活性高，可通過自氧化和硫醇二硫化物的交換反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧化硫醇＼[60＼]。而ω溴丙酮基喹啉鎓溴化物（BQB，圖7A）可與巰基烷基化反應(yīng)生成硫醇喹啉鎓加合物，穩(wěn)定巰基的同時(shí)引入永久帶電的結(jié)構(gòu)，增加MS檢測靈敏度。Liu等＼[6＼]利用H7/D7BQB在母離子掃描模式下監(jiān)測衍生物CS鍵斷裂產(chǎn)生的離子（m/z 218和225），實(shí)現(xiàn)了含巰基代謝物的非靶向分析。該課題組也將H7/D7BQB應(yīng)用于健康人和5種癌癥患者尿液中含巰基代謝物的差異分析＼[61＼]。endprint

含羥基化合物在LC流動相的酸度范圍內(nèi)通常是中性的，缺乏可電離的基團(tuán)，MS響應(yīng)低，且一些羥基化合物較強(qiáng)的親水性使其難以在RPLC中很好地保留。靶向羥基的ICD試劑能夠增加含羥基化合物的色譜保留和電離效率，從而提高分析方法的靈敏度和重現(xiàn)性（應(yīng)用列于表4）。DNSCl除了用于標(biāo)記胺外，還可用于含羥基化合物的分析，通過液液萃取將羥基代謝物富集到乙酸乙酯層，干燥后復(fù)溶于乙腈中，接著將代謝物提取物用經(jīng)堿激活的12C2/13C2DNSCl標(biāo)記＼[62＼]。丙酮（圖7C）可選擇性地與含順式二醇化合物反應(yīng)，通過引入更疏水的異丙亞基阻斷順式鄰二羥基以降低極性，從而改善其在反相色譜柱上的分離。Li等＼[63＼]利用H6/D6丙酮在QNLS下監(jiān)測目標(biāo)衍生物產(chǎn)生的中性碎片172 Da（H標(biāo)核苷）和178 Da（D標(biāo)核苷），對核糖核苷進(jìn)行鑒定。Chu等＼[64＼]采用二氧化鈰分散固相萃取法富集尿液中的

修飾核苷，同時(shí)選擇性地捕獲修飾核苷中的順式鄰二羥基，再用H6/D6丙酮對其進(jìn)行同位素標(biāo)記和分析，該方法可以顯著降低基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測靈敏度并將非核糖結(jié)合物等假陽性結(jié)果最小化。

4總結(jié)與展望

隨著ICD的不斷發(fā)展，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在簡化樣品復(fù)雜性、提高方法的靈敏度和準(zhǔn)確度等方面逐漸顯示出了強(qiáng)大的功能，為結(jié)構(gòu)多樣、樣本來源復(fù)雜的代謝物的定量分析、差異分析以及譜圖分析提供了很好的思路。但該技術(shù)仍存在諸多限制，如ICD試劑高昂的成本、衍生化苛刻的反應(yīng)條件及時(shí)間的耗費(fèi)、標(biāo)記效率的有限性、部分ICD試劑與待分析物的專一性不強(qiáng)、后續(xù)分離檢測過程引入的定量分析誤差等。此外，H/D同位素標(biāo)記試劑的衍生物存在同位素效應(yīng)，其色譜行為差異會影響定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。但該問題可以通過減少D的個(gè)數(shù)，并將標(biāo)記位點(diǎn)選擇在親水基團(tuán)附近，或者選用12C/13C或14N/15N同位素標(biāo)記試劑而得以緩解。 ICD試劑在廉價(jià)易得、對靶標(biāo)分析物具有更高的反應(yīng)性及特異性、更加準(zhǔn)確靈敏、適合高通量及大規(guī)模定量分析等方面仍具有很大的發(fā)展空間。相信隨著新型ICD試劑與標(biāo)記策略的不斷發(fā)展和改進(jìn)，ICD技術(shù)將為生物體內(nèi)重要分子的代謝途徑、疾病作用機(jī)制的闡述，生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)以及疾病的診療和預(yù)后提供更可靠的信息，必將得到更廣泛的應(yīng)用。

References

1Mamas M， Dunn W B， Neyses L， Goodacre R. Arch. Toxicol.， 2011， 85（1）： 5-17

2Zhu Y T， Deng P， Zhong D F. Bioanalysis， 2015， 7（19）： 2557-2581

3Toyo′oka T. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2012， 69： 174-184

4Guo K， Li L. Anal. Chem.， 2009， 81（10）： 3919-3932

5Leng J， Wang H， Zhang L， Zhang J， Wang H， Guo Y. Anal. Chim. Acta， 2013， 758： 114-121

6Liu P， Huang Y Q， Cai W J， Yuan B F， Feng Y Q. Anal. Chem.， 2014， 86（19）： 9765-9773

7Mochizuki T， Todoroki K， Inoue K， Min J Z， Toyo′oka T. Anal. Chim. Acta， 2014， 811： 51-59

8Xu F， Li Z， Liu Y， Zhang Z， Ong C N. Mass Spectrom. Rev.， 2011， 30（6）： 1143-1172

9Ilisz I， Berkecz R， Péter A. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2008， 47（1）： 1-15

10Qi B L， Liu P， Wang Q Y， Cai W J， Yuan B F， Feng Y Q. TrACTrends Anal. Chem.， 2014， 59： 121-132

11Bruheim P， Kvitvang H F N， VillasBoas S G. J. Chromatogr. A， 2013， 1296： 196-203

12Baghdady Y Z， Schug K A. J. Sep. Sci.， 2016， 39（1）： 102-114

13Higashi T， Ogawa S. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2016， 130： 181-193

14Freund D M， Hegeman A D. Curr. Opin. Biotechnol.， 2017， 43： 41-48

15Chapman H M， Schutt K L， Dieter E M， Lamos S M. Bioanalysis， 2012， 4（20）： 2525-2541

16Zhou Y， Shan Y， Zhang L， Zhang Y. J. Chromatogr. A， 2014， 1365： 1-11

17Chahrour O， Cobice D， Malone J. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2015， 113： 2-20

18Ow S Y， Cardona T， Taton A， Magnuson A， Lindblad P， Stensj K， Wright P C. J. Proteome Res.， 2008， 7（4）： 1615-1628endprint

19Werner T， Sweetman G， Savitski M F， Mathieson T， Bantscheff M， Savitski M M. Anal. Chem.， 2014， 86（7）： 3594-3601

20Dephoure N， Gygi S P. Sci. Signal.， 2012， 5（217）： rs2

21Zhu Q F， Zhang Z， Liu P， Zheng S J， Peng K， Deng Q Y， Zheng F， Yuan B F， Feng Y Q. J. Chromatogr. A， 2016， 1460： 100-109

22Higashi T， Ogawa S. J. Steroid Biochem. Mol. Biol.， 2016， 162： 57-69

23Fang N， Yu S， Ronis M J， Badger T M. Exp. Biol. Med.， 2015， 240（4）： 488-497

24Peng J， Li L. Anal. Chim. Acta， 2013， 803： 97-105

25Leng J， Guan Q， Sun T， Wu Y， Cao Y， Guo Y. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2013， 84： 256-262

26Leng J P， Guan Q， Sun T Q， Wang H Y， Cui J L， Liu Q H， Zhang Z X， Zhang M Y， Guo Y L. Anal. Chim. Acta， 2015， 887： 148-154

27Zhu Q F， Hao Y H， Liu M Z， Yue J， Ni J， Yuan B F， Feng Y Q. J. Chromatogr. A， 2015， 1410： 154-163

28Ogawa S， Tomaru K， Matsumoto N， Watanabe S， Higashi T. Biomed. Chromatogr.， 2016， 30（1）： 29-34

29Han J， Lin K， Sequeira C， Borchers C H. Anal. Chim. Acta， 2015， 854： 86-94

30Chan J C Y， Kioh D Y Q， Yap G C， Lee B W， Chan E C Y. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2017， 138： 43-53

31Guo K， Li L. Anal. Chem.， 2010， 82（21）： 8789-8793

32Kvitvang H F N， Andreassen T， Adam T， VillasBas S G， Bruheim P. Anal. Chem.， 2011， 83（7）： 2705-2711

33Huang X， Regnier F E. Anal. Chem.， 2008， 80（1）： 107-114

34Tumanov S， Zubenko Y， Obolonkin V， Greenwood D R， Shmanai V， VillasBas S G. Metabolomics， 2016， 12（4）： 64

35Claeson A S， Ostin A， Sunesson A L. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 378（4）： 932-939

36Hooton K， Han W， Li L. Anal. Chem.， 2016， 88（14）： 7378-7386

37Guo K， Bamforth F， Li L. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2011， 22（2）： 339-347

38Tao H， Wu Y， Tang C， Lin G， Li L. Anal. Chem.， 2015， 87（19）： 9838-9845

39Su X， Wang N， Chen D， Li Y， Lu Y， Huan T， Xu W， Li L， Li L. Anal. Chim. Acta， 2016， 903： 100-109

40Peng J， Guo K， Xia J， Zhou J， Yang J， Westaway D， Wishart D S， Li L. J. Proteome Res.， 2014， 13（10）： 4457-4469

41Zhou R， Guo K， Li L. Anal. Chem.， 2013， 85（23）： 11532-11539

42Takach E， O′Shea T， Liu H. J. Chromatogr. B， 2014， 964： 180-190

43Johnson D W. J. Chromatogr. B， 2011， 879（17-18）： 1345-1352

44Zhou R， Huan T， Li L. Anal. Chim. Acta， 2015， 881： 107-116

45Wagner M， Ohlund L B， Shiao T C， Vézina A， Annabi B， Roy R， Sleno L. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2015， 29（18）： 1632-1640

46Mochizuki T， Takayama T， Todoroki K， Inoue K， Min J Z， Toyo′oka T. Anal. Chim. Acta， 2015， 875： 73-82endprint

47Mochizuki T， Taniguchi S， Tsutsui H， Min J Z， Inoue K， Todoroki K， Toyo′oka T. Anal. Chim. Acta， 2013， 773： 76-82

48Nagao R， Tsutsui H， Mochizuki T， Takayama T， Kuwabara T， Min J Z， Inoue K， Todoroki K， Toyo′oka T. J. Chromatogr. A， 2013， 1296： 111-118

49Takayama T， Kuwabara T， Maeda T， Noge I， Kitagawa Y， Inoue K， Todoroki K， Min J Z， Toyo′oka T. Anal. Bioanal. Chem.， 2015， 407（3）： 1003-1014

50Ellis E M. Pharmacol. Ther.， 2007， 115（1）： 13-24

51Crick P J， William B T， Abdelkhalik J， Matthews I， Clayton P T， Morris A A， Bigger B W， Zerbinati C， Tritapepe L， Iuliano L. Clin. Chem.， 2015， 61（2）： 400-411

52Guo N， Liu P， Ding J， Zheng S J， Yuan B F， Feng Y Q. Anal. Chim. Acta， 2016， 905： 106-114

53Higashi T， Aiba N， Tanaka T， Yoshizawa K， Ogawa S. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2016， 117： 155-162

54Tie C， Hu T， Jia Z X， Zhang J L. Anal. Chem.， 2016， 88（15）： 7762-7768

55Yu L， Liu P， Wang Y L， Yu Q W， Yuan B F， Feng Y Q. Analyst， 2015， 140（15）： 5276-5286

56Yamashita K， Kobayashi S， Tsukamoto S， Numazawa M. Steroids， 2007， 72（1）： 50-59

57Eggink M， Wijtmans M， Ekkebus R， Lingeman H， Esch I J P D， Kool J， Niessen W M A， Irth H. Anal. Chem.， 2008， 80（23）： 9042-9051

58Biladeau S K， Richmond W N， Laulhe S， Nantz M H. Anal. Methods， 2016， 8（18）： 3704-3710

59Laulhe S， Geers T E， Shi X， Zhang X， Nantz M H. Anal. Methods， 2013， 5（18）： 4701-4706

60Huang Y Q， Ruan G D， Liu J Q， Gao Q， Feng Y Q. Anal. Biochem.， 2011， 416（2）： 159-166

61Liu P， Qi C B， Zhu Q F， Yuan B F， Feng Y Q. Sci. Rep.， 2016， 6： 21433

62Zhao S， Luo X， Li L. Anal. Chem.， 2016， 88（21）： 10617-10623

63Li S， Jin Y， Tang Z， Lin S， Liu H， Jiang Y， Cai Z. Anal. Chim. Acta， 2015， 864： 30-38

64Chu J M， Qi C B， Huang Y Q， Jiang H P， Hao Y H， Yuan B F， Feng Y Q. Anal. Chem.， 2015， 87（14）： 7364-7372

65Li S， Jin Y， Wang J， Tang Z， Xu S， Wang T， Cai Z. Analyst， 2016， 141（3）： 1144-1153endprint