固相萃取定量核磁共振波譜法測(cè)定板藍(lán)根飲片中的表告依春

劉曉婷++禹珊++袁銘++郭強(qiáng)勝++龔燦++許旭

摘要建立了固相萃?。⊿PE）定量核磁共振波譜（qNMR）技術(shù)測(cè)定板藍(lán)根飲片中有效成分表告依春含量的方法。樣品用水超聲提取兩次，采用SPE對(duì)提取液進(jìn)行富集濃縮，用qNMR測(cè)定表告依春的含量?？疾炝藰悠奉A(yù)處理和qNMR實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，選擇氘代二甲基亞砜為溶劑，用基準(zhǔn)試劑鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定的2，3，5三碘苯甲酸為內(nèi)標(biāo)，選擇脈沖寬度P1=14.1 μs，延遲時(shí)間d1=5 s，掃描次數(shù)NS=256為qNMR定量測(cè)定表告依春的最佳實(shí)驗(yàn)條件。表告依春的定量峰為δ 5.365～5.399 （H7b， d，1H）。結(jié)果表明，日內(nèi)測(cè)量精密度（RSD）為0.5%，日間精密度為0.8%，表告依春與三碘苯甲酸峰面積比與質(zhì)量比的零截距標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.9991，且斜率與理論值相符。根據(jù)響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法確定此法測(cè)定表告依春的檢測(cè)限（LOD）為0.05 mg/g；定量限（LOQ， S/N ≥ 150）為0.19 mg/g。包括樣品提取過(guò)程的表告依春的回收率為97.4%～101.7%。采用本方法測(cè)定板藍(lán)根飲片中的表告依春的含量為<0.19～1.26 mg/g。研究結(jié)果表明，采用SPE進(jìn)行富集，擴(kuò)大了qNMR的應(yīng)用范圍，可用于低含量復(fù)雜樣品的定量分析。

關(guān)鍵詞定量核磁共振波譜法； 固相萃?。?表告依春； 板藍(lán)根

1引 言

定量核磁共振波譜法（qNMR）不依賴(lài)于被測(cè)物的高純度標(biāo)準(zhǔn)品、不破壞樣品，僅需樣品組分有1個(gè)或1組互不干擾的特征NMR峰，依據(jù)信號(hào)峰的面積正比于產(chǎn)生該共振峰的質(zhì)子數(shù)，即可進(jìn)行定量分析，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)＼[1～4＼]。近年來(lái)qNMR方法被廣泛用于新藥研制＼[1，5，6＼]、中藥＼[7，8＼]與化學(xué)藥＼[9～11＼]的質(zhì)量控制、代謝組學(xué)＼[12～14＼]等研究。繼美國(guó)藥典（19版）、英國(guó)藥典（1975年版）、日本藥局方（12版）和歐洲藥典（第5版）之后，中國(guó)藥典從2010版開(kāi)始，將此技術(shù)作為法定標(biāo)準(zhǔn)收載于通則（附錄）中＼[15，16＼]。

板藍(lán)根是十字花科草本植物菘藍(lán)（Isatis Indigotica Fort）的干燥根，被載入中國(guó)藥典一部，廣泛用于流行性感冒、乙肝等病毒性疾病的防治，具有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫等作用＼[17，18＼]。研究表明，其水提物、醇提物、總生物堿具有較強(qiáng)抗流感病毒作用，其中表告依春被認(rèn)為是抗流感病毒的主要有效成分之一＼[19＼]。目前監(jiān)測(cè)板藍(lán)根中表告依春的主要方法為HPLC法＼[20～23＼]，但這些方法都需要表告依春標(biāo)準(zhǔn)品做為對(duì)照品，成本較高。

采用qNMR方法測(cè)定中藥中有效成分常存在靈敏度低和干擾強(qiáng)的問(wèn)題。Yang等＼[8＼]通過(guò)加入氘代三氟乙酸，將原來(lái)互相干擾的定量峰分開(kāi)，來(lái)消除干擾。禹珊等＼[24＼]將提取的樣品旋干后溶于少量氘代試劑，通過(guò)提高濃度來(lái)改善靈敏度。固相萃?。⊿PE）作為一種有效的樣品預(yù)處理技術(shù)，具有濃縮（富集）和樣品凈化功能，操作簡(jiǎn)便＼[25，26＼]。將SPE與qNMR結(jié)合，有助于解決靈敏度低和干擾強(qiáng)的問(wèn)題。Pieri等＼[27＼]將樣品提取物用C18SPE柱凈化富集后，以氘代DMSO洗脫，用qNMR內(nèi)標(biāo)法測(cè)定了朝鮮薊葉提取物中的萊薊苦素，并進(jìn)行方法認(rèn)證（沒(méi)有評(píng)價(jià)SPE回收率）。Li等＼[28＼]將收集的42種黨參樣品提取后，經(jīng)C18SPE柱處理，用qNMR測(cè)定了四種生物堿，但在低濃度測(cè)定回收率時(shí)的精密度較差。Moura等＼[29＼]將加入內(nèi)標(biāo)的樣品溶液用C18SPE柱凈化富集后，用qNMR測(cè)定環(huán)境和生物樣品中的βN甲基氨基L丙氨酸。其它應(yīng)用還包括測(cè)定飲茶后人體尿液中的代謝物＼[30＼]、污染水中的原油和正己烷＼[31＼]、地下水中的污染物＼[32＼]等。

本研究采用SPE技術(shù)凈化和富集板藍(lán)根飲片提取物，建立SPEqNMR測(cè)定表告依春含量的方法。研究結(jié)果表明，采用SPE進(jìn)行富集，擴(kuò)大了qNMR的應(yīng)用范圍，可用于低含量復(fù)雜樣品的定量分析。本方法在實(shí)際測(cè)定樣品時(shí)無(wú)需對(duì)照品。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Bruker AVANCE III 500 MHz核磁共振譜儀（德國(guó)Bruker公司）；U3000高效液相色譜儀（美國(guó)ThermoFisher公司）；M2p高精密天平（精度0.001 mg， 德國(guó)Startoriu公司）；AB204N精密天平（精度0.1 mg， 上海世義精密儀器有限公司）；PS20超聲波清洗儀（東莞潔康公司）；800B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DC12氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。PolySery MCX固相萃取柱（500 mg，6 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；Kromasil高效液相色譜C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm， 瑞典Akzo Nobel公司）。

表告依春（Epigoitrin，阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司）；2，3，5三碘苯甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀（基準(zhǔn)物質(zhì)，99.95%～100.05%，上海泰坦科技股份有限公司）；氘代二甲基亞砜（d6DMSO，99.9%）和氘代硫酸（99.5%）均為Cambridge Isotope Lab. Inc.產(chǎn)品；甲醇（HPLC級(jí)，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司）；正己烷、乙酸、醋酸銨為國(guó)產(chǎn)分析純；磷酸、氨水為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

板藍(lán)根飲片的3個(gè)樣品均購(gòu)自本地中藥房，藥材產(chǎn)地分別為甘肅、江蘇和安徽。其中樣品3有蟲(chóng)蛀現(xiàn)象。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品處理將板藍(lán)根飲片磨碎，過(guò)篩，精確稱(chēng)取1 g左右，加入50 mL水，稱(chēng)重，60℃超聲提取45min，放冷后再稱(chēng)重，加水補(bǔ)充損失質(zhì)量，4000 r/min離心5 min，收集上清液。殘?jiān)偌尤?0 mL水，重復(fù)上述提取步驟。合并兩次上清液，過(guò)濾并棄去初濾液，收集50 mL續(xù)濾液。

依次用6 mL甲醇、6 mL蒸餾水、6 mL乙酸乙酸銨緩沖溶液（pH 4.7）活化PolySery MCX固相萃取柱（500 mg，6 mL）。將50 mL上述續(xù)濾液過(guò)柱，流速控制在3 s滴加1滴。用6 mL正己烷分3次淋洗柱子，每次2 mL。最后用6 mL 氨水甲醇（5∶95， V/V）溶液洗脫，洗脫液用N2吹至約0.1 mL，加入約0.4 mL氘代DMSO，再加入準(zhǔn)確稱(chēng)重的2，3，5三碘苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)，混勻后轉(zhuǎn)移至核磁管中。

2.2.2HPLC檢測(cè)條件參考2015版中國(guó)藥典＼[17＼]，選擇用于考察SPE操作方法的HPLC檢測(cè)條件為：Kromasil 1005C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇0.02% H3PO4（7∶93， V/V）；流速1.0 mL/min； 進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。

2.2.3定量核磁共振測(cè)定核磁共振（NMR）數(shù)據(jù)采集條件：脈沖序列zg30。脈沖寬度（P1）14.1 μs，延遲時(shí)間（D1）5 s，掃描次數(shù)（NS）256次，譜寬（SW）20 ppm，中心頻率（O1）3090 Hz，采樣時(shí)間（AQ） 3.17 s，室溫（約25℃）條件下測(cè)定NMR圖譜。積分前先調(diào)平NMR基線，選擇對(duì)應(yīng)的峰的積分區(qū)間，每個(gè)峰積分3～5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） < 1%時(shí)取平均值。采用中國(guó)藥典的絕對(duì)定量公式計(jì)算待測(cè)組分的含量Ws＼[15，16＼]：

Ws = Wr×（As/Ar）×（Es/Er）（1）

其中， Wr 為稱(chēng)取得內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量， As 和Ar 分別為供試品和內(nèi)標(biāo)峰的峰面積， Es 和Er 分別為供試品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子當(dāng)量重量（質(zhì)量）。

3結(jié)果與討論

3.1樣品制備方法的選擇

3.1.1樣品提取條件的優(yōu)化文獻(xiàn)報(bào)道的板藍(lán)根藥材（飲片）的提取方法主要有回流法＼[33＼]、煎煮法＼[34＼]和超聲波輔助提取法＼[20～23＼]，其中應(yīng)用最廣的是超聲波輔助提取法。本研究采用2.2.2節(jié)的HPLC檢測(cè)條件，考察了提取條件對(duì)SPE的影響。

比較了煎煮和超聲提取兩種方法對(duì)表告依春的提取效率。煎煮法采用中國(guó)藥典2015版一部板藍(lán)根供試品溶液的制備方法＼[17＼]，重復(fù)提取兩次。超聲提取法按照2.2.1節(jié)的方法提取。用HPLC測(cè)定煎煮提取液中表告依春的峰面積，結(jié)果表明，均明顯小于超聲提取液的峰面積，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取方法。

取超聲提取兩次的殘?jiān)?，再次超聲提取，提取液中表告依春的峰面積約為第一次提取的1/70。因此，本實(shí)驗(yàn)選定的提取次數(shù)為2次。

選擇超聲波提取方法， 考察了超聲時(shí)間（10～120 min）對(duì)表告依春的提取情況的影響。超聲提取45 min時(shí)，表告依春峰面積較高，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲提取時(shí)間，響應(yīng)值差異不大。故超聲提取時(shí)間選擇45 min。

3.1.2固相萃取條件的選擇表告依春溶解在水中呈弱堿性。比較了MCX柱（混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱）、C18柱兩種SPE柱的效果。C18柱在上樣和淋洗過(guò)程中均有大量表告依春流出，而MCX 柱對(duì)表告依春有較好保留，因此選用 MCX 固相萃取柱。

分別采用 100 mmol/L乙酸（pH 2.9）、2.5 mmol/L乙酸（pH 3.7）和乙酸乙酸銨緩沖溶液（pH 4.7）活化MCX 固相萃取柱。使用前兩種溶液時(shí)，表告依春在上樣時(shí)都會(huì)流出，而乙酸乙酸銨緩沖溶液能使表告依春在上樣時(shí)完全保留在柱上，所以選擇乙酸乙酸銨緩沖溶液活化柱子。將50 mL續(xù)濾液過(guò)柱，取第5～50 mL流出液檢測(cè)，均未檢測(cè)到表告依春。

考察甲酸0.1 mol/L乙酸（1∶1， V/V）、乙酸乙酸銨緩沖溶液、水、冰水、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氫呋喃、正己烷、異丙醇和無(wú)水乙醚對(duì)MCX 柱子淋洗的影響。結(jié)果表明，使用冰水和正己烷時(shí)，表告依春的保留效果最好，其中使用正己烷時(shí)完全沒(méi)有漏出。故選擇使用正己烷為淋洗劑。

考察了甲醇5%氨水（1∶1， V/V）、甲醇氨水（95∶5， V/V）、氨水對(duì)表告依春的洗脫效果，最終選擇甲醇氨水（95∶5， V/V）溶液為洗脫劑，用量為6 mL。

綜上所述，固相萃取的最終條件為：6 mL甲醇、6 mL蒸餾水、6 mL乙酸乙酸銨緩沖溶液（pH 4.7） 活化；板藍(lán)根續(xù)濾液50 mL上樣；用6 mL正己烷淋洗；6 mL 氨水甲醇（5∶95， V/V）洗脫。

3.2氘代試劑的選擇

將得到的6 mL洗脫液用氮?dú)獯蹈?，分別考察了氘代二甲基亞砜和氘代氯仿對(duì)所得產(chǎn)物的溶解性，結(jié)果表明，氘代二甲基亞砜能很好地溶解產(chǎn)物，而氘代氯仿并不能夠完全溶解產(chǎn)物。所以選擇氘代二甲基亞砜作為溶劑。

3.3內(nèi)標(biāo)物的選擇

除2，3，5三碘苯甲酸外，其它常用內(nèi)標(biāo)物，如鄰苯二甲酸氫鉀、順丁烯二酸、反丁烯二酸、對(duì)苯二甲醛、苯甲酸等的部分峰均與表告依春樣品峰有重疊，因此選擇2，3，5三碘苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)物。

3.4信號(hào)歸屬及定量峰的選擇

3.4.1NMR峰歸屬用2.2.3節(jié)的方法分別測(cè)定表告依春（）、內(nèi)標(biāo)以及兩者混合物的NMR譜圖。參考文獻(xiàn)＼[35＼]，歸屬混合物（圖1C）中的各信號(hào)峰， 表告依春峰： δ 3.818～3.857 （H4， t，1H）和δ 3.431～3.396 （H4′，t，1H）； δ 5.310～5.324 （H5， q，1H）； δ 5.343～5.356 （H7a（順式）， d，1H）； δ 5.400～5.434 （H7b（反式）， d，1H）； δ 5.950～6.018 （H6， m，1H）。2，3，5三碘苯甲酸峰： δ 7.748～7.746 （d，1H）； δ 8.333～8.335 （d，1H）。

3.4.2定量峰確認(rèn)測(cè)定樣品1的NMR圖譜，與樣品內(nèi)標(biāo)混合物圖譜（圖2C）比較。此時(shí)，內(nèi)標(biāo)峰位置由δ 7.748～7.746 （d，1H）和δ 8.333～8.335 （d，1H）移至δ 7.313～7.314 （d，1H）和δ 7.994 （d，1H），發(fā)生了明顯變化。考慮到洗脫液為堿性，在樣品中加入氘代硫酸后再測(cè)試NMR譜圖，發(fā)現(xiàn)加入少量氘代硫酸即可以使化學(xué)位移回復(fù)到原來(lái)位置，單獨(dú)采用標(biāo)樣也有同樣現(xiàn)象，從而確認(rèn)這種變化的原因是SPE洗脫劑含有的氨水成分，提高了NMR待測(cè)樣品溶液pH值，造成NMR峰的偏移。Fan等＼[36＼]也用氘代鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值，改變特征峰的化學(xué)位移。考慮樣品NMR譜在δ 7.9～8.0化學(xué)位移處基線較平坦（圖2B）， δ 7.994（d，1H）與樣品峰沒(méi)有重疊，所以選擇其為內(nèi)標(biāo)峰（圖2C中信噪比較高的峰1）。在此實(shí)驗(yàn)條件下，NMR峰分離完全，可以滿(mǎn)足qNMR測(cè)定要求，后續(xù)的定量實(shí)驗(yàn)中未用氘代硫酸調(diào)節(jié)pH值。

因此，選擇內(nèi)標(biāo)峰δ 7.994（d，1H）對(duì)應(yīng)的積分范圍為δ 7.962～8.022 （圖2C中IS1），定量峰δ 5.365～5.399（d，1H）對(duì)應(yīng)的積分范圍為δ 5.339～5.420 （圖2C中的1）。積分范圍的選擇方法為在對(duì)應(yīng)質(zhì)子峰起止處放大圖譜，取峰形輪廓線與完全水平的基線剛好重合處為起止點(diǎn)，并固定每組峰的積分范圍。

3.4.3NMR實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響 分別考察了脈沖寬度P1、延遲時(shí)間d1和掃描次數(shù)NS對(duì)積分面積的影響。當(dāng)P1≥14.1 μs， d1=5 s， NS≥256時(shí)，信噪比可以達(dá)到定量要求（S/N≥150），且Ar與As趨于穩(wěn)定。故選定核磁參數(shù)P1=14.1 μs， d1=5 s， NS=256。3.4.4對(duì)2，3，5三碘苯甲酸和表告依春純品的含

量校正在2.2.2節(jié)實(shí)驗(yàn)條件下，以氘代DMSO為溶劑，基準(zhǔn)物質(zhì)鄰苯二甲酸氫鉀的NMR峰δ 7.493～7.511 （H4，5，dd，2H）與三碘苯甲酸和鄰苯二甲酸氫鉀純品的NMR定量峰互不干擾。采用qNMR絕對(duì)定量模式對(duì)兩種純品進(jìn)行含量校正。重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，取平均值。實(shí)驗(yàn)測(cè)得2，3，5三碘苯甲酸含量為99.94%，RSD為0.6%；表告依春純品含量為97.53%，RSD為0.9%。以下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中這兩種化合物使用校正后的含量值。

3.5方法驗(yàn)證

3.5.1精密度取樣品1，按照2.2.1節(jié)樣品預(yù)處理方法制成待測(cè)樣品，按照2.2.3節(jié)方法測(cè)得日內(nèi)精密度（RSD）為0.5%（n=6），日間RSD為0.8%（n=6），表明qNMR較好的精密度以及樣品良好的穩(wěn)定性。

3.5.2線性與分析性能稱(chēng)取10組表告依春樣品（0.5805～1.215 mg）和約1.5 mg內(nèi)標(biāo)，超聲溶于0.5 mL氘代DMSO中，按2.2節(jié)方法測(cè)定NMR譜圖。以表告依春與三碘苯甲酸質(zhì)量比為橫坐標(biāo)（x），兩者的峰面積比為縱坐標(biāo)（y），線性擬合。零截距標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3.7785x， r=0.9991 （不過(guò)原點(diǎn)的擬合方程為： y=3.7734x+0.0036， r=0.9991。根據(jù)公式（1）計(jì)算表告依春線性曲線的理論斜率（Es/Er）為3.8691，而實(shí)驗(yàn)中得到的斜率與其接近，說(shuō)明可以采用絕對(duì)定量公式（1）計(jì)算表告依春的含量。

3.5.3檢出限和定量限根據(jù)2015版中國(guó)藥典四部通則＼[15＼]，qNMR的檢出限LOD和定量限LOQ由基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法的公式LOD= 3.3 σ/S，（LOQ）= 10σ/S 得到，式中σ在本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算。表告依春的LOD=0.029 mg， LOQ=0.088 mg。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中內(nèi)標(biāo)的用量1.5 mg以及溶劑0.5 mL，計(jì)算得qNMR測(cè)定表告依春的LOD=0.09 g/L，LOQ=0.26 g/L?？紤]到信噪比對(duì)qNMR的重復(fù)性影響較大，英國(guó)藥典＼[37＼]對(duì)核磁定量方法要求信噪比S/N≥150，文獻(xiàn)＼[28＼]中較低信噪比時(shí)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的精密度RSD>2%，因此將其作為qNMR確定LOQ的指標(biāo)是合理的，以樣品1的NMR譜峰信噪比，根據(jù)公式（1）計(jì)算得表告依春的LOQ=0.37 g/L。取兩者均滿(mǎn)足的較大值，可以認(rèn)為本方法qNMR對(duì)表告依春的LOQ=0.37 g/L，LOD=0.09 g/L。按照本實(shí)驗(yàn)中約0.5 mL的溶劑量和約1 g板藍(lán)根的樣品量，可以算出本SPEqNMR法測(cè)定板藍(lán)根中表告依春含量的LOD=0.05 mg/g；LOQ=0.19 mg/g，相當(dāng)于0.019% （w/w）。因此，通過(guò)SPE濃縮和富集分析物，顯著提高了qNMR檢測(cè)的靈敏度。

3.5.4表告依春的回收率分別準(zhǔn)確稱(chēng)取4份各約1 g已知表告依春含量的樣品，在每份樣品中均加入準(zhǔn)確稱(chēng)定的表告依春，用2.2節(jié)的方法提取并測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，表告依春回收率為97.42%～101.70% ，RSD=2.0% （n=4）。

3.6樣品分析

實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。樣品1和樣品2符合2015版中國(guó)藥典規(guī)定板藍(lán)根飲片中的表告依春的含量測(cè)定不低于0.02%的要求＼[17＼]，樣品3可能是蟲(chóng)蛀的影響其含量偏低，不能滿(mǎn)足藥典的要求。

4結(jié)論

建立了固相萃取qNMR測(cè)定板藍(lán)根飲片中的表告依春含量的方法，本方法精密度好，線性評(píng)價(jià)表明，可以直接采用絕對(duì)定量公式計(jì)算含量，定量分析結(jié)果準(zhǔn)確。本方法將SPE與qNMR結(jié)合，通過(guò)凈化樣品和濃縮待測(cè)組分，提高了qNMR的定量分析靈敏度，有利于擴(kuò)展qNMR的應(yīng)用范圍。

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