HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿含量

杜憬生+杜楚玲+邵長(zhǎng)麗+蔡宇+黃志海

摘要：目的 建立不同產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿含量測(cè)定的HPLC方法。方法 以C18為色譜柱填充劑，以乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，建立8批不同來(lái)源的北豆根HPLC圖。結(jié)果 建立了檢測(cè)北豆根的HPLC條件，在20～100 ?g/mL范圍內(nèi)，對(duì)照品進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 5），蝙蝠葛堿的平均回收率為100.30%，RSD=1.000%。不同來(lái)源的北豆根中蝙蝠葛堿含量不同。結(jié)論 本研究建立的HPLC方法靈敏，準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，可作為北豆根中蝙蝠葛堿含量的檢測(cè)方法。

關(guān)鍵詞：北豆根；蝙蝠葛堿；含量測(cè)定；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.017

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）06-0068-03

Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of dauricine in Menispermi Rhizoma from different producing areas. Methods C18 was set as chromatographic column filler， with acetonitrile- water-triethylamine （45：55：0.1） as the mobile phase， 284 nm as the ultraviolet wavelength detection， 1 mL/min as the flow rate， 30 ℃ as the column temperature. HPLC chromatograms of eight different batches of Menispermi Rhizoma were established. Results HPLC testing conditions of Menispermi Rhizoma was established. Within 20–100 ?g/mL， there was a good linear relationship between the injection volume of the reference substance and the peak area （r=0.999 5）. The average recovery of dauricine was 100.30%， RSD=1.000%. The contents of dauricine in Menispermi Rhizoma from different producing areas were different. Conclusion The HPLC method is with sensitivity， accuracy， precision， good reproducibility and simple operation， which can be used as detection method to determine the content of dauricine in Menispermi Rhizoma.

Key words： Rhizoma Menispermi； dauricine； content determination； HPLC

北豆根為防己科植物蝙幅葛Menispermum dauricum DC.的干燥根莖，具有清熱解毒、祛風(fēng)止痛功效，用于治療咽喉腫痛、熱毒瀉痢、風(fēng)濕痹痛[1]。北豆根的主要活性成分為生物堿，其總生物堿含量為1.7%～2.5%，主要為蝙蝠葛堿、蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛諾林堿、蝙蝠葛新諾林堿、蝙蝠葛可林堿、蝙蝠葛新可林堿、去甲基蝙蝠葛堿、蝙蝠葛新林堿、粉防己

堿[2]，但不同產(chǎn)地的北豆根生物堿種類及含量有一定區(qū)別。本研究檢測(cè)不同產(chǎn)地的北豆根中蝙蝠葛堿的含量，鑒定不同來(lái)源北豆根的優(yōu)劣，為其資源開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-10AT型液相色譜儀、SPD-10A型紫外檢測(cè)器，日本島津公司；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），廣州菲羅門(mén)科學(xué)儀器有限公司；100 μL微量進(jìn)樣器，上海高鴿工貿(mào)有限公司；SB5200D型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；ACCULAB型萬(wàn)分之一電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；24目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司；DFY-200型搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司。

蝙蝠葛堿對(duì)照品（批號(hào)11867-201303），廣州市藥品檢驗(yàn)所；甲醇為色譜純，乙腈、三乙胺為分析純，水為純凈水。北豆根樣品采自不同產(chǎn)地，經(jīng)暨南大學(xué)蔡宇教授鑒定為防己科植物蝙幅葛Menispermum dauricum DC.的干燥根莖，來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1），檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 ?L[3-4]。分離度>3，理論塔板數(shù)按蝙蝠葛堿計(jì)不低于5000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)P2O5干燥至恒重的蝙蝠葛堿對(duì)照品5.0 mg，純乙腈溶解，定容至10 mL容量瓶中，精密量取2 mL，置于10 mL容量瓶中，用純乙腈定容，得100 ?g/mL的貯存液，分別量取2、4、6、8 mL貯存液，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得20、40、60、80 ?g/mL的蝙蝠葛堿對(duì)照品溶液。endprint

2.3 供試品溶液的制備

北豆根樣品粉碎、過(guò)24目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，取過(guò)篩粉末約0.200 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置30 min，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，搖勻，微孔濾膜（0.45 ?m）過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，對(duì)照品與供試品色譜分離效果良好，北豆根樣品中其他成分不干擾蝙蝠葛堿的含量測(cè)定，方法具有較高的專屬性，蝙蝠葛堿的保留時(shí)間為10.349 min。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

吸取“2.2”項(xiàng)下不同濃度的對(duì)照溶液各20 ?L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，以峰面積對(duì)對(duì)照品溶液濃度進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程Y=17 906X-113 056，r=0.999 5，結(jié)果表明蝙蝠葛堿在20～100 ?g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一濃度蝙蝠葛堿對(duì)照品溶液20 ?L，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各色譜峰面積，結(jié)果RSD=1.977%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取同一批次的北豆根樣品約0.200 0 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20 ?L，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄蝙蝠葛堿峰面積，結(jié)果RSD=1.849%，表明供試品溶液中蝙蝠葛堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批次的北豆根樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄蝙蝠葛堿峰面積，結(jié)果RSD=1.240%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次已知含量的北豆根樣品6份，每份約0.100 0 g，精密稱定后分別加入等量的蝙蝠葛堿對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果平均加樣回收率為100.30%，RSD=1.000%，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地的北豆根樣品各約0.200 0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算蝙蝠葛堿含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)提取方法進(jìn)行了考察：①氯仿30 mL及濃氨水1 mL，浸泡過(guò)夜，再加氯仿50 mL，索氏提取3 h[4]；②甲醇20 mL，超聲30 min[5]；③甲醇25 mL，超聲30 min[1]。結(jié)果顯示，①和③含量較高且比較接近，但方法③簡(jiǎn)便，而且節(jié)省能耗和試劑，所以選擇甲醇25 mL超聲30 min作為樣品的提取方式。

試驗(yàn)對(duì)北豆根的流動(dòng)相進(jìn)行篩選，使用不同比例磷酸水與乙腈[6-7]，但蝙蝠葛堿的保留時(shí)間與其溶劑的保留時(shí)間有重疊，2個(gè)峰無(wú)法分開(kāi)，所以使用含有三乙胺和乙腈的流動(dòng)相，結(jié)果流動(dòng)相為乙腈-0.05%三乙胺溶液（45∶55），得到的譜圖良好，但保留時(shí)間在32 min左右，時(shí)間稍長(zhǎng)，最后綜合保留時(shí)間和譜圖形狀，選擇流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1）[8]，該流動(dòng)相得到的譜圖形狀對(duì)稱，峰形良好，保留時(shí)間適合。但是采用乙腈-水-三乙胺（45∶55∶0.1）為流動(dòng)相，其pH值較高，達(dá)到9，所以需選用耐堿性高的色譜柱。

本研究對(duì)不同產(chǎn)地的北豆根進(jìn)行液相分析，在選擇的提取方式和液相條件下，不同來(lái)源的樣品中蝙蝠葛堿的含量不同，其中以來(lái)源于黑龍江葦河的北豆根中含量最高，其次是黑龍江鶴崗，其他產(chǎn)地北豆根中蝙蝠葛堿的含量相對(duì)較低，所以，在應(yīng)用不同產(chǎn)地北豆根時(shí)應(yīng)當(dāng)注意其質(zhì)量的差異。

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（收稿日期：2016-12-26）

（修回日期：2017-01-13；編輯：陳靜）endprint