黑曲霉果糖基水解酶的重組表達(dá)及酶學(xué)特征分析

董自星,肖 華,王靜培,張志萌,王 君,路福平,*

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院與工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

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黑曲霉果糖基水解酶的重組表達(dá)及酶學(xué)特征分析

董自星1,2,肖 華2,王靜培2,張志萌2,王 君2,路福平2,*

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院與工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

目的:果糖基轉(zhuǎn)移酶在新型果糖基衍生品的制備過(guò)程中具有重要作用,獲得酶活高、性能優(yōu)良的果糖基水解酶是關(guān)鍵。方法:利用MEGA 4.0以及Clustal X2等軟件對(duì)黑曲霉的基因組進(jìn)行分析,遴選了5個(gè)果糖基水解酶基因,接著將它們?cè)诋叧嘟湍钢羞M(jìn)行了克隆表達(dá),并研究了重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果:在搖瓶水平上,重組酶Fru1和Fru5的酶活分別為1360和1560 U/mL,遠(yuǎn)高于目前已報(bào)道的果糖基水解酶的酶活。重組酶Fru1的最適反應(yīng)溫度和pH分別為45 ℃和5.5,EDTA對(duì)它有微弱的促進(jìn)作用,Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+和Ca2+會(huì)輕微地抑制酶活,該酶對(duì)蔗糖既有水解作用,又有轉(zhuǎn)苷活性,還可以水解菊粉中的二糖到五糖;重組酶Fru5的最適反應(yīng)溫度和pH分別為50 ℃和5.0,Li+、Na+和EDTA對(duì)其酶活有促進(jìn)作用,但Fe2+則強(qiáng)烈抑制酶的活性,它還可以水解蔗糖以及菊粉中幾乎所有的大分子糖。結(jié)論:本研究為果糖基水解酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其在新型果糖基衍生品制備過(guò)程中的應(yīng)用提供了可能途徑。

果糖基水解酶,新型果糖基衍生品,黑曲霉,重組表達(dá),酶學(xué)性質(zhì)

在自然界中,果糖以單體形式大量存在于水果和蜂蜜中;果糖和葡萄糖通過(guò)糖苷鍵連接形成蔗糖,其廣泛分布于甘蔗和甜菜中;以果聚糖形式(菊粉)存在于細(xì)菌、真菌和高等植物中[1]。果糖及其果糖基衍生物(如高果糖漿、果葡糖漿、結(jié)晶果糖和低聚果糖等)因其具有獨(dú)特的甜度與生理保健功能,在醫(yī)藥、食品、乳制品、保健品以及飼料行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景。

果糖基水解酶在新型果糖基衍生品的制備過(guò)程中起著重要作用。它們包括細(xì)菌、真菌和植物來(lái)源的蔗糖酶(invertase)、菊粉酶(inulinase)、果聚糖酶(levanase)以及果聚糖蔗糖酶(levansucrase)等[2]。其中蔗糖酶(EC 3.2.1.26)可以將蔗糖水解為果糖和葡萄糖,用于果葡糖漿的生產(chǎn)。與傳統(tǒng)酸水解法相比,酶法具有精制工序簡(jiǎn)單、產(chǎn)品品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn),有利于果葡糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)[3]。此外,蔗糖酶還具有果糖基轉(zhuǎn)移活性,可以產(chǎn)生低聚果糖(fructooligosaccharides)[4]和低聚乳果糖(lactosucrose)[5]等。利用菊粉外切酶(EC 3.2.1.80)生產(chǎn)高果糖漿(high fructose corn syrup)是目前最好的方法。該法對(duì)設(shè)備要求低,可直接將菊粉轉(zhuǎn)化成95%(w/v)以上的果糖,易于分離純化[6]?？梢蕴娲缘矸蹫樵?經(jīng)α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖異構(gòu)酶酶解生產(chǎn)高果糖漿的方法[7]。菊粉內(nèi)切酶則可以用來(lái)生產(chǎn)低聚果糖等[8]。

表1 引物列表Table 1 Primers used in this study

注:下劃線部分為限制性酶切位點(diǎn)。長(zhǎng)期以來(lái),作用于果糖或果糖基的酶系一直沒(méi)有得到深入研究。雖然國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家也對(duì)菊粉酶等進(jìn)行了許多研究,但是基本上都停留在實(shí)驗(yàn)室水平,工業(yè)應(yīng)用規(guī)模很少[9]。其主要原因是微生物產(chǎn)酶量低,酶制劑生產(chǎn)成本高。因此,篩選高表達(dá)的新菌種或構(gòu)建高表達(dá)的重組菌是解決這個(gè)問(wèn)題的主要方法。

本文采用生物信息學(xué)的方法從黑曲霉基因組中遴選到5個(gè)可能的果糖基水解酶基因。并以黑曲霉CICIM F0510為出發(fā)菌株,提取其總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以此為模板,并將其果糖基水解酶基因在畢赤酵母中進(jìn)行克隆與表達(dá),進(jìn)而研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì),為后續(xù)果糖基水解酶的工業(yè)化生產(chǎn)、基因水平的改造及其在新型果糖基衍生品制備過(guò)程中的應(yīng)用提供可能途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(EscherichiacoliJM109) 由本實(shí)驗(yàn)室保藏;黑曲霉(AspergillusnigerCICIM F0510) 從自然樣本分離保藏的野生菌株,由江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供;畢赤酵母(PichiapastorisGS115)和質(zhì)粒pPIC9K 購(gòu)于Invitrogen公司;大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基;黑曲霉采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);畢赤酵母及其重組菌的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法按照Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊(cè)進(jìn)行;本研究中用到的引物根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)上公布的序列進(jìn)行設(shè)計(jì),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,具體見(jiàn)表1;限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA聚合酶、連接酶和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑 均購(gòu)于TaKaRa公司;TRNzol總RNA提取試劑 由康為世紀(jì)生物科技有限公司提供;Plasmid Mini Kit I和小量DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒 購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司;胰蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast Extract) 英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PTC-200型PCR儀 MJ Research Inc.;DYY-III-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠;全自動(dòng)凝膠成像儀 美國(guó)SYNGENE公司;Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀 美國(guó)BIO-RAD公司;HW SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;SP-2012UV型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;Agilent HP 1100高效液相色譜儀 美國(guó)惠普公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果糖基水解酶的生物信息學(xué)分析 利用NCBI查詢不同來(lái)源的果糖基水解酶的氨基酸序列。通過(guò)軟件MEGA 4.0以鄰近法(Neighbour-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[10],分析它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,并通過(guò)軟件Clustal X2和BioEdit對(duì)這些酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和分析。

1.2.2 黑曲霉果糖基水解酶基因的克隆 采用TRNzol總RNA提取試劑提取黑曲霉的總RNA。以總RNA為模板,以O(shè)ligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,然后分別以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出5個(gè)果糖基水解酶基因(引物見(jiàn)表1)?；虻臏y(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。分別將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pPIC9K用SnaB I和EcoR I進(jìn)行酶切,再將它們純化后進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,并提取其質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.3 陽(yáng)性重組菌的篩選和表達(dá) 將構(gòu)建成功的5個(gè)重組質(zhì)粒以及對(duì)照空質(zhì)粒pPIC9K均用Sal I進(jìn)行線性化。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后電轉(zhuǎn)化[11]P.pastorisGS115,均勻涂布于MD平板,30 ℃恒溫培養(yǎng)至單菌落形成。挑取多個(gè)單克隆重組酵母分別接種于終濃度為0.5、2 mg/mL的YPD/G418平板上進(jìn)行篩選,于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落,挑取生長(zhǎng)情況好的重組酵母菌株保存。

將構(gòu)建成功的畢赤酵母重組菌GS115(pPIC9K-fru1)、GS115(pPIC9K-fru2)、GS115(pPIC9K-fru3)、GS115(pPIC9K-fru4)和GS115(pPIC9K-fru5)在YPD平板上進(jìn)行純化,挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=2～6,約18～20 h)。按1%(v/v)接種量接入25 mL BMGY培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。室溫下5000 r/min離心5 min收集酵母細(xì)胞,棄上清,將細(xì)胞重懸于50 mL BMMY培養(yǎng)基中至OD600=1.0,30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開(kāi)始誘導(dǎo)。每隔24 h補(bǔ)加0.5%的甲醇以維持誘導(dǎo),同時(shí)取樣進(jìn)行酶活測(cè)定。發(fā)酵結(jié)束后,12000 r/min離心10 min收集發(fā)酵上清液,即為粗酶液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 果糖基水解酶的酶活測(cè)定 以蔗糖為底物,采用DNS法[12]進(jìn)行酶活測(cè)定。取9 mL含有10%(w/v)蔗糖的0.1 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)于三角瓶中,加入1 mL酶液,充分混勻后,于50 ℃、200 r/min水浴搖床反應(yīng)60 min。然后取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使糖的濃度為0.1～0.8 mg/mL。取稀釋后的糖液0.5 mL于15 mL刻度試管中,加DNS試劑1.5 mL,沸水煮沸15 min,冷卻后加入10.5 mL去離子水,在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。用葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.648x-0.0143,R2=0.9975。

酶活單位定義:在最適條件下,每分鐘水解蔗糖產(chǎn)生1 μmol的葡萄糖所需的酶量即為1個(gè)酶活力單位。

1.2.5 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定 在不同溫度(30、40、45、50、55、60、65 ℃)和pH6.0的緩沖液條件下,測(cè)定酶活,將酶活最高者定為100%,其它溫度下的酶活與最高酶活的比值即為待測(cè)酶液在該溫度下的相對(duì)酶活;將酶分別置于上述溫度的恒溫水浴中保溫60 min,迅速取出測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)水浴處理的酶活為100%,以殘余酶活力對(duì)溫度作圖。

1.2.6 最適作用pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定 用不同pH的0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和50 ℃條件下測(cè)定酶活,酶活數(shù)值最大者計(jì)為100%;在上述不同pH的緩沖液里和50 ℃的條件下保溫60 min,迅速取出進(jìn)行酶活反應(yīng),測(cè)定重組酶的活力。酶活數(shù)值最大者計(jì)為100%。

1.2.7 金屬離子和螯合劑對(duì)酶活的影響 在果糖基水解酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中,加入終濃度為5 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Ni2+、Mn2+、Li+和EDTA,在最適反應(yīng)pH和溫度下測(cè)定(Fru1,pH5.5、45 ℃;Fru5,pH5.0、50 ℃)果糖基水解酶的酶活。以不加金屬離子和螯合劑的反應(yīng)體系的酶活為100%。

1.2.8 底物催化特征分析 按照酶活測(cè)定的方法,分別以10%(w/v)的蔗糖和菊粉為底物,將酶與底物在50 ℃反應(yīng)60 min后,沸水浴10 min,冷卻至室溫后8500 r/min離心4 min,取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后,進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件:高效液相色譜儀(蒸發(fā)光散射檢測(cè)器)進(jìn)行檢測(cè),色譜柱為PrevailTMCarbohydrate ES 5 μ糖柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,其漂移管的溫度為90 ℃,氣體流速為2.2 L/min;流動(dòng)相為乙腈與水的混合液(體積比為65∶35);柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)分析借助Origin 8.0軟件處理完成;采用SAS軟件進(jìn)行ANOVA分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同來(lái)源果糖基水解酶的生物信息特征比較

雖然黑曲霉CBS 513.88的基因組信息(EMBL AM270980～AM270998)已經(jīng)被解析[13],但是其果糖基水解酶系的具體功能及性質(zhì)的差異還沒(méi)有確定。為了研究這些酶的結(jié)構(gòu)、功能及其潛在的應(yīng)用價(jià)值,利用BLAST等軟件從NCBI中共查到5個(gè)來(lái)源于黑曲霉的果糖基水解酶基因,分別命名為fru1、fru2、fru3、fru4和fru5。它們編碼的酶分子AngFru1、AngFru4和AngFru5分別具有蔗糖酶、內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶活性,而AngFru2和AngFru3具有假定的蔗糖酶活性。

2.1.1 不同來(lái)源果糖基水解酶的親緣關(guān)系分析 利用軟件MEGA 4.0將5個(gè)黑曲霉來(lái)源的果糖基水解酶與已報(bào)道的果糖基水解酶的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,其結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,這些果糖基水解酶可以分為五類(lèi):內(nèi)切菊粉酶、細(xì)菌蔗糖酶或菊粉酶、外切菊粉酶、酵母菌蔗糖酶或菊粉酶、絲狀真菌蔗糖酶。其中,AngFru1、AngFru2和AngFru3屬于絲狀真菌蔗糖酶,而AngFru4和AngFru5分別屬于內(nèi)切菊粉酶和外切菊粉酶。

2.1.2 果糖基水解酶的氨基酸序列比對(duì) 氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果表明,這些序列之間的相似度為10.27%～98.45%,平均值為27.65%。這些酶都具有果糖基水解酶的8個(gè)比較保守的結(jié)構(gòu)域,包括A、B、B1、C、D、E、F和G(圖2)[14]。其中結(jié)構(gòu)域A、D和E中還包含3個(gè)高度保守的酸性氨基酸殘基(圖2中灰色標(biāo)出的氨基酸殘基),它們位于糖苷水解酶32(GH32)家族蛋白的活性位點(diǎn)[14]。

通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的果糖基水解酶進(jìn)行親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的分析以及氨基酸序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)A.nigerCBS 513.88來(lái)源的5個(gè)酶具有果糖基水解酶的高度保守的結(jié)構(gòu)域。因此,它們均屬于果糖基水解酶家族。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

進(jìn)一步制備黑曲霉CICIM F0510的cDNA,以此為模板,對(duì)上述5個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并成功克隆入pPIC9K的SnaB I和EcoR I位點(diǎn),獲得重組質(zhì)粒。每個(gè)重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖3。含fru1的重組質(zhì)粒酶切出1.9 kb和9.3 kb兩條帶,與基因fru1和質(zhì)粒pPIC9K的大小之和一致;其它四個(gè)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證結(jié)果也是正確的。這表明五個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并將它們分別命名為pPIC9K-fru1、pPIC9K-fru2、pPIC9K-fru3、pPIC9K-fru4和pPIC9K-fru5。

表2 黑曲霉果糖基水解酶的基本特征Table 2 Properties of fructosyl hydrolases from A. niger

圖2 不同來(lái)源的果糖基水解酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of fructosyl hydrolases from different microorganisms注:(*),保守的氨基酸;(:),保守的替換;(.),半保守的替換;虛線表示的是空格。保守的酸性氨基酸殘基用灰色標(biāo)出,8個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(A,B,B1,C,D,E,F和G)在上方標(biāo)出。

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmids by double enzyme digestion注:M:1kb DNA ladder;1:fru1;2:fru2;3:fru3;4:fru4;5:fru5。

通過(guò)測(cè)序結(jié)果可知,除了有少數(shù)堿基和氨基酸的差異,fru2、fru4和fru5的測(cè)序結(jié)果與原始序列基本一致;而fru1和fru3的測(cè)序結(jié)果與原始序列完全一致(表2)。

2.3 重組果糖基水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述構(gòu)建獲得的5個(gè)重組質(zhì)粒線性化后,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,獲得重組菌GS115(pPIC9K-fru1)、GS115(pPIC9K-fru2)、GS115(pPIC9K-fru3)、GS115(pPIC9K-fru4)和GS115(pPIC9K-fru5)。采用含有50 mL培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),在甲醇的誘導(dǎo)下進(jìn)行酶液制備。發(fā)酵持續(xù)120 h,離心收集獲得重組果糖基水解酶Fru1、Fru2、Fru3、Fru4和Fru5的粗酶液。通過(guò)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn),重組酶Fru1和Fru5的酶活分別為1360和1560 U/mL(表3),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前報(bào)道的菊粉酶[15]和蔗糖酶[12,16]的酶活,具有潛在的工業(yè)化前景;Fru2表達(dá)水平很低,檢測(cè)不到酶活,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2];而Fru3和Fru4的酶活幾乎檢測(cè)不到,后續(xù)會(huì)將這三個(gè)基因在其它表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。同步以pPIC9K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115獲得含有空白質(zhì)粒的重組菌,其發(fā)酵液檢測(cè)不到果糖基水解酶酶活。

表3 重組果糖基水解酶的酶活Table 3 Activity of recombinant fructosyl hydrolases

注:“-”表示未檢測(cè)到酶活。

2.4 重組果糖基酶的酶學(xué)特征的研究

2.4.1 酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性 進(jìn)一步對(duì)重組酶Fru1和Fru5的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。在不同溫度下測(cè)定Fru1和Fru5的酶活,結(jié)果見(jiàn)圖4(a)。重組酶Fru1的最適反應(yīng)溫度為45 ℃,低于黑曲霉TH-2來(lái)源的蔗糖酶的最適反應(yīng)溫度(65 ℃)[12];而重組酶Fru5的最適作用溫度為50 ℃,高于細(xì)菌來(lái)源菊粉酶的最適反應(yīng)溫度(30～37 ℃),但低于鏈霉菌及青霉菌菊粉酶的最適反應(yīng)溫度(60～70 ℃)[8]。溫度過(guò)高或過(guò)低,酶活均會(huì)迅速下降,溫度的變化對(duì)二種酶活都有較大的影響。熱穩(wěn)定性的研究表明,重組酶Fru1和Fru5分別在30～45 ℃和40～55 ℃內(nèi)較穩(wěn)定(殘留的酶活在80%以上);而且在50～65 ℃內(nèi),Fru5的熱穩(wěn)定性優(yōu)于Fru1(圖4b)。此外,殘留酶活小于40%的溫度范圍分別為55 ℃以上和65 ℃以上。

圖4 Fru1和Fru5的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性 Fig.4 The optimal temperature and thermostability of Fru1 and Fru5注:a:最適作用溫度;b:熱穩(wěn)定性。

2.4.2 酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性 在不同pH反應(yīng)條件下測(cè)定重組酶Fru1和Fru5的酶活,結(jié)果如圖5(a)所示。重組酶Fru1與Fru5的最適作用pH分別為5.5和5.0,而且它們均具有相對(duì)寬泛的pH作用范圍(pH4.5～6.0和pH4.0～5.5),在該pH范圍內(nèi)相對(duì)酶活在80%以上。Fru1的最適作用pH高于黑曲霉TH-2的蔗糖酶的最適反應(yīng)pH(4.4)[12];而Fru5的最適反應(yīng)pH與已報(bào)道的黑曲霉來(lái)源菊粉酶的最適反應(yīng)pH(4.0～5.0)[8,15]接近,也與已報(bào)道的絲狀真菌和酵母菌來(lái)源菊粉酶的最適pH(4.5～6.0)接近[8]。由pH穩(wěn)定性的研究結(jié)果可知,在不同pH的0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中孵育1 h后,重組酶Fru1和Fru5分別在pH3.0～7.0和pH5.0～6.5的偏酸性條件下穩(wěn)定性較好,殘留酶活在80%以上(圖5b)。與Fru5和來(lái)源于黑曲霉TH-2的蔗糖酶[12]相比,Fru1在較寬泛的pH范圍內(nèi)相對(duì)酶活穩(wěn)定。

圖5 Fru1和Fru5的最適作用pH及pH穩(wěn)定性 Fig.5 The optimum pH and pH stability of Fru1 and Fru5 注:a:最適作用pH;b:pH穩(wěn)定性。

2.4.3 離子和金屬螯合劑對(duì)酶的影響 各種金屬離子和螯合劑對(duì)重組酶酶活的影響見(jiàn)表4。由表4可知,K+、Zn2+和Mg2+對(duì)重組酶Fru1的酶活有微弱的抑制作用,而Fe2+、Na+、Co2+、Cu2+和Ca2+對(duì)其酶活有抑制作用,其中Ca2+的抑制作用比較顯著;Li+和Na+對(duì)Fru5的酶促反應(yīng)有促進(jìn)作用,而且Na+的促進(jìn)作用比較明顯;Fe2+能顯著地抑制其酶活,而Zn2+、Mg2+、Ni2+、Mn2+和Co2+對(duì)其酶活有微弱的抑制作用。此外,EDTA對(duì)重組酶Fru1和Fru5的酶活均有微弱的促進(jìn)作用,表明它們不是金屬酶[8]。

表4 金屬離子和螯合劑對(duì)Fru1和Fru5酶活的影響Table 4 Effects of metal ions and chelating agents on the activity of Fru1 and Fru5

圖6 重組酶Fru1和Fru5作用于蔗糖的產(chǎn)物分析 Fig.6 HPLC profile of sucrose catalyzed by recombinant Fru1 and Fru5注:a:蔗糖空白對(duì)照;b:Fru1;c:Fru5;峰1、2、3分別代表蔗糖、葡萄糖和果糖;峰4、5為高聚合度物質(zhì)。

注:“-”表示未進(jìn)行酶活測(cè)定;*表示有顯著性差異(p<0.05)。2.4.4 重組酶的底物催化特征分析 不同來(lái)源的蔗糖酶和菊粉酶與蔗糖和菊粉的結(jié)合及作用方式有差異,從而生成的產(chǎn)物也不同。為了考察重組酶Fru1和Fru5對(duì)蔗糖和菊粉作用產(chǎn)物聚合度的分布,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了HPLC分析。當(dāng)以蔗糖為底物時(shí),重組酶Fru1既可以將蔗糖水解為葡萄糖和果糖,也可以將其轉(zhuǎn)化為高聚合度的產(chǎn)物(圖6b)。因此,它既有水解作用,又有合成作用。而Fru5只能將蔗糖水解,并無(wú)合成作用(圖6c)。后續(xù)可以利用重組酶Fru1和Fru5對(duì)蔗糖的水解作用制備果葡糖漿[8],而Fru1對(duì)蔗糖的合成作用在低聚果糖、低聚乳果糖等新型果糖基衍生品的制備過(guò)程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。

由圖7(a)可知,菊粉由13種物質(zhì)混合組成。當(dāng)以菊粉為底物時(shí),重組酶Fru1能水解掉二糖、三糖、四糖和部分五糖,對(duì)六糖以上的多糖沒(méi)有作用(圖7b),它是否對(duì)菊粉有合成作用,還有待進(jìn)一步分析。而Fru5能將不同聚合度的菊粉全部水解為單糖(圖7c),因此它對(duì)菊粉只有水解作用,沒(méi)有合成作用。因此,Fru5具有典型的外切菊粉酶的底物催化特征[17],可以用于高果糖漿及結(jié)晶果糖的生產(chǎn)過(guò)程中。此外,菊粉經(jīng)過(guò)外切菊粉酶水解后產(chǎn)生的果糖可以作為發(fā)酵碳源,用于生產(chǎn)生物乙醇、生物油脂、乳酸、檸檬酸和單細(xì)胞蛋白等[8,18]。

圖7 重組酶Fru1和Fru5作用于菊粉的產(chǎn)物分析 Fig.7 HPLC profile of inulin catalyzed by recombinant Fru1 and Fru5注:a:菊粉空白對(duì)照;b:Fru1;c:Fru5;峰1、2、3、4、5、6、7…12分別代表G(F)、GF(F2)、GF2(F3)、GF3(F4)、GF4(F5)、GF5(F6)、GF6(F7)…,其中,G和F分別為葡萄糖和果糖。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)分子克隆與遺傳重組技術(shù)克隆及表達(dá)了黑曲霉來(lái)源的全部果糖基轉(zhuǎn)移酶,獲得的重組酶Fru1和Fru5的酶活分別為1360和1560 U/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前已報(bào)道的蔗糖酶和菊粉酶的活性,為其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。此外,酶學(xué)性質(zhì)的研究表明,重組酶Fru1對(duì)蔗糖具有水解和合成活性,這為其用于果葡糖漿、低聚果糖以及低聚乳果糖的生產(chǎn)提供了可能。Fru5對(duì)蔗糖和菊粉都具有明顯的水解作用,為其在高果糖漿和結(jié)晶果糖的制造以及發(fā)酵碳源的制備等方面提供了重要的指導(dǎo)意義。

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Recombinant expression and biochemical characterization of fructosyl hydrolases fromAspergillusniger

DONG Zi-xing1,2,XIAO Hua2,WANG Jing-pei2,ZHANG Zhi-meng2,WANG Jun2,LU Fu-ping2,*

(1.Department of Biochemical Engineering,College of Chemical Engineering and Materials Science,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

Objective:Fructosyl hydrolase plays a significant role in the preparation of novel fructose derivatives. It is important to obtain an efficient fructosyl hydrolase with high activity.Methods:Five fructosyl hydrolase-encoding genes in theAspergillusnigergenome were selected and analyzed by MEGA 4.0,Clustal X2 and other softwares. Subsequently,these genes were successfully cloned and expressed inPichiapastorisfollowed by comprehensive investigation of their biochemical properties. Results:At the shake-flask fermentation level,the activities of recombinant Fru1 and Fru5 were determined to be 1360 and 1560 U/mL,respectively,which were much higher than those of the fructosyl hydrolases ever reported. The optimum temperature and pH of recombinant enzyme Fru1 were 45 ℃ and 5.5,respectively. Its enzymatic activity was slightly enhanced by EDTA and inhibited by Na+,Co2+,Cu2+and Ca2+. Interestingly,this enzyme showed both hydrolytic and transglycosylation activities toward sucrose,and hydrolyzed short-chain inulin with degree of polymerization of 2～5. The temperature and pH optima of recombinant Fru5 were 50 ℃ and 5.0,respectively. It was remarkably enhanced by Li+,Na+and EDTA,and strongly inhibited by Fe2+. Fru5 could also hydrolyze sucrose and almost all polysaccharides in inulin. Conclusions:Our results have paved the way for the industrial manufacturing of fructosyl hydrolases and their applications in the production of novel fructose derivatives.

fructosyl hydrolases;novel fructose derivatives;Aspergillusniger;recombinant expression;enzymatic properties

2016-10-11

董自星(1986-)，男，博士，助理研究員，研究方向：酶工程與技術(shù)，E-mail:dzx@tust.edu.cn。

*通訊作者:路福平(1967-)，男，博士，教授，研究方向：應(yīng)用微生物與酶工程，E-mail:lfp@tust.edu.cn。

TS201.2

A

1002-0306(2017)10-0178-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.026