肺泡灌洗液含鐵血黃素細(xì)胞染色技術(shù)改良

馬興生，張曉琦，劉光福，楊國(guó)儒

(濰坊呼吸病醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濰坊 261041)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

肺泡灌洗液含鐵血黃素細(xì)胞染色技術(shù)改良

馬興生，張曉琦，劉光福，楊國(guó)儒

(濰坊呼吸病醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濰坊 261041)

目的 比較不同含鐵血黃素細(xì)胞染色技術(shù)并選擇最佳者。方法 將同一位肺泡出血患者肺泡灌洗液在相同條件下制成4份涂片標(biāo)本，分別用常規(guī)法、改良法1、改良法2、傳統(tǒng)法染色。在同一顯微鏡下觀察100個(gè)肺巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)含鐵血黃素細(xì)胞。結(jié)果 4種染色法每100個(gè)肺巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)的含鐵血黃素細(xì)胞分別為23、52、51和48。結(jié)論 除常規(guī)法，其他3種方法檢出含鐵血黃素細(xì)胞數(shù)差別不大，改良法1可最大限度地提高含鐵血黃素細(xì)胞檢測(cè)的準(zhǔn)確性且臨床實(shí)用性強(qiáng)，推薦改良法1。

肺泡灌洗液；含鐵血黃素細(xì)胞；染色技術(shù)

肺組織內(nèi)出血時(shí)紅細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬，并在其溶酶體內(nèi)降解，形成光鏡下可見(jiàn)的棕黃色顆粒，即含鐵血黃素；這種巨噬細(xì)胞被稱為含鐵血黃素(巨噬)細(xì)胞。檢測(cè)肺泡灌洗液中含鐵血黃素細(xì)胞對(duì)肺出血性疾病具有診斷價(jià)值[1-2]。含鐵血黃素細(xì)胞是診斷特發(fā)性肺含鐵血黃素沉著癥(idiopathic pulmonary hemosiderosis，IPH)的特異性指標(biāo)[3-4]。在臨床檢驗(yàn)工作中，受染色技術(shù)影響，含鐵血黃素細(xì)胞有時(shí)不易辨認(rèn)，計(jì)數(shù)差異較大。本研究通過(guò)比較肺泡灌洗液含鐵血黃素細(xì)胞不同染色技術(shù)，力求尋找簡(jiǎn)便易行的染色技術(shù)，提高含鐵血黃素細(xì)胞的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 DM2500型光學(xué)顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)，SC-3610型低速離心機(jī)(安徽中科中佳公司)，HYC-310型醫(yī)用冷藏箱(青島海爾特種電器公司)，MS3 BS25型漩渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)，HAILUN牌病理級(jí)高級(jí)載玻片(南通海倫生物公司)，13×78硬質(zhì)透明試管(揚(yáng)州創(chuàng)新醫(yī)療器械廠)，Laixu牌12×100塑料試管(中國(guó)淄博來(lái)緒公司)，300目尼龍濾網(wǎng)(昆山鑫泰篩網(wǎng)濾網(wǎng)公司)，瑞氏-吉姆薩染色液(珠海貝索公司)，濃鹽酸(廣州德樹(shù)公司)，伊紅(上海試劑三廠)，亞鐵氰化鉀(山東萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠)。

1.2 標(biāo)本采集 2017年2月于我院呼吸內(nèi)科就診某患者，采集支氣管肺胞灌洗液約30 mL于支氣管肺胞灌洗專用無(wú)抗凝劑硅塑瓶(減少細(xì)胞粘附)中并送檢。標(biāo)本外觀無(wú)色、微混濁。細(xì)胞計(jì)數(shù)2.00×104/mL。

1.3 方法

1.3.1 染液配制 酸性亞鐵氰化鉀染液：取適量200 g/L亞鐵氰化鉀溶液，逐滴加入濃鹽酸，至溶液剛出現(xiàn)均勻混濁，再逐滴加入適量200 g/L亞鐵氰化鉀溶液，至白色渾濁剛剛消失(200 g/L亞鐵氰化鉀與濃鹽酸比例大約是5∶1)[5]。

瑞氏-吉姆薩試劑：用1 g瑞氏染料、0.3 g吉姆薩染料、500 mL甲醇配制A液；B液為pH值(25 ℃)6.6～6.8磷酸鹽緩沖液。

1.3.2 4種染色法 常規(guī)法：瑞氏-吉姆薩染色法：(1)取一張涂片加瑞氏-吉姆薩試劑A液適量，覆蓋整個(gè)涂片膜，染色0.5～1.0 min；(2)再加2～3倍B液，洗耳球吹勻，染色6～8 min；(3)水洗、干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)肺巨噬細(xì)胞中含鐵血黃素細(xì)胞。

改良法1：在常規(guī)法染色基礎(chǔ)上，滴加酸性亞鐵氰化鉀染液，覆蓋整個(gè)涂片膜，室溫染色20 min，充分水洗、干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)肺巨噬細(xì)胞中含鐵血黃素細(xì)胞。

改良法2：(1)取一張涂片，滴加酸性亞鐵氰化鉀染液，覆蓋整個(gè)涂片膜，室溫染色20 min，充分水洗，干燥。(2)用常規(guī)法染色。(3)水洗、干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)肺巨噬細(xì)胞中含鐵血黃素細(xì)胞。

傳統(tǒng)法：(1)取一張涂片，滴加酸性亞鐵氰化鉀染液，覆蓋整個(gè)涂片膜，室溫染色20 min，充分水洗，干燥。(2)用2%伊紅復(fù)染0.5 min，(3)水洗、干燥，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)肺巨噬細(xì)胞中含鐵血黃素細(xì)胞。

2 結(jié)果

常規(guī)法染色結(jié)果見(jiàn)圖1A，顯微鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)有棕黃色含鐵血黃素顆粒的含鐵血黃素細(xì)胞；每100個(gè)肺巨噬細(xì)胞有23個(gè)含鐵血黃素細(xì)胞。改良法1染色結(jié)果見(jiàn)圖1B，顯微鏡下可見(jiàn)含鐵血黃素細(xì)胞變成藍(lán)色或亮藍(lán)色，與背景色形成鮮明對(duì)比，易于肉眼分辨；每100個(gè)肺巨噬細(xì)胞有52個(gè)含鐵血黃素細(xì)胞。改良法2染色結(jié)果見(jiàn)圖1C，含鐵血黃素細(xì)胞變成藍(lán)色或亮藍(lán)色，與背景色形成鮮明對(duì)比；每100個(gè)肺巨噬細(xì)胞有51個(gè)含鐵血黃素細(xì)胞。傳統(tǒng)法染色結(jié)果見(jiàn)圖1D，顯微鏡下觀察可見(jiàn)橘黃色背景下藍(lán)色的含鐵血黃素細(xì)胞，與背景色對(duì)比鮮明；但除含鐵血紅素細(xì)胞外，其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)不易辨別；每100個(gè)肺巨噬細(xì)胞有48個(gè)含鐵血黃素細(xì)胞。

注：A～D分別為常規(guī)法、改良法1、改良法2和傳統(tǒng)法。

圖1 含鐵血黃素細(xì)胞4種染色法結(jié)果(×1 000)

3 討論

含鐵血黃素細(xì)胞內(nèi)含有三價(jià)鐵離子，與酸性亞鐵氰化鉀發(fā)生普魯氏藍(lán)反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，即鐵染色陽(yáng)性。肺巨噬細(xì)胞中只有含鐵血黃素細(xì)胞鐵染色陽(yáng)性，其他肺巨噬細(xì)胞鐵染色陰性，所以鐵染色陽(yáng)性細(xì)胞即含鐵血黃素細(xì)胞。通過(guò)計(jì)數(shù)鐵染色陽(yáng)性的細(xì)胞即可得含鐵血黃素細(xì)胞數(shù)。常規(guī)法、改良法1、改良法2、傳統(tǒng)法4種方法，每100個(gè)肺巨噬細(xì)胞中含鐵血黃素細(xì)胞分別是23、52、51和48。從數(shù)值來(lái)看，常規(guī)法數(shù)值最小，說(shuō)明在瑞氏-吉姆薩染色中，含鐵血黃素細(xì)胞的辨認(rèn)有一定困難，需要的技術(shù)門檻較高，且需對(duì)含鐵血黃素細(xì)胞具有較高的辨識(shí)能力和敏感性，但難免漏檢部分含鐵血黃素細(xì)胞，影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。其他3種染色方法，檢出的含鐵血黃素細(xì)胞數(shù)值相近，準(zhǔn)確性較高，對(duì)技術(shù)門檻要求較低。對(duì)比改良法1、改良法2，2種方法僅是瑞氏-吉姆薩染色和鐵染色順序的顛倒，結(jié)果顯示無(wú)論改良法1或2，含鐵血黃素細(xì)胞均被染成清晰明亮的藍(lán)色，說(shuō)明染色順序顛倒并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)比改良法1、2與傳統(tǒng)法，傳統(tǒng)法用伊紅染色后，染色背景呈紅色，對(duì)鐵染色弱陽(yáng)性肺巨噬細(xì)胞的辨認(rèn)有干擾，易造成計(jì)數(shù)值偏低。從臨床操作角度來(lái)看，改良法1優(yōu)于改良法2。由于并不是所有患者都存在肺出血風(fēng)險(xiǎn)，也并不是所有患者肺泡灌洗液都有含鐵血黃素細(xì)胞，所有涂片均先鐵染色，再瑞氏-吉姆薩染色，不免浪費(fèi)大量人力、物力；而改良法1，先瑞氏-吉姆薩氏染色，若發(fā)現(xiàn)可疑的含鐵血黃素細(xì)胞后再鐵染色，能夠最大限度提高含鐵血黃素細(xì)胞計(jì)數(shù)的針對(duì)性和準(zhǔn)確性，節(jié)省人力、物力。

綜上所述，通過(guò)比較上述4種染色法，改良法1最簡(jiǎn)便高效，值得推薦。此外，鑒于含鐵血黃素細(xì)胞對(duì)肺出血性疾病的重要診斷價(jià)值，提倡有條件的實(shí)驗(yàn)室，用瑞氏-吉姆薩氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)并分類細(xì)胞計(jì)數(shù)后，可加做鐵染色，特別是有疑似含鐵血黃素細(xì)胞時(shí)，盡可能提高含鐵血黃素細(xì)胞的檢出率，避免漏診。

[1]姚雯穎,曹廣亞,周道銀.肺泡灌洗液檢出含鐵血黃素細(xì)胞輔助診斷肺出血-腎炎綜合征[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2008,26(6):628.

[2]Maldonado F, Parambil JG, Yi ES,etal. Haemosiderin-laden macrophages in the bronchoalveolar lavage fluid of patients with diffuse alveolar damage [J]. Eur Respir J, 2009,33(6):1361-6.

[3]牟向東,宿利,聶立功,等.成人特發(fā)性肺含鐵血黃素沉著癥二例報(bào)道及文獻(xiàn)回顧[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008,40(6):595-599.

[4]Zhang X, Wang L, Lu A,etal. Clinical study of 28 cases of paediatric idiopathic pulmonary haemosiderosis [J]. J Trop Pediatr, 2010,56(6):386-90.

[5]陽(yáng)朝. 肺含鐵血黃素巨噬細(xì)胞檢測(cè)方法和臨床意義[J].醫(yī)學(xué)科技，1986，1(1):152-154.

(本文編輯：王海燕)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.06.11

馬興生，1965年生，男，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

楊國(guó)儒，主任醫(yī)師，E-mail：yangguoru@163.com。

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2017-02-28)