高效液相色譜化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)牛奶中磺胺類藥物殘留

段婕++李興華++劉坤++張淑娟++馬莉++石紅梅

摘要 以4種磺胺類藥物（ulfonamides， As）， 即磺胺脒（ulfaguanidine， GD）、磺胺嘧啶（sulfadiazine， DZ）、磺胺噻唑（sulfathiazole， Z）和磺胺二甲嘧啶（ulfamethazine，MZ）為分析物，基于其在堿性介質(zhì)中對(duì)Ag配合物魯米諾（Luminol）與Ni配合物魯米諾兩化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度均具有抑制作用的性質(zhì)，建立了高效液相色譜化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)牛奶中4種磺胺類藥物的方法。將化學(xué)發(fā)光體系作為高效液相色譜的新型檢測(cè)器，并對(duì)兩種化學(xué)發(fā)光體系的檢測(cè)器性能進(jìn)行了比較。4種磺胺藥物經(jīng)高效液相色譜分離后，分別與AgLuminol及NiLuminol化學(xué)發(fā)光體系作用。色譜條件為：反相C18分離柱（250 mm × 46 mm，5 μm）； 01%甲酸甲醇為流動(dòng)相（V/V）； 梯度洗脫； 流速1 mL/min?；瘜W(xué)發(fā)光條件：Ag、NiLuminol兩體系中，Ag配合物濃度14×10

ymbolm@@ 4 mol/L（含012 mol/L NaO）； Ni配合物濃度15×10

ymbolm@@ 5 mol/L（含012 mol/L NaO）； Luminol濃度均為12×10

ymbolm@@ 7 mol/L； 試劑流速均為10 mL/min。在最佳的分離檢測(cè)條件下，AgLuminol體系檢測(cè)4種磺胺類藥物的檢出限分別為015、096、110和150 μg/mL，加標(biāo)回收率為810%～1015%； NiLuminol體系檢測(cè)GD、DZ、Z 3種磺胺類藥物的檢出限分別為15、172和168 μg/mL，加標(biāo)回收率為839%～1108%。相比之下，AgLuminol體系作為高效液相色譜檢測(cè)器更佳。應(yīng)用本方法對(duì)牛奶中4種磺胺類藥物殘留量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜； 化學(xué)發(fā)光； Ag配合物； Ni配合物； 磺胺類藥物

1引 言

磺胺類藥物（ulfonamides，As）為人工合成的一類抗菌藥物，在獸醫(yī)臨床上廣泛用于預(yù)防和治療動(dòng)物細(xì)菌感染性疾病，常用磺胺藥物有磺胺脒（ulfaguanidine，GD）、磺胺嘧啶（ulfadiazine，DZ）、磺胺噻唑（ulfathiazole，Z）、磺胺二甲嘧啶（ulfamethazine，MZ）等。動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中若長(zhǎng)期使用抗生素類藥物，會(huì)使動(dòng)物體內(nèi)致病細(xì)菌產(chǎn)生耐藥，給動(dòng)物疾病檢疫與防治帶來(lái)不利影響，且會(huì)使藥物殘留在動(dòng)物體內(nèi)?；前奉愃幬餁埩羝陂L(zhǎng)，在畜禽等動(dòng)物源性食品中的殘留，嚴(yán)重危害食品安全與公眾健康。

文獻(xiàn)報(bào)道了許多用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物多組分殘留的方法，其中以高效液相色譜法（igh performance liquid chromatography，PLC）應(yīng)用最普遍[1]。反相PLC連接紫外（UV）＼[2＼]、二極管陣列（DAD）＼[3＼]、熒光（FL）＼[4＼]檢測(cè)器廣泛用于食品、環(huán)境中As殘留的例行分析，PLCM/M以其高靈敏度及選擇性用于檢測(cè)或確證分析中＼[5，6＼]。UV、DAD檢測(cè)器用于磺胺類及其它抗生素殘留檢測(cè)時(shí)靈敏度受限； FL檢測(cè)器靈敏度高，但As需柱前衍生，合適的衍生試劑不易篩選； M或M/M檢測(cè)器最有優(yōu)勢(shì)，但儀器及運(yùn)行成本的壓力，使其不易普及。

近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光分析法（Chemiluminescence，CL）以其靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于環(huán)境、生物、生化樣品分析中＼[7～9＼]。魯米諾（Luminol）體系是最經(jīng)典的化學(xué)發(fā)光體系＼[10～12＼]，其發(fā)光機(jī)理為：魯米諾在堿性條件下被氧化劑氧化，氧化產(chǎn)物吸收氧化還原反應(yīng)放出的熱量后被激發(fā)，激發(fā)態(tài)回到基態(tài)輻射發(fā)光。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)渡金屬超常氧化態(tài)與適當(dāng)多齒配體絡(luò)合形成的配合物，在一定條件下能穩(wěn)定存在并具有較強(qiáng)的氧化性能，如Ag和Ni與過(guò)碘酸形成的配合物＼[Ag（IO6）2＼]5

ymbolm@@ ， ＼[Ni（IO6）2（O）2＼]

ymbolm@@ 6在堿性條件下是良好的氧化劑＼[13～16＼]。將Ag、Ni配合物與魯米諾組成化學(xué)發(fā)光體系，通過(guò)待測(cè)組分對(duì)Ag、NiLuminol發(fā)光體系的增敏或抑制作用，已成功用于β2受體激動(dòng)劑、皮質(zhì)醇等多種藥物或生物分子的檢測(cè)，且具有極高的靈敏度＼[17，18＼]。

化學(xué)發(fā)光靈敏度高，但方法的選擇性差。若將PLC的高效分離能力與CL的高靈敏性結(jié)合，首先采用PLC將混合物中的各組分得到有效分離，再利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)各組分進(jìn)行靈敏檢測(cè)，是一種兼顧高靈敏度與高分辨力的物質(zhì)分離與檢測(cè)新方法。本實(shí)驗(yàn)以動(dòng)物源性食品中最易殘留的4種磺胺類藥物，即磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺噻唑和磺胺二甲嘧啶為分析物，基于其對(duì)AgLuminol與NiLuminol兩化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度均具有抑制作用的性質(zhì)，建立了PLCCL檢測(cè)體系同時(shí)分離分析牛奶中4種磺胺類藥物的方法，并對(duì)兩種檢測(cè)器的性能進(jìn)行了比較，為PLC法在抗生素殘留檢測(cè)中新檢測(cè)器的開(kāi)發(fā)提供了思路。同時(shí)，對(duì)比AgLuminol與NiLuminol兩體系在檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)穩(wěn)定性等方面的不同，以期更好地與高效液相色譜聯(lián)用。

2實(shí)驗(yàn)部分

21儀器與試劑

PD15C高效液相色譜儀（島津公司 ）； IFFME型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）； B5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）； U1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析儀器公司）； N500超聲波信號(hào)發(fā)生器（上海汗諾儀器有限公司）。

磺胺脒（GD）、磺胺嘧啶（DZ）、磺胺噻唑（Z）、磺胺二甲嘧啶（MZ），純度>98%，均購(gòu)于德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司； 魯米諾（日本CI公司）； 甲醇（瑞典Oceanpa公司）等。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

GD、DZ、Z、MZ儲(chǔ)備溶液：稱取適量GD、DZ、Z、MZ標(biāo)準(zhǔn)品，用40%甲醇配制成10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。其中磺胺嘧啶配制過(guò)程中加入幾滴01 mol/L NaO溶液促進(jìn)溶解，

ymbolm@@ 4℃保存。使用時(shí)，以純水稀釋至所需濃度。

魯米諾儲(chǔ)備溶液：稱取適量魯米諾標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mol/L NaO溶液中，以超純水定容。

Ag和Ni配合物儲(chǔ)備液分別依據(jù)文獻(xiàn)＼[19，20＼]制備，＼[Ag（IO6）2＼]5

ymbolm@@ 儲(chǔ)備液濃度由其362 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε=126×104 L·mol

ymbolm@@ 1·cm

ymbolm@@ 1）測(cè)定得到。依據(jù)＼[Ni（IO6）2（O）2＼]6

ymbolm@@ 配合物在410 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε=106×105 L·mol

ymbolm@@ 1·cm

ymbolm@@ 1）測(cè)定儲(chǔ)備液中Ni配離子濃度。工作液均用超純水稀釋。

22高效液相色譜化學(xué)發(fā)光檢測(cè)裝置

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由高效液相分離裝置和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系裝置通過(guò)三通接頭和聚四氟乙烯管連接而成。液相部分由高壓輸送泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱等組成，化學(xué)發(fā)光部分由蠕動(dòng)泵、光電倍增管、檢測(cè)池等組成。實(shí)驗(yàn)通路如圖1所示：樣品由六通閥進(jìn)樣后，經(jīng)色譜柱分離、進(jìn)入檢測(cè)器，與此同時(shí)Ag或Ni與魯米諾溶液經(jīng)三通閥“5”處混合并發(fā)生反應(yīng)，流經(jīng)三通閥“6”時(shí)與樣品溶液混合，進(jìn)入檢測(cè)池檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。

色譜條件： C18色譜柱（250 mm×46 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相01%甲酸甲醇混合液，甲醇用前以微孔有機(jī)濾膜（045 μm）過(guò)濾，01%甲酸溶液用微孔水系濾膜（045 μm）過(guò)濾，超聲脫氣； 流速： 10 mL/min； 溫度：30℃； 進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。 化學(xué)發(fā)光條件：試劑流速10 mL/min； ＼[Ag＼]=14×10

ymbolm@@ 4 mol/L； ＼[Ni＼]=15×10

ymbolm@@ 5 mol/L； ＼[NaO＼]=012 mol/L； ＼[Luminol＼]=12×10

ymbolm@@ 7 mol/L； L1=3 cm， L2=2 cm。

23樣品處理

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法＼[21＼]，取樣品（50±05） mL，置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL 01% ClO4溶液，用水調(diào)節(jié)至p 2，于渦旋振蕩器振蕩提取1 min，超聲波萃取10 min，備用。LB固相萃取柱依次用3 mL甲醇和5 mL 01% ClO4 （p 2）活化，取備用液過(guò)柱，再用5 mL 超純水淋洗，抽干，用3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液，于40℃氮?dú)獯抵?2 mL，甲醇01%甲酸（1∶19，V/V）溶液補(bǔ)至10 mL，過(guò)045 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

3結(jié)果與討論

31高效液相色譜條件的優(yōu)化

初步實(shí)驗(yàn)表明，在本實(shí)驗(yàn)體系中，高效液相色譜有機(jī)相的比例對(duì)化學(xué)發(fā)光體系的影響較大，當(dāng)甲醇或乙腈的有機(jī)相的比例過(guò)大時(shí)，一方面造成PLCCL體系的基線噪聲大，且重復(fù)性較差，另一方面，由于高效液相色譜裝置與化學(xué)發(fā)光裝置通過(guò)有機(jī)玻璃三通閥連接，甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑易腐蝕玻璃，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響，故在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)控制高效液相色譜中有機(jī)相的比例。

PLC法測(cè)定磺胺類藥物的流動(dòng)相體系主要有：乙酸乙腈，甲醇磷酸鹽溶液等＼[22～26＼]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈磷酸鹽、甲醇乙酸及甲醇甲酸體系均能使4種磺胺類物質(zhì)得到較好的分離，但結(jié)合化學(xué)發(fā)光體系表明，乙腈較甲醇對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響較大，乙酸較甲酸對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的影響較大，均造成基線不穩(wěn)定、噪聲大等情況，故最終確定流動(dòng)相為甲醇01%甲酸。

進(jìn)一步研究表明，隨著甲醇比例的增大，化學(xué)發(fā)光信號(hào)的基線噪聲隨之增大。且由于磺胺脒柱上的保留較弱，為使4種檢測(cè)物質(zhì)均能在最佳時(shí)間內(nèi)出峰，采用了梯度洗脫程序。綜合考慮分離效果及化學(xué)發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定情況，采用表1梯度洗脫程序，流速10 mL/min時(shí)，4種被檢物質(zhì)均能在25 min之內(nèi)流出，且峰形良好，同時(shí)保證了對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定程度的影響最小。

32化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化

321化學(xué)發(fā)光裝置流路參數(shù)的選擇在其它條件一定的情況下，考察了試劑流速對(duì)信噪比的影響。結(jié)果表明，試劑流速在10 mL/min時(shí)信噪比為最佳。

322Ag和Ni濃度的優(yōu)化考察了50×10

ymbolm@@ 5～20×10

ymbolm@@ 4 mol/L濃度范圍內(nèi)的Ag和50×10

ymbolm@@ 6～30×10

ymbolm@@ 5 mol/L的Ni配合物濃度對(duì)光強(qiáng)及信噪比的影響（圖2）。結(jié)果表明，隨著Ag和Ni濃度增大，化學(xué)發(fā)光信號(hào)逐漸增大。但隨著信號(hào)的增強(qiáng)，信噪比隨之減小。當(dāng)Ag和Ni的濃度分別為14×10

ymbolm@@ 4 mol/L和15×10

ymbolm@@ 5 mol/L時(shí)，兩體系中被測(cè)物質(zhì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)較強(qiáng)，信噪比最大，最終確定此濃度為實(shí)驗(yàn)最佳濃度。

323Ag和Ni配合物溶液中NaO濃度的優(yōu)化分別考察Ag和Ni配合物溶液中NaO濃度（005～030 mol/L）對(duì)AgLuminol和NiLuminol化學(xué)發(fā)光體系相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，NaO濃度增加，4種磺胺類藥物對(duì)兩種體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的抑制作用增強(qiáng)，且噪聲隨之增大，當(dāng)NaO濃度為012 mol/L時(shí)，磺胺類藥物對(duì)兩種體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的抑制作用最強(qiáng)，且信號(hào)穩(wěn)定，信噪比較大（圖3）。故本實(shí)驗(yàn)最終選擇Ag和Ni配合物溶液堿度均為012 mol/L。

324魯米諾溶液濃度的優(yōu)化在50×10

ymbolm@@ 8～20×10

ymbolm@@ 7 mol/L范圍內(nèi)考察魯米諾溶液濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度及噪聲的影響（圖4）。結(jié)果表明，隨著魯米諾濃度升高，相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸增大。但當(dāng)其濃度為15×10

ymbolm@@ 7 mol/L時(shí)，基線噪聲顯著上升，造成信號(hào)不穩(wěn)定，影響峰高，且信噪比逐漸減小。故實(shí)驗(yàn)中最佳魯米諾濃度選擇為12×10

ymbolm@@ 7 mol/L。

33工作曲線、精密度與檢出限

在優(yōu)化的條件下，對(duì)磺胺類物質(zhì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，回歸方程、檢出限等參數(shù)見(jiàn)表2和表3。檢出限的峰高值為3倍的基線噪聲（/N=3）。對(duì)樣品進(jìn)行7 次平行測(cè)定，兩體系相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為10%～21%和10～19%。

34AgLuminol及NiLuminol化學(xué)發(fā)光機(jī)理推斷

Ag、Ni過(guò)碘酸配合物在堿性介質(zhì)中均為良好的氧化劑，Ag配合物氧化還原電位E=174 V＼[26＼]， 較Ni配合物的電位高，氧化能力更強(qiáng)。氧化目標(biāo)物時(shí)，Ag反應(yīng)速度較Ni配合物快，但實(shí)驗(yàn)表明，Ni配合物氧化體系更穩(wěn)定； 分別與魯米諾組成化學(xué)發(fā)光體系后，Ag體系較Ni體系更靈敏，但Ni體系檢測(cè)范圍更廣。

采用AgLuminol和NiLuminol兩化學(xué)發(fā)光體系作為PLC檢測(cè)器對(duì)磺胺類藥物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，前者更為靈敏，檢出限明顯較低，線性范圍較寬，而Ni檢測(cè)體系較前者穩(wěn)定性好。Ag與Ni的氧化能力與其濃度、NaO濃度有關(guān)，隨著配合物濃度增大，AgLuminol體系及NiLuminol體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈增強(qiáng)降低再增強(qiáng)再降低的趨勢(shì)，這可能與配合物在不同條件下配位平衡發(fā)生改變，從而影響其氧化能力有關(guān)。

據(jù)前期研究＼[27，28＼]推斷，此檢測(cè)體系可能的檢測(cè)機(jī)理為：在堿性介質(zhì)中，

作為氧化劑的Ag及Ni配合物與魯米諾組成化學(xué)發(fā)光體系，配合物氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，即為基線信號(hào)（I0）。4種磺胺類藥物經(jīng)PLC分離后進(jìn)入CL檢測(cè)體系，分別與兩化學(xué)發(fā)光體系作用，產(chǎn)生發(fā)光信號(hào)（It），且對(duì)基線強(qiáng)度均有抑制作用，相對(duì)減弱強(qiáng)度ΔI（ΔI =I0-It） 與磺胺藥物濃度C呈線性關(guān)系。Ag、Ni配合物和魯米諾及磺胺藥物的反應(yīng)均為自由基反應(yīng)，

1， GD； 2， DZ； 3， Z； 4， MZ而磺胺類藥物與Ag和Ni配合物的反應(yīng)速率較與魯米諾反應(yīng)速率慢，反應(yīng)過(guò)程中，魯米諾產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)移給磺胺類藥物一部分，從而使魯米諾的自由基減少，發(fā)光體的量減少，使得體系的發(fā)光強(qiáng)度降低。

35樣品分析和回收率實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化的條件下，對(duì)處理過(guò)的牛奶樣品進(jìn)行了測(cè)定。5份購(gòu)于超市的牛奶樣品，均未檢出4種磺胺類物質(zhì)，對(duì)照高效液相色譜紫外檢測(cè)器法，結(jié)果為未檢出。按照已優(yōu)化的條件對(duì)加標(biāo)后處理過(guò)的樣品進(jìn)行分離測(cè)定，圖5為PLCAgLuminol測(cè)定牛奶中4種磺胺類藥物色譜圖。

取牛奶樣品9份， 依次加入4種磺胺類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，每份樣品按照樣品前處理的方法進(jìn)行處理，制得低、中、高 3 種濃度水平的加標(biāo)樣品，每份樣品平行測(cè)定3次（表4和表5），計(jì)算得回收率為810%～1108%。

上述結(jié)果表明，采用Ag魯米諾和Ni魯米諾兩化學(xué)發(fā)光體系作為高效液相色譜新型檢測(cè)器，適用于食品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)，為高效液相色譜法新檢測(cè)器的開(kāi)發(fā)提供了參考。

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