亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖及其抗氧化活性

馬若影,楊慧強,李國勝,鄧志勇,曹 君,李幼梅,白新鵬,*

(1.海南大學食品學院,海南?？?570228;2.海南北緯十八度果業(yè)有限公司,海南東方 572600)

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亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖及其抗氧化活性

馬若影1,楊慧強2,+,李國勝1,鄧志勇2,曹 君1,李幼梅1,白新鵬1,*

(1.海南大學食品學院,海南?？?570228;2.海南北緯十八度果業(yè)有限公司,海南東方 572600)

本實驗以紅心火龍果莖為原料,通過單因素和正交實驗對亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖的工藝進行優(yōu)化,并對提取的多糖進行抗氧化活性研究和結構鑒定,以確定紅心火龍果莖的生物活性,并評價其體外抗氧化活性的強弱,從而為紅心火龍果莖多糖的合理開發(fā)和應用提供理論依據(jù)。結果表明,亞臨界水提取的最佳工藝參數(shù):提取溫度為140 ℃,提取時間為25 min,料液比為1∶50,多糖得率38.07%±0.15%?？寡趸越Y果表明,火龍果莖多糖具有一定的抗氧化活性,對DPPH·和·OH清除率可達40.09%和95.15%。紫外和紅外光譜分析表明,火龍果莖粗多糖不含蛋白質和核酸且具有典型的多糖紅外吸收。

紅心火龍果莖,多糖,亞臨界水,抗氧化

火龍果(Hylocereusundatus)又稱紅龍果、仙蜜果、長壽吉祥果等,為仙人掌科三角柱屬植物三角柱的果用栽培品種,是一種高營養(yǎng)保健價值的熱帶水果,具有助消化、降血壓與血糖、抗氧化等多種功能[1-3]。原產(chǎn)于西半球赤道附近,中美洲熱帶雨林地區(qū)[4]。據(jù)2015年數(shù)據(jù)顯示,海南省紅心火龍果種植面積約4萬畝且呈快速增長趨勢。火龍果莖具有生長速度快、分枝能力強,但在火龍果生長種植過程中為加快其生長及保證果實品質一般僅保留1條主莖,因此,需要不斷修剪分枝。研究表明,火龍果莖中含豐富的植物多糖活性成分[5],具有很高的研究價值。目前火龍果莖多糖提取方法主要有傳統(tǒng)熱水浸提法[6]、超聲輔助提取法[7]、酶提取法[8]、微波輔助提取法[9]等,這些提取方法存在多糖得率低、提取時間長等缺點,因此有必要研究一種高效快速提取優(yōu)質火龍果莖多糖的方法。

亞臨界水(Subcritical water)是指使用特定的裝置,通過升溫加壓,使水的溫度介于沸點以上,亞臨界溫度以下(100～374 ℃)仍然保持液體狀態(tài),此稱為亞臨界水、高溫液態(tài)水等。在亞臨界狀態(tài)下,水分子熱運動增加,許多特性會發(fā)生顯著改變,水的介電常數(shù)會降低,表現(xiàn)出類似于有機溶劑的特性,使許多弱極性的物質都能溶解到亞臨界水中[10-13]。亞臨界水提取技術是一種新型高效低耗能的綠色提取技術[14],目前,在天然產(chǎn)物如多酚、多糖、黃酮和花青素等的提取中得到廣泛應用[15]。

本文利用亞臨界水提取技術對火龍果莖多糖進行提取,確定火龍果莖多糖的最佳提取工藝,并對提取的火龍果莖多糖進行抗氧化活性研究。加強對火龍果莖多糖提取研究,不僅可為進一步研究火龍果莖多糖的性質提供理論依據(jù)和參考,還可很大程度提高火龍果的附加值,提高火龍果種植的經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

火龍果莖(凍干磨粉備用) 由海南省東方市北緯十八度果業(yè)有限公司提供;葡萄糖、濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、過氧化氫、磷酸三鈉、鉬酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵 購于廣州化學試劑廠;抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 購于麥克林公司;以上試劑 均為分析純(AR)。

GL-20G-II型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;A11分析用研磨機 廣州儀科實驗室技術有限公司;RE52CS型旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FDU-2100型冷凍干燥機 埃朗科技國際貿(mào)易(上海)有限公司;723PC型可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司;EL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CU-420型電熱恒溫水槽 上海齊欣科學儀器有限公司;亞臨界水設備 本實驗裝置為課題組自行設計,并已申請專利，設備主體由高溫反應釜,加熱裝置,溫控系統(tǒng)三部分組成,具體裝置簡圖如圖1。

圖1 亞臨界水設備簡圖Fig.1 Installation drawing of subcritical water注:1-控溫儀,2-溫度傳感器,3-壓力表,4-高壓閥門,5-反應釜,6-加熱套。

1.2 實驗方法

1.2.1 火龍果莖多糖提取 火龍果莖凍干粉→亞臨界水提取→離心→上清液→濃縮→乙醇沉淀→冷凍干燥→火龍果莖粗多糖。

稱取2.0 g火龍果莖干粉,置于亞臨界水反應釜中,按照設定的料液比、提取溫度和提取時間對火龍果莖凍干粉進行亞臨界水提取,提取完成后于8000 r/min的條件下離心10 min,取上清液旋蒸濃縮并加入無水乙醇至乙醇體積分數(shù)為80%,4 ℃靜置沉淀12 h,然后于6000 r/min的條件下離心5 min,保留沉淀并冷凍干燥得到火龍果莖粗多糖。

1.2.2 火龍果莖多糖提取的單因素實驗 采用1.2.1中的方法提取火龍果莖多糖,固定反應條件為提取溫度130 ℃,提取時間20 min,考察不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)對多糖得率的影響;固定反應條件提取時間20 min,料液比1∶40,考察不同提取溫度(100、110、130、140、150、170 ℃)對多糖得率的影響；固定反應條件提取溫度140 ℃,料液比1∶40,考察不同提取時間(5、15、25、35、45、55 min)對多糖得率的影響；每組實驗做3次平行實驗,最后以火龍果莖多糖得率為指標,考察每個因素對火龍果莖多糖得率的影響。

1.2.3 火龍果莖多糖提取的正交實驗 在單因素實驗的基礎上,選擇提取溫度、料液比、提取時間三個因素,在各因素最佳值附近分別選取三個水平(表1),以多糖得率為指標,做三因素三水平的正交實驗,依據(jù)L9(34)正交實驗表優(yōu)化多糖提取的最佳工藝。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

1.2.4 標準曲線繪制 參照張保[16]等的方法,精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg,用蒸餾水定容至100 mL,再用0.1 mg/mL的葡萄糖溶液配制成0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標準待測液,各吸取1 mL然后加入1 mL 4%苯酚溶液,混合均勻后加入3.5 mL濃硫酸,放入冷水中冷卻5 min后在波長489 nm處測定吸光度值,以葡萄糖質量濃度(x)為橫坐標,吸光度值(y)為縱坐標繪制標準曲線。繪制葡萄糖標準曲線為A=0.0049x+0.0654,相關系數(shù)r=0.9984,線性范圍在0～100 μg/mL。

1.2.5 火龍果莖多糖的測定 稱取提取的火龍果莖多糖5 mg,配成0.1 mg/mL的多糖待測液,按照標準曲線制備方法測定吸光度值,火龍果莖多糖得率以干基計算。

火龍果莖多糖得率(%)=提取液火龍果莖多糖的質量/火龍果莖凍干粉的質量×100

1.2.6 火龍果莖多糖抗氧化活性的測定

1.2.6.1 火龍果莖多糖清除DPPH自由基的能力測定 參考李莉[17]等的方法并加以改進,準確稱取4 mg DPPH·,用甲醇溶解,定容至100 mL。準確吸取不同質量濃度的(0、0.1、0.2、0.25、0.5、1 mg/mL)火龍果莖多糖待測液1 mL、配制好的DPPH·甲醇溶液1 mL,混合均勻后室溫靜置20 min,于517 nm波長處測定吸光度值。用甲醇做空白對照、VC做陽性對照,計算火龍果莖多糖清除DPPH自由基的能力。

式(1)

式中:Ai為1 mL待測液+1 mL DPPH·工作液的吸光度值;Aj為1 mL待測液+1 mL甲醇的吸光度值;A0為1 mL DPPH·工作液+1 mL甲醇的吸光度值。

1.2.6.2 火龍果莖多糖清除·OH的能力測定 參考封燕[18]等的方法并加以改進,往15 mL離心管中依次加入不同質量濃度的火龍果莖多糖待測液1 mL,6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL,6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL,和6 mmol/L的過氧化氫溶液1 mL,混合均勻后37 ℃水浴1 h,在510 nm波長處測定吸光度值(Ai)。計算火龍果莖多糖清除羥自由基的能力。

式(2)

式中:Aj為蒸餾水代替多糖待測液的吸光度值;A0為蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度值。

1.2.6.3 火龍果莖多糖總抗氧化能力的測定 參考Smirnoff N[19]等的方法并加以改進,精確稱取磷酸三鈉1.065 g,鉬酸銨0.494 g,溶解在少量蒸餾水中后加入濃硫酸3.28 mL,定容至100 mL,取3 mL配制好的混合液,然后加入不同質量濃度的火龍果莖多糖待測液1 mL,混合均勻后95 ℃水浴90 min,695 nm波長處測定吸光度值,蒸餾水作空白對照,VC作陽性對照。

1.2.6.4 火龍果莖多糖總還原力的測定 參考劉曉鵬[20]等的方法并加以改進,在15 mL的離心管中依次加入pH6.6的磷酸鹽緩沖液1 mL,不同質量濃度的火龍果莖多糖待測液1 mL,1%的鐵氰化鉀溶液1 mL,混合均勻后于50 ℃水浴20 min。取出后加入10%的三氯乙酸終止反應,6000 r/min離心10 min,取上清液3 mL,加入蒸餾水3 mL,0.1%的氯化鐵0.5 mL,混合均勻后室溫靜置10 min,700 nm處測吸光度值,蒸餾水作空白對照,VC做陽性對照。

1.2.7 火龍果莖多糖的紫外光譜分析 將火龍果莖粗多糖配制成1 mg/mL的水溶液,用紫外分光光度計在波長200～700 nm范圍內(nèi)進行掃描,觀察其在260、280 nm波長處有無吸收峰[21]。

1.2.8 火龍果莖多糖的紅外光譜分析 取適量的火龍果莖多糖粉末與溴化鉀固體粉末混合均勻,充分研磨,用壓片機壓成薄片,在4000～500 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對火龍果莖多糖得率影響 由圖2可知,在1∶20～1∶40的料液比范圍內(nèi),隨著料液比的增加,多糖得率逐漸增加,在1∶40時多糖得率達到最大值。當料液比大于1∶40之后,多糖得率降低,可能是因為料液比的增加使提取液中固形物含量降低,不利于后續(xù)操作。所以,亞臨界水提取火龍果莖多糖的料液比選擇1∶40較為適宜。

圖2 料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on polysaccharide yield

2.1.2 提取溫度對火龍果莖多糖得率影響 由圖3可知,在100～140 ℃的溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,多糖溶出率增加,多糖得率升高,在140 ℃時多糖得率達到最大值。140 ℃之后,多糖得率隨著溫度的升高降低,可能是因為提取溫度太高,導致多糖降解,從而使多糖得率降低。所以,亞臨界水提取火龍果莖多糖的提取溫度選擇140 ℃較為適宜。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on polysaccharide yield

2.1.3 提取時間對火龍果莖多糖得率影響 由圖4可知,在5～15 min的時間范圍內(nèi),隨著提取時間的增加,多糖得率逐漸增加,在15～35 min時間范圍內(nèi),多糖得率基本不變。35 min之后,多糖得率隨著提取時間的增加而減少,可能是因為在較高的亞臨界提取溫度下,長時間的高溫加熱導致火龍果莖多糖降解,從而使多糖得率降低。所以,亞臨界水提取火龍果莖多糖的提取時間選擇15 min較為適宜。

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on polysaccharide yield

2.2 正交實驗結果

由表2直觀分析表明,用亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖選擇水作為溶劑,以多糖得率為評價指標,最優(yōu)工藝組合為A2B3C2,即提取溫度140 ℃、料液比1∶50、提取時間25 min。各個因素對亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖的影響程度依次是料液比>提取溫度>提取時間。在此最優(yōu)條件下進行驗證實驗,提取火龍果莖多糖的提取率為最大值38.07%±0.15%,結果表明優(yōu)化得到提取工藝穩(wěn)定可靠。

表2 火龍果莖多糖提取正交實驗設計方案及結果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental results of extraction rate of PPL

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知,火龍果莖多糖具有顯著的DPPH自由基清除能力,且表現(xiàn)出良好的劑量關系。當質量濃度為0.5 mg/mL時,VC和火龍果莖多糖的清除率分別達到95%、37.43%。當質量濃度在0.2～1.0 mg/mL間時,火龍果莖多糖的DPPH自由基清除率增加緩慢(1.0 mg/mL時清除率達40.09%),但均具有較好的自由基清除率。

圖5 火龍果莖多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging effect of polysaccharide from red pulp Hylocereus undatus stem on DPPH radical

2.3.2 ·OH清除能力 由圖6可知,火龍果莖多糖清除·OH的能力隨著質量濃度的增加而增強,表現(xiàn)出良好的劑量效應關系。與VC相比,當多糖質量濃度在0.1～1 mg/mL之間時,火龍果莖多糖清除·OH的能力顯著低于VC,當質量濃度達到2.0 mg/mL時,VC和火龍果莖多糖的·OH清除率分別為99.86%和95.15%,可以看出火龍果莖多糖清除·OH的能力與VC相當。表明火龍果莖多糖對·OH有很明顯的清除能力。

圖6 火龍果莖多糖對·OH的清除能力Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide from red pulp Hylocereus undatus stem on hydroxyl radical

2.3.3 總還原能力 在一定的吸光度范圍內(nèi),火龍果莖多糖的總還原能力與其吸光度成正相關,吸光度值越大,表示還原能力越強。由圖7可知,在實驗質量濃度范圍內(nèi),火龍果莖多糖具的還原力隨著質量濃度的增加而增強。雖然火龍果莖的還原能力明顯低于VC,但還是具有一定的還原能力。

圖7 火龍果莖多糖的總還原能力Fig.7 Reducing capacity of polysaccharide from red pulp Hylocereus undatus stem

2.3.4 總抗氧化能力 由圖8可知,在測定質量濃度范圍內(nèi),火龍果莖多糖的總抗氧化能力明顯低于VC,但隨著火龍果莖多糖質量濃度的提高,總抗氧化能力明顯增強。

圖8 火龍果莖多糖的總抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant activity of polysaccharide from red pulp Hylocereus undatus stem

綜合以上四種體外抗氧化指標,可以得出紅心火龍果莖多糖有良好的DPPH自由基清除能力和·OH清除能力以及一定的還原力和總抗氧化能力。這表明火龍果莖多糖具有良好的抗氧化活性,可以作為天然抗氧化劑開發(fā)和利用。

2.4 火龍果莖多糖的紫外光譜分析

將火龍果莖多糖配制成1 mg/mL的溶液，在200～700 nm波長范圍內(nèi)掃描后發(fā)現(xiàn),在波長204 nm處有一個較強的吸收峰,在核酸(260 nm)和蛋白質(280 nm)的特征吸收峰處均無紫外吸收,說明樣品中不含有蛋白質和核酸。

2.5 火龍果莖多糖的紅外光譜分析

由圖9可知,火龍果莖多糖具有典型的多糖特征吸收峰[22]。在3400 cm-1附近有1個強吸收峰,是多糖分子間和分子內(nèi)的O-H伸縮振動引起的,在2934.30 cm-1處有一個強吸收峰,是CH3、CH2、CH等C-H伸縮振動,在1735.90 cm-1處有一個強吸收峰,是C=O非對稱的伸縮振動峰,說明多糖中存在酰胺基,在1419.25 cm-1附近有強的吸收峰,為C-H變角振動峰,在1150～1050 cm-1的峰是吡喃環(huán)的伸縮振動峰,可以推測火龍果莖多糖具有吡喃環(huán)結構。其他的結構有待通過實驗進一步研究確認。

圖9 火龍果莖多糖的紅外光譜Fig.9 IR of polysaccharide from red pulp Hylocereus undatus stem

3 結論

本實驗研究了亞臨界水提取紅心火龍果莖多糖的工藝,并通過正交實驗進行優(yōu)化得到最佳工藝參數(shù):提取溫度為140 ℃,提取時間為25 min,料液比為1∶50,多糖得率為38.07%±0.15%,與超聲輔助提取紅心火龍果莖多糖相比,亞臨界水提取多糖具有省時節(jié)能、多糖得率高的優(yōu)點,具有很高的實際應用價值。

對亞臨界水提取的紅心火龍果莖多糖進行體外抗氧化活性實驗表明,火龍果莖多糖有一定的還原力和總抗氧化能力并且有良好的DPPH自由基清除能力和·OH清除能力,實驗質量濃度范圍內(nèi)最大清除率分別達到40.09%和95.15%。說明火龍果莖多糖具有良好的抗氧化活性,可以作為一種天然抗氧化劑。本研究為進一步探討紅心火龍果莖多糖活性與結構的關系奠定基礎,也為火龍果莖的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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Study on the extraction and antioxidant activity of polysaccharide from red pulpHylocereusundatusstem by subcritical water

MA Ruo-ying1,YANG Hui-qiang2,+,LI Guo-sheng1,DENG Zhi-yong2,CAO Jun1,LI You-mei1,BAI Xin-peng1，*

(1.College of Food Science and Engineering,Hainan University,Haikou 570228,China; 2.18 Degrees North Latitude Fruit Industry,Dongfang 572600,China)

The extraction condition of polysaccharide from red pulpHylocereusundatusstem(PPL)by subcritical water was optimized using the single factor and orthogonal experiment. Determination of antioxidant activity and composition of polysaccharide were studied to determine the biological activity of red pulpHylocereusundatusstem and evaluate its vitro antioxidant activity,so that we can provide theoretical basis for the rational development and application of red pulpHylocereusundatusstem polysaccharide. The results showed that the optimal extraction conditions were that the extraction temperature was 140 ℃,the time was 25 min and the solid-liquid ratio was 1∶50,and the extraction rate of PPL was up to 38.07%±0.15%. The study on antioxidant revealed that the PPL had certain antioxidant activity and the maximum scavenging rate on hydroxyl radical and DPPH radical were 40.09% and 95.15%,respectively. Ultraviolet and infrared spectrum analysis showed that PPL had the typical polysaccharide IR absorption.

red pulpHylocereusundatusstem;polysaccharide;subcritical water;antioxidant

2016-11-04 +為并列第一作者

馬若影(1993-)，女，碩士研究生，研究方向:天然產(chǎn)物，E-mail：18289737675@163.com。 楊慧強(1991-)，男，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏，E-mail：56316596@qq.com。

*通訊作者:白新鵬(1963-)，男，博士，教授，研究方向：糧油工程，E-mail：xinpeng2001@126.com。

海南省自然科學基金(20153159)；海南省自然科學基金 (314075)；校企合作項目：火龍果綜合加工研究；2016年海南省普通高校研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2016-45)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0286-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.046