肉雜雞肺炎克雷伯菌耐藥菌株的分離鑒定

司振書++張海濤++邵丹++秦飛燕

摘要：2015年6月中旬，山東省莘縣、高唐等地多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)3日齡肉雜雞出現(xiàn)張口、伸頸、呼吸困難等癥狀，剖檢呼吸道無明顯病變，心臟、肝臟周圍及皮下有大量淡黃色膠凍樣滲出物，肝臟有大量點(diǎn)狀壞死，為確定病原，對(duì)發(fā)病雞的喉拭子進(jìn)行了流感抗原性檢測(cè)；對(duì)病雞的肺臟進(jìn)行了病毒分離培養(yǎng)；對(duì)其肝臟、心臟進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，肉雜雞發(fā)病由金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的混合感染所致，針對(duì)無禽流感病毒和新城疫病毒的感染，采取了敏感藥物治療、消毒、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理等綜合措施，7 d后，發(fā)病情況逐漸好轉(zhuǎn)，雞群15日齡時(shí)趨于穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：肉雜雞；肺炎克雷伯菌；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；耐藥菌株

中圖分類號(hào)： S858.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0152-02

魯西小型肉雜雞是用快大型白羽肉雞的父母代父系公雞作父本，褐殼商品蛋雞作母本雜交而來，具有生長(zhǎng)速度快、飼料報(bào)酬高、飼養(yǎng)周期短、料肉比低、肉質(zhì)嫩、易加工、易成熟等特點(diǎn)，是制作脫骨扒雞的最理想原料，在山東聊城各縣（區(qū)）均具有較大養(yǎng)殖規(guī)模。2015年6月中旬，山東省莘縣、高唐等地多個(gè)肉雜雞養(yǎng)殖場(chǎng)相繼發(fā)生同樣疾病，3日齡小肉雞開始出現(xiàn)張口、伸頸、呼吸困難，生長(zhǎng)發(fā)育受阻，剖檢呼吸道無明顯病變，心臟、肝臟周圍及皮下有大量的淡黃色膠凍樣滲出物，肝臟有大量點(diǎn)狀壞死。通過對(duì)雞苗來源與去向等調(diào)查排除了雞苗質(zhì)量問題。采取病料進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)鑒定分離到1株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和1株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），且肺炎克雷伯菌分離株對(duì)多種藥物具有耐藥性。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、高鹽甘露醇瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板由聊城大學(xué)動(dòng)物預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制備。禽流感病毒（通用）抗原快速檢測(cè)卡，購(gòu)于深圳真瑞生物科技有限公司；XK型自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、腸桿菌鑒定試劑盒、葡萄球菌鑒定試劑盒等由山東鑫科生物科技有限公司提供；各種藥敏紙片，購(gòu)于浙江杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2病料的采取

進(jìn)行無菌操作，取發(fā)病肉雞的喉拭子、肺臟、肝臟、心臟。

1.3禽流感抗原檢測(cè)

將喉拭子立即用禽流感病毒抗原快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，操作方法按說明書進(jìn)行。

1.4病毒的分離培養(yǎng)與鑒定

進(jìn)行無菌操作，取少量肺臟樣品，放入滅菌的研磨器，加含雙抗的PBS研磨成10%～20%的懸液。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清，接種于4 枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，02 mL/胚，每12 h照胚1 次，棄去24 h內(nèi)死亡胚，及時(shí)取出24～72 h死胚，于4 ℃冰箱過夜，72 h未死亡的全部取出置于冰箱內(nèi)凍死，無菌收取尿囊液。用1%的雞紅細(xì)胞測(cè)定尿囊液有無血凝性；若無血凝性，則可排除新城疫病毒、禽流感病毒的感染；若有，則通過血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

1.5細(xì)菌的分離培養(yǎng)

取肝臟、心臟分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、高鹽甘露醇瓊脂、麥康凱瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.6細(xì)菌的形態(tài)染色觀察

將分離得到的細(xì)菌純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察。

1.7細(xì)菌的鑒定

將分離純化的細(xì)菌分別采用適宜的細(xì)菌鑒定試劑盒，通過XK型自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定，操作方法按說明書進(jìn)行。

1.8藥敏試驗(yàn)

挑取分離純化的細(xì)菌菌落，用滅菌的生理鹽水制成懸液，校正濃度為0.5 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，用滅菌棉簽均勻涂布平板，貼上各種藥敏紙片，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，18 h后取出測(cè)量抑菌圈直徑。

2結(jié)果與分析

2.1禽流感病毒抗原檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，病雞喉拭子禽流感病毒抗原為陰性。

2.2病毒分離結(jié)果

接種病料的4 枚SPF雞胚孵化72 h均未死亡，對(duì)尿囊液進(jìn)行HA檢測(cè)，均無血凝性。

2.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

從肝臟分離得到的細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成光滑、隆起、圓整的橙黃色菌落；在高鹽甘露醇瓊脂上，形成淡黃色、光滑、濕潤(rùn)、圓形的小菌落；在麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)。從心臟分離得到的細(xì)菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成光滑、濕潤(rùn)、乳白色、凸起、濃厚黏稠的菌落；在麥康凱瓊脂平板上，菌落淡紅色，黏稠、膠狀；在高鹽甘露醇瓊脂上不生長(zhǎng)。對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)一步純化，最后獲得2 種細(xì)菌的純培養(yǎng)物。

2.4細(xì)菌形態(tài)染色特點(diǎn)

從肝臟分離到的細(xì)菌呈球形，革蘭氏染色呈陽性，多呈葡萄串狀，也有成對(duì)或短鏈狀排列的；從心臟分離到的細(xì)菌呈桿形，革蘭氏染色呈陰性，多單個(gè)存在。

2.5分離菌的鑒定結(jié)果

將分離得到的革蘭氏陰性桿菌用腸桿菌鑒定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，各生化孔顯示，蕈糖+、蔗糖+、賴氨酸脫羧酶+、乳糖+、尿素酶+、靛基質(zhì)試驗(yàn)-、七葉苷+、丙二酸鹽+、鳥氨酸脫羧酶-、山梨醇+、OF+、水楊素+、枸櫞酸鹽-、肌醇+、精氨酸-、棉子糖+、β半乳糖+、甘露醇+，鑒定結(jié)果表明該菌為肺炎克雷伯菌，鑒定概率為99.99%。將分離到的革蘭氏陽性球菌用葡萄球菌鑒定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，各生化孔顯示，乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、蕈糖、果糖等均為+，硝酸鹽-、鳥氨酸脫羧酶-、水楊苷-、纖維二糖-、β半乳糖-、精氨酸+、尿素酶試驗(yàn)+、溶血+、棉子糖-、七葉苷-，鑒定結(jié)果表明該菌為金黃色葡萄球菌，鑒定概率為9999%。

2.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離得到的肺炎克雷伯菌敏感藥及抑菌圈直徑分別為米諾環(huán)素23 mm、頭孢他啶18 mm，而對(duì)頭孢噻吩、頭孢呋辛、呋喃妥因、頭孢吡肟、萬古霉素、青霉素G、四環(huán)素、克林霉素等均耐藥；分離到的金黃色葡萄球菌的敏感藥及抑菌圈直徑分別為頭孢呋辛25 mm、丁胺卡那霉素24 mm、慶大霉素 22 mm、頭孢氨芐 21 mm、卡那霉素21 mm、環(huán)丙沙星20 mm，而對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、克林霉素等耐藥。

3討論

病雞喉拭子禽流感病毒抗原檢測(cè)為陰性，可初步排除禽流感病毒的感染，SPF雞胚進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)，收獲的尿囊液無血凝性，說明發(fā)病雞群無禽流感病毒、新城疫病毒的感染；從病雞肝臟及心臟分離到2 種細(xì)菌純培養(yǎng)物，根據(jù)其形態(tài)特征、培養(yǎng)特性及生化特點(diǎn)判斷，兩者分別為金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。據(jù)此可初步判斷，該發(fā)病由肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌混合感染所致。

肺炎克雷伯菌廣泛存在于自然界，也存在于動(dòng)物的腸道、呼吸道和泌尿道中，為條件性致病菌[1]。當(dāng)機(jī)體免疫力低下或長(zhǎng)期使用抗生素時(shí)，引發(fā)人和動(dòng)物的多種疾病。榮光等從發(fā)病瀕死的五指山豬體內(nèi)分離到肺炎克雷伯菌肺炎亞種[2]；劉燕等從白頰長(zhǎng)臂猿的膿液中分離到肺炎克雷伯菌肺炎亞種，該菌感染導(dǎo)致白頰長(zhǎng)臂猿的膿腫、死亡[3]。肺炎克雷伯菌可引起人的肺炎、敗血癥、腦膜炎、肝膿腫等，在家禽，能引起死胚、卵黃囊感染、呼吸道病、眼病、敗血癥和繁殖性疾病[1]。本次肉雜雞的發(fā)病可能由于養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)管理水平較差，日常消毒等環(huán)境控制措施不到位，給金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯菌以可乘之機(jī)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

肺炎克雷伯菌感染家禽的病例報(bào)道較少，而對(duì)人感染的報(bào)道及研究較多。李振江等對(duì)256個(gè)肺炎克雷伯菌臨床分離株進(jìn)行了耐藥性研究，結(jié)果表明該菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性較高，49.0%的產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的菌株呈多重耐藥[4]。本次從肉雜雞分離到的肺炎克雷伯菌，除對(duì)米諾環(huán)素、頭孢他啶具有一定的敏感性外，對(duì)其他多種藥物均耐藥，呈現(xiàn)強(qiáng)的耐藥性，獸醫(yī)臨床應(yīng)重視該菌的感染及流行情況，合理使用抗菌藥物。翁幸鐾等對(duì)1株耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥相關(guān)基因進(jìn)行研究，該菌株對(duì)哌拉西林、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星等均耐藥，該菌耐藥與其攜帶獲得性耐藥基因TEM-1、SHV-11、aac（3）-Ⅱ等基因相關(guān)[5]。本次分離到的金黃色葡萄球菌則對(duì)多種藥物敏感，綜合2種病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用頭孢他啶進(jìn)行治療，同時(shí)對(duì)所用器皿、工具、籠舍進(jìn)行全面消毒，7 d后，發(fā)病情況逐漸好轉(zhuǎn)，15日齡時(shí)雞群趨于穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所.獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013：179-181.

[2]榮光，趙軍明，侯冠彧，等. 五指山豬肺炎克雷伯菌肺炎亞種的分離及鑒定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（10）：1-5.

[3]劉燕，趙京，張成林，等. 肺炎克雷伯氏菌致白頰長(zhǎng)臂猿膿腫一例[J]. 野生動(dòng)物，2011，32（3）：156-157.

[4]李振江，孫長(zhǎng)貴，曾賢銘，等. 肺炎克雷伯菌醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)及耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（6）：737-739.

[5]翁幸鐾，糜祖煌. 多耐藥肺炎克雷伯菌獲得性耐藥基因及ompK36突變研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（17）：2545-2548.