干濾紙血片制備環(huán)境的理化因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響*

方可欣，尚世強(qiáng)，楊建濱，張婷，胡真真，湯薇薇，吳鼎文

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院新生兒遺傳代謝病篩查實(shí)驗(yàn)室，杭州 310052)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

干濾紙血片制備環(huán)境的理化因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響*

方可欣，尚世強(qiáng)，楊建濱，張婷，胡真真，湯薇薇，吳鼎文

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院新生兒遺傳代謝病篩查實(shí)驗(yàn)室，杭州 310052)

目的 觀察新生兒疾病篩查干濾紙血片(dried blood spots)制備環(huán)境中顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的理化因素。方法 研究組1：收集正常標(biāo)本60例、陽性標(biāo)本120例，于對照條件及10種特定環(huán)境下制備干濾紙血片。研究組2：另收集正常標(biāo)本30例、陽性標(biāo)本80例，于對照條件及7種甲醛濃度環(huán)境下制備干濾紙血片。用熒光法或時間分辨熒光免疫分析法檢測標(biāo)本中苯丙氨酸(Phe)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、促甲狀腺激素(TSH)、17α-羥孕酮(17α-OHP)水平。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 10種環(huán)境下制備的干濾紙血片Phe檢測結(jié)果與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，甲醛敏感閾為4.62～6.95 ppm/18 h； 37 ℃烘箱、潮濕、紫外線照射、新裝修環(huán)境、乙醇、冰醋酸、甲醛等環(huán)境下制備的干濾紙血片G6PD檢測結(jié)果低于對照組(P<0.05)，甲醛敏感閾為0.30～0.38 ppm/4 h及0.21～0.24 ppm/18 h；潮濕、紫外線照射、甲醛環(huán)境下制備的干濾紙血片TSH檢測結(jié)果低于對照組(P<0.05)，甲醛敏感閾為0.32～0.52 ppm/4 h及0.38～0.45 ppm/18 h；潮濕、紫外線照射、甲醛環(huán)境下制備的干濾紙血片17α-OHP檢測結(jié)果低于對照組(P<0.05)，甲醛敏感閾為4.37～4.62 ppm/4 h及0.38～0.45 ppm/18 h。冷風(fēng)快速吹干與2～8 ℃冷庫環(huán)境下制備干濾紙血片4項(xiàng)檢測結(jié)果與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 干濾紙血片制備環(huán)境的理化因素與新生兒疾病篩查的準(zhǔn)確性密切相關(guān)，甲醛、乙醇、冰醋酸、紫外線照射、高溫、潮濕及裝修污染等是干濾紙血片制備環(huán)境的必要管控因素；冷風(fēng)快速吹干與2～8℃冷庫過夜可作為新生兒篩查干濾紙血片制備的備選方法。

新生兒篩查；干濾紙血片；環(huán)境；因素；甲醛

新生兒疾病篩查(neonatal screening)是指在新生兒期篩查先天性或遺傳性代謝病，在臨床癥狀尚未表現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)患兒，通過早期診斷和治療降低患兒的發(fā)病率和死亡率[1-2]。鑒于干濾紙血片的制備“安全、簡便、穩(wěn)定性好，標(biāo)本易于儲存”的特性[3]，早在20世紀(jì)60年代已用于新生兒疾病篩查。研究表明，干濾紙血片制備或保存不當(dāng)會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4-7]。干濾紙血片采集與制備多在接產(chǎn)單位完成，而各接產(chǎn)單位基礎(chǔ)條件不一，其環(huán)境難以均一化。本研究模擬采血單位可能出現(xiàn)的特殊理化環(huán)境，分析各環(huán)境下制備的干濾紙血片在新生兒疾病篩查不同檢測項(xiàng)目間的差異，旨在明確干濾紙血片制備環(huán)境的必要管控因素，為采血單位制備高質(zhì)量的新生兒疾病篩查標(biāo)本提供參考。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集肝素抗凝靜脈血2.0 mL，研究組1入選60例正常標(biāo)本(新生兒30例，兒童30例)，苯丙氨酸(Phe)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、新生兒促甲狀腺素(TSH)、新生兒17α-羥孕酮(17α-OHP)檢測陽性樣本各30例(新生兒各10例，兒童各20例)。研究組2入選30例正常標(biāo)本(均為兒童)和上述4項(xiàng)指標(biāo)陽性標(biāo)本各20例(均為兒童)。血液混勻后取50 μL滴于Schleicher&Schuell 903特種濾紙上，每個血斑直徑大于8 mm，正反面滲透均勻，每例在不同環(huán)境下均制備3個血斑(每個血斑50 μL血液)。

1.2 試劑與儀器 新生兒Phe試劑盒(批號：642984)、G6PD測定試劑盒(批號：653008)、TSH測定試劑盒(批號：645363)、17α-OHP測定試劑盒(批號：642984)及1235 AutoDELFIA全自動時間分辨熒光免疫分析儀、Panthera-PuncherTM 9打孔儀均購自芬蘭珀金埃爾默公司，1420多功能分析儀、1296-003型振蕩器購自芬蘭Wallac公司，紫外燈，Schleicher&Schuell 903濾紙，HTV-M型甲醛檢測儀(購自英國PPM公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 研究組1：分別暴露在對照條件(自然通風(fēng)，環(huán)境溫度25 ℃，濕度45%，水平晾干4 h)及10種特定環(huán)境：冷風(fēng)快速吹干(距離血片10 cm處來回吹冷風(fēng)約6 min，血斑顏色由鮮紅變暗紅，溫濕度與對照組相同)、冷庫過夜(溫度2～8 ℃，濕度60%)、37 ℃烘箱(4 h，濕度34%)、潮濕(將干凈濾紙片置于70 ℃熱水上空15～20 cm保持20 min，讓水蒸氣使干凈濾紙片充分受潮，冷卻后滴片并自然晾干4 h)、紫外線照射1 h(照射距離約20 cm，溫濕度同對照組)、紫外線照射2 h(照射距離約20 cm，溫濕度同對照組)、新裝修房間(溫濕度與對照組相同)及乙醇、冰醋酸、甲醛環(huán)境。揮發(fā)性化學(xué)品實(shí)驗(yàn)環(huán)境的預(yù)備：分別將100 mL乙醇、冰醋酸、甲醛溶液放置于有透氣小孔的紙箱中平衡15 min，形成相對穩(wěn)定的化學(xué)品揮發(fā)環(huán)境，溫濕度同對照組，晾干4 h。

研究組2：分別暴露在對照條件(同前)及7種不同甲醛濃度(包括：未稀釋、1∶10、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋)環(huán)境中4、18 h，甲醛揮發(fā)環(huán)境的預(yù)備同前。所有制備好的標(biāo)本均放入密封袋中于4 ℃保存。

1.4 檢測方法 用熒光分析法檢測Phe和G6PD的濃度或酶活性，用時間分辨熒光法檢測TSH、17α-OHP的濃度，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書，用甲醛測量儀測定實(shí)驗(yàn)環(huán)境的甲醛濃度。

2 結(jié)果

2.1 血片制備環(huán)境對Phe、G6PD、TSH、17α-OHP檢測結(jié)果的影響 見表1。11種環(huán)境下制備的血片Phe檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，G6PD、TSH、17α-OHP檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。潮濕、紫外線照射和甲醛環(huán)境下制備的血片G6PD、TSH、17α-OHP檢測結(jié)果均低于對照組(P均<0.05)。37 ℃烘箱、新裝修房間、乙醇、冰醋酸環(huán)境下制備的血片G6PD檢測結(jié)果均低于對照組(P均<0.05)。冷風(fēng)吹干和2～8 ℃冷庫過夜環(huán)境下制備的血片檢測結(jié)果與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 不同稀釋比例甲醛放置15 min、4 h、18 h后環(huán)境中甲醛析出水平 甲醛析出濃度與稀釋比例呈負(fù)相關(guān)(r=-0.986，P<0.05)。甲醛析出水平見表2。

2.3 不同甲醛濃度環(huán)境對Phe、G6PD、TSH、17α-OHP檢測結(jié)果的影響 4項(xiàng)檢測結(jié)果與甲醛濃度及暴露時間呈負(fù)相關(guān)(Phe，r=-0.821，P<0.05；G6PD，r=-0.851，P<0.05；TSH，r=-0.957，P<0.05；17α-OHP，r=-0.848，P<0.05)。不同濃度甲醛環(huán)境下所制備的干濾紙血片4項(xiàng)檢測結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。不同時間檢測Phe結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且甲醛濃度與檢測時間不存在交互作用(P>0.05)。不同時間檢測G6PD、TSH、17α-OHP結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對于G6PD與TSH，甲醛濃度與檢測時間存在交互作用(P<0.05)，對于17α-OHP，甲醛濃度與檢測時間不存在交互作用(P>0.05)。新鮮干濾紙血片暴露在不同甲醛環(huán)境中4、18 h后檢測結(jié)果見圖1。

表1 11種環(huán)境下制備的血片中Phe、G6PD、TSH、17α-OHP的檢測和統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

注：*，與對照組比較，P<0.05。

表2 不同稀釋比例的甲醛放置15 min、4 h、18 h后環(huán)境中甲醛濃度(ppm)

稀釋比例15min4h18h未稀釋4.374.626.951∶101.121.272.211∶250.320.521.531∶500.300.380.451∶1000.220.230.431∶2000.200.210.241∶4000.180.180.20對照未檢出未檢出未檢出

3 討論

我國當(dāng)前采用傳統(tǒng)生化方法篩查新生兒疾病的項(xiàng)目主要包括Phe、G6PD、TSH和17α-OHP[8-9]。研究表明，干濾紙血片的制備環(huán)境與檢測指標(biāo)的穩(wěn)定性顯著相關(guān)[4-5]。Golbahar等[6]報(bào)道，Phe對高溫、高濕環(huán)境不敏感，而本研究顯示Phe對納入實(shí)驗(yàn)的所有理化因素均不敏感，只有標(biāo)本長時間暴露在高濃度甲醛環(huán)境下才產(chǎn)生影響，說明Phe性質(zhì)較穩(wěn)定，不易受標(biāo)本制備環(huán)境的理化因素影響。對于G6PD，既往研究多集中于環(huán)境溫度、濕度與酶活性的關(guān)系[7-10]。本研究顯示，G6PD活性除對溫濕度敏感外，還受甲醛等多個因素影響，說明G6PD活性極不穩(wěn)定，需要嚴(yán)格控制標(biāo)本采集與制備環(huán)境。TSH與17α-OHP檢測原理的本質(zhì)均基于抗原抗體反應(yīng)，但對環(huán)境因素的耐受性不完全一致。實(shí)驗(yàn)觀察到二者雖然均受甲醛、紫外線照射、濕度的影響，但TSH較17α-OHP更敏感。分析原因可能為17α-OHP是一種酮類物質(zhì)，分子量較小，而TSH是一種大分子糖蛋白，對不良因素的耐受性更低。李明訓(xùn)等[11]報(bào)道太陽暴曬會使TSH變性并吸附在濾紙上，導(dǎo)致洗脫不全而影響檢出，這也是甲醛環(huán)境下制備干濾紙血片的TSH與17α-OHP檢測值顯著降低的主要原因。在基于TSH的研究中，有學(xué)者認(rèn)為潮濕會造成血液稀釋而導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低[11]。本研究顯示，潮濕僅對G6PD、TSH和17α-OHP產(chǎn)生顯著影響，而Phe未發(fā)生明顯變化，“血液稀釋”的觀點(diǎn)不足以解釋。其原因可能是潮濕會破壞蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致酶活性或抗原抗體結(jié)合效率下降而使檢測值降低。

在本次觀察的理化指標(biāo)中，甲醛是導(dǎo)致G6PD、TSH與17α-OHP檢測值降低的最顯著因素。眾所周知，甲醛是新裝修環(huán)境析出的主要污染物之一，且不同材料中的甲醛析出濃度不一。對于血片制備環(huán)境中甲醛析出的安全濃度，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究表明，當(dāng)血片制備環(huán)境的甲醛濃度達(dá)0.30～0.38 ppm時，僅暴露4 h或0.21～0.24 ppm甲醛環(huán)境中暴露18 h，就顯著影響G6PD酶活性，提示必須嚴(yán)格管控血片制備環(huán)境的甲醛析出濃度并減少血片在污染環(huán)境的暴露時間。因此，建議血片制備環(huán)境的甲醛析出濃度應(yīng)控制在0.2 ppm以下。另外，冷風(fēng)快速吹干或在2～8 ℃冷庫過夜制備的血片檢測結(jié)果與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示當(dāng)遇到不能用標(biāo)準(zhǔn)方法制備血片的特殊情況時，可采用上述兩種方式作為新生兒疾病篩查標(biāo)本制備的備選方法。

注：A、C、E、G，正常標(biāo)本；B、D、F、H，陽性標(biāo)本；*，與對照組比較，P<0.05。

圖1 不同甲醛濃度環(huán)境下制備的新鮮干濾紙血片Phe、G6PD、TSH、17α-OHP檢測結(jié)果

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(本文編輯：王海燕)

Effects of physical and chemical factors in environment for dried blood spot preparation of neonatal screening assay

FANGKe-xin,SHANGShi-qiang,YANGJian-bin,ZHANGTing,HUZhen-zhen,TANGWei-wei,WUDing-wen

(CentralLaboratoryofNeonatalInheritedMetabolicDiseasesScreening,Children′sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310052,Zhejiang,China)

Objective To investigate the effects of physical and chemical factors in the environment for dried blood sample (DBS) preparation of neonatal screening assay. Methods A total of 60 normal and 120 positive DBS were prepared under control and 10 different conditions. Another 30 normal and 80 positive DBS were prepared under control and 7 different concentration gradients of formaldehyde. The levels of phenylalanine (Phe), glucose-6-phosphate dehydrogenease (G6PD), thyroid stimulating hormone (TSH) and 17α-hydoxyprogesterone (17α-OHP) were tested by time-resolved fluorescence immunoassay or fluorescence assay. Statistical analysis was performed using SPSS 22.0 software. Results Compared with the control group, the results of Phe were not significantly different (P>0.05) when the samples were dried under the formaldehyde sensitive threshold (4.62 to 6.95 ppm for 18 hours). G6PD levels were significantly lowered when the samples were dried under all the conditions except for fast cold drying (2 to 8 ℃ overnight and formaldehyde condition, 0.30 to 0.38 ppm for 4 hours or 0.21 to 0.24 ppm for 18 hours). TSH and 17α-OHP levels were lowered obviously when the samples were dried under the conditions of humidity, UV and formaldehyde condition (TSH: 0.32 to 0.52 ppm for 4 hours, 0.38 to 0.45 ppm for 18 hours, 17α-OHP: 4.37 to 4.62 ppm for 4 hours, 0.38 to 0.45 ppm for 18 hours). The results of Phe, G6PD, TSH and 17α-OHP were not statistically different with the control group when the samples were dried under the fast cold drying and 2 to 8 ℃ overnight. Conclusion The physical and chemical factors in the environment of DBS preparation should be related to the accuracy of neonatal disease screening closely. The necessary control factors including formaldehyde, ethanol, glacial acetic acid, ultraviolet irradiation, heat, humidity and decoration pollution may exhibit significant effects on the preparation of DBS. Fast cold drying and overnight at 2 to 8 ℃ could be available for DBS preparation.

neonatal screening; dried blood spots; environment; factor; formaldehyde

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃(2015KYA118)。

方可欣，1986年生，女，技師，碩士研究生，主要從事新生兒遺傳代謝病篩查的實(shí)驗(yàn)室檢測工作。

吳鼎文，E-mail：dingwenwu1@aliyun.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.06.09

R446

A

2016-08-10)