蓼藍(lán)組織培養(yǎng)再生體系的建立

周江波 陳家鴻 李會(huì)會(huì)

摘要[目的]建立蓼藍(lán)組織培養(yǎng)再生體系。[方法]以半野生蓼藍(lán)種子、幼葉和莖段為外植體，探討不同濃度植物激素配比的培養(yǎng)基對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、繼代、分化及生根的影響。[結(jié)果]以蓼藍(lán)莖段為外植體進(jìn)行組培是適宜的；誘導(dǎo)和繼代最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，平均誘導(dǎo)率可達(dá)73.33%；分化最佳培養(yǎng)基為6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L，平均分化率可達(dá)5167%；生根適宜的培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，生根后移栽成活率達(dá)100%。[結(jié)論]該研究為優(yōu)良蓼藍(lán)快速繁殖提供了新的途徑，并為其種質(zhì)資源的保存與利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞蓼藍(lán)；組織培養(yǎng)；莖段；愈傷組織

中圖分類號(hào)S574文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）19-0123-03

Establishment of Regeneration System for Tissue Culture of Polygonum tinctorium

ZHOU Jiangbo， CHEN Jiahong， LI Huihui

（College of Environment and Life Science， Kaili University， Kaili， Guizhou 556011）

Abstract[Objective] To establish regeneration system for tissue culture of Polygonum tinctorium. [Method]Its seeds， young leaves and stems were used as explants to explore influences of media with different concentration hormone on callus induction， subculture， differentiation and rooting. [Result] Stems of P. tinctorium were ideal explants. The optimum medium for callus induction and subculture was MS+6BA 10 mg/L+2，4D 2.0 mg/L， the corresponding average induction rate was 73.33%. The optimum medium for callus differentiation was 6BA 10 mg/L +NAA 0.5 mg/L， the corresponding average differentiation rate was 51.67%. The optimum medium for seedlings rooting was 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L. The surviving rate after transplanting attained to 100%. [Conclusion]The study provided a new way for P. tinctorium rapid reproduction，and provided theoretical basis for the preservation and utilization of germplasm resources.

Key wordsPolygonum tinctorium；Tissue culture；Stem；Callus

蓼藍(lán)（Polygonum tinctorium），亦略稱為藍(lán)或靛青，為蓼科蓼屬一年生草本植物，是自然界中含靛藍(lán)較多的一種植物。蓼藍(lán)被認(rèn)為起源于印度，后被傳入中國(guó)、日本及歐洲，被廣泛用于天然植物染色[1-2]。目前蓼藍(lán)在我國(guó)南北地區(qū)均有分布，呈零星栽培或半野生狀態(tài)[3]。至今蓼藍(lán)仍是一些地區(qū)主要天然植物藍(lán)色染料的原材料[4-5]，苗、侗、瑤、布依等少數(shù)民族仍在大量使用蓼藍(lán)加工扎染[6]和蠟染民族工藝品[7] 等。另外，蓼藍(lán)還是常用的藥用植物，蓼藍(lán)種子和葉的甲醇-乙酸乙酯提取物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性和抗癌效應(yīng)[8]。Yu等[9]報(bào)道了蓼藍(lán)發(fā)酵的葉片提取物對(duì)HIV-1和HSV-1病毒有很強(qiáng)的抗性；Heo等[10]通過(guò)體外試驗(yàn)揭示了蓼藍(lán)提取物可有效地抑制癌細(xì)胞的增殖；近年，韓國(guó)研究人員Park等[11]研究表明，經(jīng)過(guò)超亞處理的蓼藍(lán)葉片有機(jī)溶劑提取物對(duì)人體的血清白蛋白有更高的抗氧化性和結(jié)合能力。

為保護(hù)蓼藍(lán)優(yōu)異種質(zhì)資源，滿足人們對(duì)其優(yōu)質(zhì)栽培及生產(chǎn)實(shí)踐的需求，探究蓼藍(lán)高效組織培養(yǎng)再生體系是有效途徑之一。目前國(guó)內(nèi)外已有對(duì)蓼藍(lán)化學(xué)成分、生理功效及藥理作用分析等方面的報(bào)道，但對(duì)其組織培養(yǎng)再生體系的建立鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究建立了蓼藍(lán)組織培養(yǎng)再生體系，以期為優(yōu)良蓼藍(lán)快速繁殖提供新的途徑，為其種質(zhì)資源的保存與利用提供依據(jù)，并對(duì)保留傳承和保護(hù)民族地區(qū)天然植物染料民族傳統(tǒng)工藝起到積極作用。

1材料與方法

1.1材料及消毒處理

供試蓼藍(lán)取自貴州省凱里經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)覺(jué)雅村山坡地（107.97° E，26.59° N），為自然生長(zhǎng)的半野生植株。分別選用蓼藍(lán)不同時(shí)期種子、幼葉和莖段作為外植體，接種前將外植體在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上用蒸餾水沖洗干凈，在濾紙上瀝干，將其轉(zhuǎn)移至已滅菌的50 mL離心管中，用75%乙醇消毒2 min，無(wú)菌水清洗3次，再將3種外植體分別用0.1%的HgCl2溶液消毒處理10～12 min，無(wú)菌水沖洗5次，轉(zhuǎn)移至濾紙上瀝干，待接種。

1.2培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同種類和質(zhì)量濃度的植物激素，篩選蓼藍(lán)組織培養(yǎng)生長(zhǎng)各階段的最佳培養(yǎng)基。誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基中添加不同配比的6-BA、2，4-D，6-BA質(zhì)量濃度分別設(shè)為0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L；2，4-D質(zhì)量濃度分別設(shè)為0、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L，培養(yǎng)基pH 5.8，廣口瓶中接種后于培養(yǎng)室暗培養(yǎng)，室內(nèi)培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，濕度為50%～60%。分化培養(yǎng)基中的植物激素用6-BA和NAA組合，6-BA質(zhì)量濃度分別設(shè)為1.0、2.0、3.0 mg/L；NAA質(zhì)量濃度分別設(shè)為0、0.5、1.0 mg/L，光照周期為16 h/8 h（光/暗）。每個(gè)處理接種20個(gè)（塊），3次重復(fù)。

1.3生根和移栽

蓼藍(lán)的生根培養(yǎng)，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0 mg/L的NAA。待生根至1～2 cm后煉苗1～2 d，移栽至濕潤(rùn)的營(yíng)養(yǎng)土缽中生長(zhǎng)。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同外植體對(duì)蓼藍(lán)誘導(dǎo)愈傷組織的影響

對(duì)蓼藍(lán)種子、幼葉和莖段3種外植體分別消毒處理后，將其接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察各自的長(zhǎng)勢(shì)。有些種子萌發(fā)出芽（圖1a），難以誘導(dǎo)出愈傷組織；幼葉誘導(dǎo)的愈傷組織較少且白色疏松（圖1b）；6 d后有些莖段兩端開(kāi)始膨大，生長(zhǎng)成紡錘體形狀，逐漸生長(zhǎng)形成淡黃色致密的愈傷組織，莖段誘導(dǎo)的愈傷有些呈黃色致密結(jié)構(gòu)，有些部位呈淺綠色，長(zhǎng)勢(shì)較為緩慢（圖1c）。對(duì)外植體消毒處理相比較，種子顆粒過(guò)小，有殼，來(lái)自半野生植株的種子無(wú)菌操作污染率相對(duì)較高；幼葉取材時(shí)效性強(qiáng)；而莖段雖然誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，但愈傷組織活力較好，且莖段消毒處理容易操作，效果較好。可見(jiàn)莖段是蓼藍(lán)誘導(dǎo)愈傷組織合適的外植體。

2.2不同培養(yǎng)基配比對(duì)蓼藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表1可看出，植物生長(zhǎng)激素6-BA和2，4-D都對(duì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)起促進(jìn)作用，2，4-D濃度對(duì)誘導(dǎo)效果有更大的影響，愈傷組織在添加2，4-D的培養(yǎng)基上發(fā)生得快，最早在誘導(dǎo)6 d后莖段兩端開(kāi)始出現(xiàn)愈傷。不添加2，4-D時(shí)，莖段幾乎難以誘導(dǎo)出愈傷，而是形成不定芽。當(dāng)2，4-D濃度為0～20 mg/L時(shí)，其對(duì)莖段愈傷組織的發(fā)生起促進(jìn)作用，同時(shí)出芽率有所下降。莖段在培養(yǎng)基9（MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L）中誘導(dǎo)培養(yǎng)，平均誘導(dǎo)率達(dá)到最大（7333%），且與其他培養(yǎng)基中的平均誘導(dǎo)率分別在0.05和0.01水平差異顯著。當(dāng)2，4-D濃度繼續(xù)增大時(shí)，其愈傷組織受到了抑制，平均誘導(dǎo)率開(kāi)始下降。6-BA濃度增大時(shí)，其對(duì)平均誘導(dǎo)率均有所抑制。綜合比較，適合蓼藍(lán)莖段誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基配方為MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 2.0 mg/L。

將誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基生長(zhǎng)，繼代培養(yǎng)基采用與初代相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配比（培養(yǎng)基9）。愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)塊狀增大，生長(zhǎng)致密，呈一簇一簇的顆粒狀，顏色淡黃，生長(zhǎng)旺盛。也有極少量愈傷塊出現(xiàn)褐化，少量顏色變得淺白，失去了分化再生出芽的能力。

2.3不同培養(yǎng)基配比對(duì)蓼藍(lán)愈傷組織分化的影響

為了獲得蓼藍(lán)再生植株的主苗，對(duì)繼代培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)28 d的培養(yǎng)，愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)綠點(diǎn)（圖2a），致密飽滿，培養(yǎng)63 d后大部分胚性愈傷組織分化出苗（圖2b）。

由表2可知，隨著6-BA濃度的升高，分化率先增加，后逐漸降低，NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，分化率相對(duì)較大，愈傷組織平均分化率達(dá)51.67%，與其他培養(yǎng)基中的平均分化率分別在0.05和0.01水平上差異顯著。結(jié)果表明，適合蓼藍(lán)愈傷組織分化的培養(yǎng)基是6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。

2.4生根與移栽

蓼藍(lán)愈傷組織分化的芽在1/2 MS + NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～8 d開(kāi)始生根，生根率達(dá)100%（圖3a），平均根長(zhǎng)達(dá)1.8 cm，即可移出培養(yǎng)瓶煉苗1～2 d（圖3b），移栽至濕潤(rùn)的缽?fù)林蟹N植（圖3c），補(bǔ)充水分以保溫保濕。移栽后5 d對(duì)幼苗統(tǒng)計(jì)，定植成活率達(dá)100%。移栽21 d后，幼苗開(kāi)始長(zhǎng)出多片新葉，保持良好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

3討論與結(jié)論

以天然染料植物為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，不僅有利于保護(hù)山地少數(shù)民族地區(qū)植物的遺傳多樣性，民族藥用植物資源的可持續(xù)利用，而且可為優(yōu)良種質(zhì)資源鑒評(píng)和品種改良奠定基礎(chǔ)。貴州黔東南地處苗嶺山區(qū)，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)，具有冬無(wú)嚴(yán)寒，夏無(wú)酷暑，雨熱同季的特點(diǎn)，年平均氣溫14～18 ℃，適宜蓼藍(lán)種植生長(zhǎng)。蓼藍(lán)可持續(xù)利用對(duì)苗嶺山區(qū)少數(shù)民族文化的傳承有著重要的意義。但當(dāng)前蓼藍(lán)野生或半野生分布零散，產(chǎn)量低，生長(zhǎng)速度緩慢，種質(zhì)資源良莠不齊，很大程度上制約了蓼藍(lán)在民族工藝上的規(guī)?；瘧?yīng)用，而組織培養(yǎng)是蓼藍(lán)快繁的有效技術(shù)途徑之一。該試驗(yàn)比較選用了蓼藍(lán)莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，建立了蓼藍(lán)組織培養(yǎng)再生體系，從外植體的消毒及其愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代增殖、分化再生及生根培養(yǎng)各個(gè)階段，比較分析了其生長(zhǎng)適宜的最佳培養(yǎng)基配方。

蓼科植物以不同的外植體來(lái)進(jìn)行組織培養(yǎng)目前均有報(bào)道，其中以莖段和幼葉作為外植體較為常見(jiàn)。柴瑞娟等[12]比較了蕎麥的幼莖和幼葉作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果表明幼莖在偏軟的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織較為理想。劉明珍等[13]以酸模葉蓼帶腋芽莖段作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，研究了進(jìn)一步誘導(dǎo)生成完整植株的快繁技術(shù)。劉曉東等[14]以香蓼帶芽莖段為外植體，初步建立了香蓼組織培養(yǎng)快繁體系。該試驗(yàn)中蓼藍(lán)種子較小，消毒接種易受污染，往往需去宿被再消毒而使操作效率降低，幼葉取材又受時(shí)間限制。綜合考慮，選用蓼藍(lán)莖段作為外植體較為適合，莖段取材便捷，便于消毒，易操作，污染率低，且愈傷組織誘導(dǎo)率較高。

該研究表明，植物激素6-BA、2，4-D均能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)，其中2，4-D濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有著更大的影響，且表現(xiàn)出明顯的質(zhì)量濃度效應(yīng)，適宜的植物激素濃度對(duì)愈傷組織起促進(jìn)作用，而超過(guò)一定濃度，起抑制作用。這一結(jié)果與王鵬姬等[15]對(duì)蓼科蕎麥植物研究結(jié)果一致。劉曉東等[14]誘導(dǎo)香蓼腋芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS + 6-BA 20 mg/L + NAA 0.1 mg/L，劉明珍等[13]比較篩選出酸模葉蓼最適的增殖培養(yǎng)基為 MS + NAA 1.0 mg/L + 6-BA 005 mg/L。該試驗(yàn)中蓼藍(lán)莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方為MS + 6-BA 1.0 mg/L + 2，4-D 2.0 mg/L，愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L。綜合比較來(lái)看，6-BA、2，4-D在蓼藍(lán)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖方面有著更大的影響，NAA在對(duì)蓼藍(lán)分化、生根方面有著很大的影響。

蓼藍(lán)愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系研究的建立，有望改善常規(guī)種植產(chǎn)量低、生長(zhǎng)速度慢，少數(shù)民族地區(qū)需求量大的矛盾，可為蓼藍(lán)種質(zhì)資源保護(hù)鑒評(píng)和品種遺傳改良提供物質(zhì)基礎(chǔ)，并對(duì)利用天然植物染料的民族工藝起到保護(hù)和傳承的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] COOKSEY C J.Indigo：An annotated bibliography [J].Biotechnic & histochemistry，2007，82（2）：105-125.

[2] SIVA R.Status of natural dyes and dyeyielding plants in India [J].Current science，2007，92（7）：916-925.

[3] 李維賢，陳衛(wèi)華.明至民國(guó)時(shí)期廣東藍(lán)靛植物的種植狀況[J].中國(guó)農(nóng)史，2013（6）：46-57.

[4] 淳于步，李玲.貴州少數(shù)民族植物染色主染源的生長(zhǎng)環(huán)境調(diào)查[J].凱里學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，32（6）：46-49.

[5] 余強(qiáng).青，取之于藍(lán)而勝于藍(lán)：植物藍(lán)靛染色的生態(tài)性選擇[J].中國(guó)美術(shù)館，2013（10）：115-117.

[6] 賈煜洲.貴州從江縣岜沙苗族楓香染工藝考察與研究札記[J].美與時(shí)代，2015（4）：106-110.

[7] 王祖遠(yuǎn).在黔東南品味蠟染大餐[J].老人世界，2013（9）：38-39.

[8] JANG H G，HEO B G，PARK Y S，et al.Chemical composition，antioxidant and anticancer effects of the seeds and leaves of indigo（Polygonum tinctorium Ait.）plant[J].Appl Biochem Biotechnol，2012，167（7）：1986-2004.

[9] YU Z，YOSHINAKA Y，TAKEDA T，et al.Highly potent antiHIV1 activity isolated from fermented Polygonum tinctorium Aiton [J].Antiviral research，2005，66（2/3）：119-128.

[10] HEO B G，PARK Y J，PARK Y S，et al.Anticancer and antioxidant effects of extracts from different parts of indigo plant [J].Industrial crops and products，2014，56：9-16.

[11] PARK Y J，SHIN C S，KIM B E，et al.Antioxidant and binding properties of methanol extracts from indigo plant leaves [J].Chemical papers，2014，68（10）：1421-1427.

[12] 柴瑞娟，吳先林.植物激素對(duì)蕎麥組織培養(yǎng)的研究[J].安徽工程科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（2）：19-21.

[13] 劉明珍，陳乃富，李坤，等.酸模葉蓼的組培快繁技術(shù)[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2010（4）：7-9.

[14] 劉曉東，劉嬌，何淼.香蓼帶芽莖段的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J].草業(yè)科學(xué)，2014，31（1）：89-94.

[15] 王鵬姬，高金鋒，蘇旺，等.培養(yǎng)條件對(duì)蕎麥愈傷組織生長(zhǎng)及黃酮合成的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27（5）：591-597.