基于超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對大麻植物中3種成分及化學(xué)表型分析

孫維來++鄭曉雨++趙彥彪++曾令華++高利生++鄭琿++劉耀

摘要建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/PDAQDa）同時對大麻植物中Δ9四氫大麻酚（Δ9THC）、大麻酚（CBN）和大麻二酚（CBD）進行定性與定量分析的方法。繳獲的大麻植物用甲醇超聲萃取， 采用甲醇（含0.1%甲酸）和超純水為流動相， 等度洗脫， 流速為0.2 mL/min， 經(jīng)Waters UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）分離， 利用光電二極管陣列檢測器（PDA）在220 nm波長下檢測， 并通過質(zhì)譜檢測器（QDa）對目標洗脫峰進行追蹤確證。在0.5～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)， 3種大麻酚類化合物的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系， R≥0.999； 低、中、高添加水平的平均回收率為82%～102%， 相對標準偏差（RSD）在0.4%～4.1%之間。本方法穩(wěn)定、簡便、靈敏， 能夠滿足檢測需求。根據(jù)Δ9THC、（Δ9THC+CBN）/CBD、Δ9THC/CBD或CBN/CBD表型指數(shù)， 區(qū)分不同產(chǎn)地大麻的化學(xué)表型， 為大麻植物的檢測分析和質(zhì)量控制提供了有效手段。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用； 大麻植物； Δ9四氫大麻酚； 大麻酚； 大麻二酚； 化學(xué)表型

1引 言

大麻植物是非法加工制造大麻制品的基本原料。大麻中的大麻酚類化合物是影響中樞神經(jīng)最重要的成分， 其中作用最強的精神活性物質(zhì)是Δ9四氫大麻酚（Δ9Tetrahydrocannabinol， Δ9THC）， 非精神活性的大麻二酚（Cannabidiol， CBD）可以調(diào)節(jié)Δ9THC的欣快效應(yīng)， 大麻酚（Cannabinol， CBN）具有鎮(zhèn)靜和麻醉功效＼[1，2＼]。大麻酚類類化合物的含量受遺傳、栽培環(huán)境、收獲時間、儲存條件等因素的影響 ＼[3～5＼]， 根據(jù)以下3種表型指數(shù)， 可將大麻分為毒品型大麻（Ⅰ型）和纖維型大麻（Ⅱ型）＼[2，6～9＼]：（1）依據(jù)Δ9THC含量判斷。若Δ9THC含量>0.3%， 則為毒品型大麻； 若Δ9THC含量<0.3%， 則為纖維型大麻。（2）依據(jù)表型指數(shù)計算公式（Δ9THC+CBN）/CBD判斷。若表型指數(shù)>1， 則為毒品型大麻； 若表型指數(shù)<1， 則為纖維型大麻。（3）依據(jù)兩個表型指數(shù)Δ9THC/CBD和CBN/CBD判斷。若兩個表型指數(shù)之一大于1， 則為毒品型大麻； 而如果兩個都小于1， 則為纖維型大麻。

目前， 對大麻酚類的分析檢測方法主要有氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）。氣相色譜分析過程需要對大麻樣品進行加熱衍生化的前處理， 在此過程中， 酸性大麻酚類會脫羧成為它們的中性對應(yīng)物＼[6，8＼]； 液相色譜法則不需要加熱即可直接分析測定大麻中的酸性和中性大麻酚類＼[10～13＼]， 實現(xiàn)對大麻植物中組成成分的完整分析。Happyana等采用LCMS方法對大麻植物中大麻酚類成分的分析檢測， 耗時40 min＼[1＼]。Ambach等采用HPLCDAD方法， 將時間縮短至16 min＼[10＼]。本研究的超高效液相色譜采用高壓小顆粒填料， 使分析效率和分離度顯著提高＼[14～17＼]， 同時借助QDa質(zhì)譜檢測器對目標物分子信息進一步確認。利用此技術(shù)， 成功建立了一種可在7 min內(nèi)完成對大麻植物中3種成分Δ9THC、CBN和CBD檢測的分析方法（3種大麻酚類的分子結(jié)構(gòu)式見圖1）， 從而實現(xiàn)對大麻植物化學(xué)表型的分類， 為大麻原植物類毒品犯罪的緝查及從法庭科學(xué)角度為大麻原植物類毒品犯罪的定罪量刑提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC HClass超高效液相色譜儀（Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)， 美國Waters公司）； ACQUITY光電二極管陣列檢測器（PDA， 可操作波長190～500 nm， 光學(xué)分辨率1.2 nm）和ACQUITY QDaTM質(zhì)譜檢測器（美國Waters公司）； 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； 臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）； Mettler ToledoXS105電子天平（瑞士Mettler公司）； 高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）； 0.22 μm MCE針頭式過濾器（上海島津技邇商貿(mào)有限公司）。

甲醇（美國Fisher Scientific公司）、甲酸（美國Sigma公司）為色譜純； 實驗用水均為超純水（美國Millipore公司超純水裝置制備）； Δ9THC、CBD和CBN標準品（均為1.0 mg/mL甲醇溶液， 美國Cerilliant公司），

Symbolm@@ 20℃避光保存。

混合標準溶液的配制：分別準確移取Δ9THC、CBD和CBN標準儲備液置于2 mL容量瓶中， 以甲醇稀釋并定容， 配制成0.5、1、2、5、10和20 μg/mL的系列混合標準溶液。

2.2樣品前處理

選取不同產(chǎn)地的30個大麻樣本， 經(jīng)登記備案獲批后， 研磨成均勻細粉待用。準確稱取10 mg大麻植物粉末， 置于15 mL塑料離心管中， 加入甲醇5 mL， 經(jīng)水浴超聲萃取30 min后， 以6000 r/min離心5 min， 取上清液過0.22 μm針孔濾膜， 供UPLC/PDAQDa分析。

2.3分析條件和數(shù)據(jù)分析

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）； 柱溫35℃； 樣品室溫度為20℃； 進樣體積為2 μL； 流動相為甲醇（含0.1%甲酸）水（87∶13， V/V）， 等度洗脫， 流速為0.2 mL/min； 在220 nm波長處進行檢測； 使用10%甲醇溶液清洗密封圈； 運行時間7 min。

質(zhì)譜條件：Waters質(zhì)譜檢測器QDa， 電噴霧離子源， 掃描質(zhì)量范圍為m/z 100～500 Da。從超高效液相色譜柱流出來的樣品直接進入質(zhì)譜分析， 正離子掃描， 采樣速率10點/s， 毛細管電壓為0.8 kV， 錐孔電壓為30 V， 探頭溫度為600℃。

利用Waters EmpowerTM3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到3種大麻酚類化合物的含量數(shù)據(jù)， 采用SIMCAP11.5 （Umetrics AB， Umea， Sweden）軟件作主成分分析， 通過得分圖獲得不同產(chǎn)地大麻樣本的分型信息。

3結(jié)果與討論

3.1樣品前處理條件的優(yōu)化

為進一步優(yōu)化前處理條件， 實驗選用甲醇作為提取劑， 以超聲方式進行萃取， 考察了不同萃取時間（15、 30和45 min）和萃取次數(shù)（1和2次）對大麻酚類提取效率（峰面積）的影響。最終采用30 min超聲1次的條件， 第1次提取后， 各目標物峰面積均達到兩次提取各目標物峰面積之和的95%以上。

3.2 UPLC/PDAQDa條件的選擇

為改善峰形， 本實驗嘗試在甲醇中加入0.1%甲酸溶液， 采用甲醇水（87∶13， V/V）等度洗脫時， 不僅能達到較好的分離效果， 且分離時間較短， 目標分析物可在4 min內(nèi)流出色譜柱。為避免天然產(chǎn)物中組分眾多可能存在的樣品間干擾， 將分離檢測時間延長至7min。采用優(yōu)化后的實驗條件， 對大麻混合標準溶液及大麻植物樣品溶液檢測， 3種目標大麻酚類化合物的色譜圖見圖2。

3.3UPLC方法學(xué)驗證

3.3.1方法的專屬性在方法建立期間， 通過優(yōu)化峰間距并增大分離度， 保證峰的專屬性。CBD、CBN和Δ9THC的保留時間分別為1.1、1.6和1.9 min， 各成分與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.6， 拖尾因子在1.16～1.23之間。同時， QDa檢測器作為光學(xué)數(shù)據(jù)的補充， 具有更高質(zhì)量的定性質(zhì)譜數(shù)據(jù)， 可對組分進行進一步確證。在正離子模式下掃描， 根據(jù)對混合標準溶液的碎片離子質(zhì)譜圖分析， Δ9THC、CBN和CBD的m/z分別為315、311和315。分別在m/z 315和311下提取離子流質(zhì)譜圖， 對大麻樣本的洗脫峰進行比對分析。圖3和圖4是利用質(zhì)譜檢測器QDa對Δ9THC、CBN和CBD各峰的追蹤確證結(jié)果， 與PDA檢測分析一致， 且無基質(zhì)干擾。在選定實驗條件下， 所測的3個大麻酚類組分與其它組分完全分離， 滿足含量測定要求。

3.3.2線性關(guān)系、檢出限和定量限配制3種大麻酚類化合物濃度分別為0.5～20.0 μg/mL的系列混合標準溶液， 按照上述條件進行檢測分析。以各分析物的峰面積Y為縱坐標， 濃度X（μg/mL）為橫坐標， 繪制標準曲線， 進行線性回歸分析。采用向空白樣品中逐級降低加標濃度的方法確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）， 按照信噪比S/N≥3和S/N≥10分別計算檢出限和定量限。3種大麻酚類化合物的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、定量限及檢出限見表1， 在0.5～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)， 3種大麻酚類化合物線性關(guān)系良好（R≥0.999）， 可滿足定量分析的要求。

3.3.3準確度和精密度向已知含量的大麻樣品中分別添加低、中、高濃度水平的混合標準品，

每個濃度水平做6次平行實驗， 進行加標回收實驗， 評價方法的準確度。同時， 對每個濃度水平在一天內(nèi)重復(fù)測定6次， 連續(xù)測定6天， 評價方法的日內(nèi)精密度（Intraday precision）和日間精密度（Interday precision）。由如表2可知， 3種大麻酚類化合物的加標回收率范圍為82%～102%， 相對標準偏差（RSD）均小于5%， 表明本方法精確可靠， 重復(fù)性良好。

3.4實際樣品分析

應(yīng)用本方法測定不同產(chǎn)地的大麻植物樣本中 3種大麻酚類化合物的含量， 依據(jù)不同的表型指數(shù)計算公式對樣本進行化學(xué)表型劃分， 結(jié)果見表3。

受遺傳特征、栽培環(huán)境、收獲時間、儲存條件等因素的影響， 大麻植物樣本中3種大麻酚類化合物的含量有很大差異。在許多國家， 大麻種植被認為是非法的， 而在允許種植的國家中， 需要測試栽培品種中精神活性物質(zhì)Δ9THC的含量需低于法律允許下限。在歐洲， 允許種植的大麻， 其Δ9THC最大含量為干物質(zhì)重量的0.2%或0.3%， 以此作為國家規(guī)定限度＼[11＼]。本實驗測定的大麻植物樣本中Δ9THC、CBN和CBD含量變化范圍分別在0.026%～1.44%、0.006%～3.33%和0.006%～3.84%之間。根據(jù)含量結(jié)果判斷， 表3中有12個大麻樣本的Δ9THC含量大于0.3%， 可歸為毒品型大麻。

據(jù)文獻＼[4＼]報道， 由于對熱和光的不穩(wěn)定性， 大麻植物樣品中的Δ9THC濃度會隨時間延長而降低。考慮到檢材中大麻酚類受環(huán)境等因素造成的含量變化， 可以3種大麻酚類化合物的相對組成含量判斷化學(xué)表型。以表型指數(shù)（2）進行樣本分型， 有17個樣本被歸為毒品型， 其中有9個樣本的Δ9THC含量均低于0.3%， 但仍歸為毒品型大麻。表型指數(shù)（3）是對表型指數(shù)（2）的拆分， 據(jù)此分型， 得到判斷與表型指數(shù)（2）的結(jié)果一致。

3.5基于主成分分析的分型研究

主成分分析（Principal component analysis， PCA）通過對數(shù)據(jù)進行降維處理后， 可以直觀顯示各組樣品的差異＼[18～20＼]。以大麻樣本中Δ9THC、CBN、CBD的含量為變量， 作主成分（PCA）分析， 將黑龍江、內(nèi)蒙古、新疆和陜西4個產(chǎn)地大麻樣本的30組含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP軟件， 將數(shù)據(jù)標準化后進行PCA分析， 3種大麻酚類化合物的累計貢獻率達到94.4%， 所得的載荷圖如圖5所示， 不同產(chǎn)地的大麻樣本被分為2類即毒品型和纖維型大麻， 按照3種大麻酚類化合物的影響進行分類， 獲得與表型指數(shù)（1）吻合的分型結(jié)果。

4結(jié) 論

本研究采用光電二極管陣列（PDA）檢測器與質(zhì)譜檢測（QDa）技術(shù)聯(lián)用， 建立了同時測定大麻植物中3種大麻酚類化合物含量的超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析方法， 可對3種大麻酚類實現(xiàn)色譜的快速分離及質(zhì)譜的追蹤確證。利用本方法對不同產(chǎn)地的大麻植物樣本進行含量分析， 并對利用不同的表型指數(shù)和主成分分析判斷大麻植物的化學(xué)表型進行了探討， 為監(jiān)測和打擊毒品型大麻的非法種植提供了高通量快速檢測方法和判斷依據(jù)。

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