甘肅甘草多糖的提取、純化及其生物活性

田艷花,楊兆艷,劉林鳳,劉娜麗,郭 蕓

(山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系,山西太原 030031)

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甘肅甘草多糖的提取、純化及其生物活性

田艷花,楊兆艷,劉林鳳,劉娜麗,郭 蕓

(山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系,山西太原 030031)

以甘肅道地甘草為原料,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化超聲波輔助熱水法提取甘草粗多糖的工藝條件,粗多糖經(jīng)DEAE-52陰離子交換柱和Sephadex G100凝膠柱純化獲得甘草多糖(GCP2),利用氣相色譜、高效液相色譜聯(lián)用多角度激光散射技術(shù)(HPSEC-LLS)和紅外光譜技術(shù)對(duì)GCP2的單糖組成、分子量分布和光譜特性進(jìn)行了分析;并評(píng)價(jià)了GCP2的體外抗氧化性能和對(duì)6種供試細(xì)菌的抑制活性。結(jié)果表明,甘草多糖提取最佳工藝條件：溫度為70 ℃、時(shí)間為85 min、液料比為13∶1、超聲功率600 W,多糖平均提取得率為4.23%;GCP2是以α-糖苷鍵為主的還原性多糖,淺黃白色粉末,易溶于水;主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成,摩爾比為0.166∶5.56∶1.60。HPSEC-LLS分析結(jié)果表明GCP2是由3種不同組分組成的聚合物構(gòu)成,其中主要組分的重均分子量為1.378×105g/mol,紅外光譜顯示GCP2具有明顯的多糖特征吸收峰,具有α-吡喃糖苷鍵。甘草多糖對(duì)羥自由基和超氧陰離子具有較好的清除能力,活性大小與多糖的濃度呈明顯的線性關(guān)系,IC50值分別為3.48 mg/mL和3.43 mg/mL,同時(shí)還具有一定的還原能力和抑菌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GP2對(duì)6種細(xì)菌均具有較好的抑制作用，尤其是大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。

烏拉爾甘草,多糖,超聲提取,響應(yīng)面分析法,純化,抗氧化與抑菌活性

甘草(G.uralensisFisch.)系豆科(Leguminosae)、蝶形花亞科(Papiliantae Taub.)、甘草屬多年生草本植物,主要分布于甘肅、新疆、內(nèi)蒙古等干旱、半干旱荒漠地區(qū),具有很強(qiáng)的耐旱、耐鹽堿和耐寒特性,是我國(guó)常見的傳統(tǒng)藥用植物之一[1]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明甘草具有健脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、解毒鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗病毒等藥理活性[2-4],其有效成分主要為甘草皂苷(甘草酸)和甘草黃酮類化合物[5]。目前對(duì)甘草的研究主要集中在甘草酸、黃酮類化合物的分離、純化和藥理活性的研究[6-10]。諸多研究表明多糖具有多方面的生理活性和功能,甘草的生物學(xué)活性亦與多糖有密切關(guān)系[11-12]。因此對(duì)甘草多糖的研究已經(jīng)逐漸成為深入挖掘甘草藥理活性成分的另一熱點(diǎn)。

目前關(guān)于甘草多糖(Glycyrrhiza polysaccharide,GPS)的研究主要集中在提取工藝[13-15]、純化技術(shù)[16-17]和活性方面[18]的研究。甘草多糖作為甘草重要的活性成分之一,已被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化和抑菌等生理活性[19-20]。多糖作為一種單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物,不同的提取和純化工藝對(duì)多糖的提取得率、結(jié)構(gòu)以及活性有一定的影響。本研究以甘肅道地甘草為研究對(duì)象,對(duì)多糖的提取工藝、分離純化、抗氧化活性及抑菌活性進(jìn)行了探究,以期為甘肅道地甘草多糖的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、青霉素鈉(國(guó)藥準(zhǔn)字H23021440,100 萬U)、鏈霉素(國(guó)藥準(zhǔn)字H32025954,50萬U) 購自甘肅德生堂醫(yī)藥有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) Aladdin chemistry公司;纖維素DEAE-52和Sephadex G100 美國(guó)法瑪西亞公司;α-Glucosidase(I型)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG) Sigma公司;鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等標(biāo)準(zhǔn)品 上海生物工程有限公司;其余試劑均為分析純;大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Streptococcuspneumoniae,S.pneumoniae)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis,B.licheniformis)、乳鏈球菌(Streptococcuslactis,S.lactis)等菌株 由蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

FD-1型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器;KQ-250DB型超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司;Cary50紫外分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司;GC/6890-MS/5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(DB-5色譜柱0.2 mm×35 m×0.25 μm) 美國(guó)安捷倫;DAWN EOS多角度激光散射儀 Wyatt Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取、純化工藝流程 稱取一定量過40目篩甘草粉→石油醚脫脂→超聲波輔助熱水浸提→Sevag法去除蛋白→分離上清液、真空濃縮→4 ℃乙醇過夜沉淀→收集沉淀→丙酮脫色→真空冷凍干燥→獲得甘草粗多糖(命名為GCP)。

取一定量的甘草粗多糖溶解于去離子水中,配制成濃度為20 mg/mL的多糖溶液,上樣1.0 mL于DEAE-52纖維素柱,分別用去離子水、0.1 mol/L NaCl溶液洗脫,苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量,繪制洗脫曲線,合并主峰多糖,冷凍干燥后，溶于1.0 mL去離子水中，全部上樣于Sephadex G100凝膠柱進(jìn)一步純化，用去離子水進(jìn)行洗脫，按照1.0 mL/min流速進(jìn)行收集洗脫液，每支試管收集5 mL，苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，繪制洗脫曲線。。

1.2.2 多糖的提取工藝優(yōu)化 依據(jù)1.2.1方法,以多糖提取得率Y(%)為評(píng)價(jià)指標(biāo),結(jié)合劉文玉[15]研究?jī)?nèi)容,選取溫度、時(shí)間、液料比和超聲功率4個(gè)因素進(jìn)行單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)(單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)略),確定了后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)水平,設(shè)計(jì)了4因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),如表1。

表1 4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of four factors and three levels of response surface method

1.2.3 多糖含量測(cè)定和提取率的計(jì)算 采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,以葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo)(μg/mL),光吸收值Y為縱坐標(biāo),在485 nm處測(cè)定葡萄糖和硫酸苯酚溶液反應(yīng)后的吸光度,擬合回歸方程為Y=0.0082x+0.0074,R2=0.9983,在0～50 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。取一定體積的甘草多糖提取液或純化收集液按照苯酚-硫酸法測(cè)定吸光值,利用公式(1)計(jì)算多糖的提取得率。

式(1)

其中,C表示標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖濃度(mg/mL);N為稀釋因子;V為提取液總體積(mL);W是原料質(zhì)量(g)。

1.2.4 多糖理化性質(zhì) 配制濃度為1%的甘草多糖水溶液,分別進(jìn)行硫酸-苯酚、碘-碘化鉀、茚三酮試劑和斐林試劑反應(yīng),同時(shí)將多糖溶液置于10 cm旋光管中,用自動(dòng)旋光儀測(cè)定20 ℃下多糖的旋光度,初步分析甘草多糖的理化性質(zhì)[21]。

1.2.5 單糖組分分析 稱取10 mg多糖樣品置于安瓿瓶中,經(jīng)三氟乙酸(TFA)水解,中和,洗滌干燥以及乙?；冗^程,制備乙?；膯翁侨芤?單糖溶液經(jīng)三氯甲烷稀釋后進(jìn)行氣相色譜聯(lián)用分析。色譜條件:高純氮?dú)廨d氣,流量15 mL/min;進(jìn)樣口溫度210 ℃;升溫程序:初始溫度120 ℃,保留1 min,按30 ℃/min升溫至210 ℃保留5 min。精密稱取葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖各2 mg,配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)樣品混合液,經(jīng)衍生化后,三氯甲烷稀釋成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL,分別取1 μL進(jìn)樣,以積分面積(Y)與糖濃度(X)進(jìn)行線性回歸,線性范圍0.2～1.0 mg/mL,其中葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.102x+0.1272,R2=0.9905,半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.112x+0.0132,R2=0.9991,阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1.402X+0.0042,R2=0.9990。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖水解液中各組分的含量,推算摩爾比。

1.2.6 分子量測(cè)定 采用高效液相色譜聯(lián)用多角度激光散射技術(shù)(HPSEC-LLS)對(duì)多糖進(jìn)行分子量測(cè)定[22],配制濃度為2.0 mg/mL的多糖溶液,以0.9%的NaCl溶液作流動(dòng)相,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量為50 μL,所有溶液用0.2 μm過濾器過濾后超聲脫氣,于25 ℃進(jìn)行HPSEC-LLS測(cè)定。用Astm軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集和分析。折光指數(shù)增量(dn/dc)在25 ℃下通過Optilab折光儀于690 nm處測(cè)定,調(diào)節(jié)至0.135 mL/g。

1.2.7 紅外光譜分析 稱取1 mg干燥的多糖樣品于瑪瑙研缽中,KBr壓片,在波數(shù)4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.8 抗氧化活性的測(cè)定 分別配制濃度為0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL的多糖溶液作為供試液進(jìn)行體外抗氧化性能的測(cè)定。參照劉建利等[23]方法測(cè)定多糖清除超氧陰離子自由基的能力,參考Liu等方法[24]計(jì)算多糖對(duì)羥自由基的清除率,并采用韓雅慧[7]方法分析多糖的總還原力。

1.2.9 抑菌活性測(cè)定 參照張百剛等[25]方法進(jìn)行操作,分別以大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Streptococcuspneumoniae,S.pneumoniae)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis,B.licheniformis)、乳鏈球菌(Streptococcuslactis,S.lactis)為供試菌株,采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定不同濃度甘草多糖溶液的抑菌效果。每個(gè)菌種設(shè)3個(gè)平行組,分別以25 U/mL青霉素鈉和鏈霉素為陽性對(duì)照,在37 ℃倒置培養(yǎng)16 h,測(cè)量抑菌圈的直徑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 測(cè)定樣品設(shè)置3個(gè)平行,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。并用Origin Pro 8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。利用Design Expert 8.0.5軟件中的中心組合實(shí)驗(yàn)Central composite design(CCD)設(shè)計(jì)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘草多糖提取工藝響應(yīng)面分析

2.1.1 回歸模型的建立及方差分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示,對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方差分析結(jié)果見表3,二次多項(xiàng)式擬合方程為:

Y=-26.72+1.06A-9.26×10-3B+1.81×10-2C-1.91×10-3D+1.16×10-4AB-1.0×10-4AC+4.17×10-5AD+1.025×10-3BC+4.9125×10-4BD+4.75×10-5CD-7.72×10-3A2-1.09×10-3B2-8.57×10-3C2-2.19×10-5D2

模型F值約為135.7391,p值遠(yuǎn)小于0.01,說明二次方程模型極顯著,模型決定系數(shù)R2為0.9969,說明模型能解釋99.69%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),失擬項(xiàng)(p>0.05)不顯著,所以該模型可以用于預(yù)測(cè)甘草多糖提取的工藝優(yōu)化。從表3中可以看出,模型一次項(xiàng)A、C、D和二次項(xiàng)A2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值Y影響極顯著(p<0.01);二次項(xiàng)B2對(duì)響應(yīng)值Y影響顯著(p<0.05);交互項(xiàng)BD對(duì)響應(yīng)值Y影響極顯著(p<0.01),交互項(xiàng)BC對(duì)響應(yīng)值Y影響顯著(p<0.05),說明超聲波功率與提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖提取得率具有極顯著影響,提取時(shí)間與液料比的交互作用對(duì)多糖提取得率的影響顯著,其余交互因素的影響不顯著。由于F值越大,說明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大,根據(jù)表3中各項(xiàng)的F值大小,可知影響超聲波提取甘草多糖的4個(gè)因素影響程度從大到小依次為提取溫度、液料比、超聲波功率、提取時(shí)間。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of RSM

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

注:**表示極顯著(p<0.01),*表示顯著(p<0.05)。2.1.2 回歸模型交互作用分析 為了更直觀的觀察因素間的交互作用對(duì)甘草多糖提取得率的影響,進(jìn)行降維分析。各因素對(duì)甘草提取得率的影響以及各因素間的交互作用如圖1,由圖1可知,響應(yīng)面開口向下,隨著每個(gè)因素的增大,響應(yīng)值增大,當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,隨著因素的增大,響應(yīng)值逐漸減小,該模型有穩(wěn)定點(diǎn),且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。此外等高線越接近于圓形表示因素間交互作用不顯著,排列越疏松交互作用越顯著。通過分析表3中各因素對(duì)提取得率的顯著性差異和圖1中等高線可以看出,超聲波功率(D)與提取時(shí)間(B)的交互作用對(duì)多糖提取得率極顯著影響,提取時(shí)間(B)和液料比(C)的交互作用對(duì)多糖提取得率呈顯著影響,說明隨著超聲波功率和時(shí)間的增加,提取得率會(huì)顯著提高,可能是由于超聲波空化作用增強(qiáng),伴隨時(shí)間的增加,在一定液料比條件下,多糖的溶出率會(huì)顯著增加。

圖1 各因素及交互作用對(duì)甘草多糖提取率的影響Fig.1 Response surface of factors and interactions on the yield of polysaccharide

2.1.3 最佳工藝條件及其驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在模型范圍內(nèi),使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化獲得甘草多糖提取的最佳工藝條件為:溫度為69.45 ℃、時(shí)間為85.53 min、液料比為12.85∶1 mL/g、超聲功率564.08 W,在此條件下多糖提取得率4.40%?？紤]到實(shí)際操作的便利,將提取工藝參數(shù)修正為溫度為70 ℃、時(shí)間為85 min、液料比為13∶1 mL/g、超聲功率600 W,重復(fù)3次測(cè)得的多糖平均提取得率為4.23%±0.01%。與理論預(yù)測(cè)值相比,其相對(duì)誤差約為3.86%。表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

2.2 甘草多糖的純化及性質(zhì)研究

2.2.1 甘草多糖的分離純化 采用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量,繪制洗脫曲線如圖2A,共得到3個(gè)主峰,其中位于11～15管和16～19管的為去離子水洗脫峰(水相),位于43～48管的為0.1%NaCl溶液洗脫峰(鹽相)。三個(gè)洗脫峰中位于11～15管的多糖含量相對(duì)最高,被作為后期進(jìn)一步純化的主要對(duì)象,合并11～15管的水相洗脫多糖溶液,命名為GCP1。GCP1再經(jīng)Sephedex G-100柱層析,以去離子水進(jìn)行洗脫,苯酚硫酸法示蹤,洗脫曲線如圖2B。從圖2B可以看出GCP1經(jīng)去離子水洗脫后,在9～19管中呈現(xiàn)單一峰形,因此初步判定GCP1為同一組分,收集洗脫峰,真空冷凍干燥,命名為GCP2。GCP2進(jìn)一步經(jīng)理化性質(zhì)測(cè)定,結(jié)果顯示GCP2經(jīng)茚三酮反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)為陰性、雙縮脲反應(yīng)全為陰性,表明GCP2中確已無淀粉和蛋白,而硫酸—苯酚反應(yīng)和斐林試劑反應(yīng)呈陽性,則說明GCP2是還原性多糖。GCP2溶液在20 ℃下測(cè)定比旋光度為+121.18 °,具有較大的比旋正數(shù),說明多糖中糖殘基間苷鍵類型為α-糖苷鍵[21]。

圖2 DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-100對(duì)甘草多糖的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of GCP by DEAE-52 and Sephadex G-100 column chromatography

2.2.2 GCP2單糖組分分析 標(biāo)準(zhǔn)單糖的GC色譜分析,鼠李糖、阿拉伯糖、D-木糖、甘聚糖、葡萄糖和半乳糖的保留時(shí)間分別為8.79、9.23、9.63、16.7、17.14和18.02 min。GCP2經(jīng)水解、柱前衍生化后進(jìn)樣,GC-MS分析結(jié)果如圖3,從圖3中可以看出,GCP2色譜組分比較復(fù)雜。根據(jù)不同單糖的保留時(shí)間初步判定GCP2主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成,其摩爾比為0.166∶5.56∶1.60。熱娜·卡斯木等[21]利用氣相色譜法研究了脹果甘草多糖純化后的單糖組成,得出純化后多糖主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成,摩爾比為11.7∶3.3∶1.0;孫潤(rùn)廣等[26]對(duì)甘草多糖分離純化后,分析表明甘草多糖由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖組成,并以葡萄糖或半乳糖為主鏈;而周蓉等[27]和艾則孜[28]分別對(duì)甘草多糖分離純化后,經(jīng)高效毛細(xì)管電泳和HPLC-ELSD法分析表明,甘草多糖組分由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖組成,并以葡聚糖為主鏈。由此可以認(rèn)為阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖是甘草多糖的主要單糖組成。

圖3 GCP2 GC色譜圖Fig.3 GC chromatogram of GCP2

2.2.3 GCP2分子量分布 通過凝膠滲透色譜(HPSEC)、多角度激光光散射(MALLS)與示差折光檢測(cè)儀(RI)聯(lián)用色譜分析GCP2的分子量及其分布,各組分的數(shù)均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)、分布寬度指數(shù)PD(Mw/Mn)如表3。從表3中可以看出GCP2是由3種不同組分組成的聚合物構(gòu)成,其中主要組分為Peak1,其重均分子量為1.378×105g/mol。糖的分子量分布形態(tài)受聚合方式和聚合因素的影響而不同,分子量分布主要由分布寬度指數(shù)PD(Mw/Mn)表示,分子量分布越寬,分散度就越大,對(duì)于窄的分子量分布,其Mw/Mn比值越接近1。因此,從表3中的PD值可以看出GCP2主要由3種不同分子量分布的聚合物組成,其中Peak1和Peak3兩組分摩爾質(zhì)量分布較Peak2均一。

表3 GCP2的分子量分布特性Table 3 Molecular characterization of GCP2 by HPSEC-LLS

表4 GCP的抗氧化特性Table 4 Antioxidant activities of GCP

表5 GCP對(duì)6種菌株的抑菌圈直徑(mm)Table 5 Inhibition zone diameter of the effect of GCP on the 6 strains(mm)

2.2.4 GCP2紅外光譜特性 參考張惟杰[29]關(guān)于多糖紅外光譜的描述,認(rèn)為3000～2800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)的吸收峰是糖類C-H伸縮振動(dòng)引起的,1400～1200 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰是糖類C-H變角振動(dòng)造成的,在這兩個(gè)區(qū)域的吸收峰是糖類的特征峰。GCP2紅外分析結(jié)果如圖4,在2896 cm-1有一個(gè)弱吸收峰,正是C-H伸縮振動(dòng)峰,3406 cm-1處的寬峰是由O-H伸縮振動(dòng)引起的,1026 cm-1處的吸收峰可能是由O-H變角振動(dòng)引起的,表明GCP2中含有-OH基團(tuán);而在1648 cm-1處的吸收峰主要是由CO-基團(tuán)的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的,1414 cm-1吸收峰是由-COOH的C-O伸縮振動(dòng)引起的,1026 cm-1處的吸收峰是由-COOH的O-H變角振動(dòng)引起的,說明GPS1中含有-COOH基團(tuán);835 cm-1處吸收峰表明GCP2中有α-吡喃糖苷鍵的存在。

圖4 GCP2紅外光譜掃描圖Fig.4 Infrared absorption spectrum of GCP2

2.3 GCP2抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 羥自由基的清除作用 分別研究了不同濃度下甘草多糖和VC對(duì)·OH的清除作用,結(jié)果如表4,供試樣液對(duì)·OH的清除率隨著濃度的增加而增大,VC在0.2 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到72.37%,其IC50為0.125 mg/mL;而甘草多糖在4.0 mg/mL時(shí)達(dá)到40.98%,IC50值約為3.48 mg/mL。

通過補(bǔ)充必要的基礎(chǔ)知識(shí)之后，開始進(jìn)入分組項(xiàng)目開發(fā)階段。導(dǎo)師先根據(jù)選題，布置學(xué)生進(jìn)行文獻(xiàn)檢索。讓學(xué)生充分了解項(xiàng)目的研究背景以及當(dāng)前研究的進(jìn)展。文獻(xiàn)檢索要求學(xué)生查閱一定數(shù)量的文獻(xiàn)，整理要點(diǎn)，提交相關(guān)文檔。這樣一來，學(xué)生增加了閱讀量，同時(shí)提高寫作水平和表達(dá)能力，為后面階段撰寫論文和專利打下基礎(chǔ)。

2.3.3 總還原力的測(cè)定 生物活性化合物的還原能力與其抗氧化能力之間存在一定關(guān)系,還原能力越強(qiáng)其抗氧化活性也越高,各個(gè)樣品反應(yīng)后生成物在700 nm處吸光值的大小即反映了其抗氧化能力的大小,吸光值越大則樣品的還原能力越強(qiáng)。甘草多糖與VC還原能力如表4所示。由表4可知,VC和甘草多糖都隨著濃度的增大吸光度也逐漸增大,樣品液濃度1.0～3.0 mg/mL時(shí)的吸光度值小于VC濃度在0. 01～0.2 mg/mL時(shí)吸光度,還原能力較弱。

2.4 GCP2抑菌活性測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定了不同濃度GCP2對(duì)多種細(xì)菌的抑制活性,結(jié)果如表5,可以看出GCP2對(duì)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、乳鏈球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯菌)均有一定的抑制作用,尤其是3.0 mg/mL和4.0 mg/mL GCP2溶液對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌效果最好,抑菌圈直徑達(dá)到11 mm,陽性對(duì)照抑菌圈大小分別為7.5 mm和11 mm。有研究表明甘草根、莖和葉片中都含有抑菌活性成分,尤其是黃酮類化合物,具有很好的抑菌和抗腫瘤活性[16-19]。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了甘草多糖最佳提取的工藝參數(shù),即溫度為70 ℃、時(shí)間為85 min、液料比為13∶1 mL/g、超聲功率600 W,多糖平均提取得率為4.23%。

分別采用DEAE-52纖維素和Sephadex G100凝膠柱純化對(duì)甘草多糖進(jìn)行了純化,并對(duì)主要組分GCP2的單糖組成和分子量分布進(jìn)行了研究,得出GCP2主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成,摩爾比為0.166∶5.56∶1.60;GCP2由3種不同組分組成的聚合物構(gòu)成,主要組分重均分子量為1.378×105g/mol。光譜分析和多糖理化性質(zhì)綜合判定GCP2存在α-吡喃糖苷鍵。

甘草多糖溶液對(duì)6種供試菌株具有一定的抑菌作用,尤其是對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌抑制效果顯著,在樣品濃度為4 mg/mL時(shí),抑菌圈均可達(dá)到11 mm。

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Extraction,purification and biological activity of polysaccharide fromGlycyrrhizauralcnsisin Gansu

TIAN Yan-hua,YANG Zhao-yan,LIU Lin-feng,LIU Na-li,GUO Yun

(Food Engineering Department of Shanxi Pharmaceutical Vocational College,Taiyuan 030031,China)

GlycyrrhizauralensisFisch.;polysaccharide;ultrasonic extraction;response surface methodology;purification;antioxidant and antibacteria activity

2016-08-12

田艷花(1981-)，女，碩士，講師，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:58952954@qq.com。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0296-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.048