黃瓜品種田間性狀比對與部分品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建分析

賀長征+劉峰+周瑩

摘 要： 對搜集到的150個(gè)品種進(jìn)行田間品種對比試驗(yàn)，于2016年篩查出30個(gè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃瓜新品種進(jìn)入下一輪田間種植試驗(yàn)，同時(shí)通過田間性狀比對發(fā)現(xiàn)部分品種類型相似。依照《NY/T2474—2013 黃瓜品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建了44個(gè)品種的指紋圖譜，并以指紋數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)利用NTsys分析軟件構(gòu)建了品種聚類圖，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中的判定標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)4組（共計(jì)10個(gè)品種）疑為同品種，7組（共計(jì)20個(gè)品種）為近似品種，最后對田間性狀相似品種和SSR鑒定相似品種進(jìn)行了比較分析。

關(guān)鍵詞： 黃瓜；SSR；品種真實(shí)性；指紋數(shù)據(jù)；聚類分析

中圖分類號(hào)：S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.06.003

Abstract： The field varieties of 150 varieties were compared and tested. In 2016， 30 new varieties of high yield and good quality cucumber were screened and entered the next round of field planting experiment. At the same time， it was found that some varieties were similar by field character comparison. The fingerprints of 44 cultivars were constructed according to “NY/T2474-2013 the technical standard of cucumber variety identification and SSR molecular marker”. Based on the fingerprint data， the dendrogram was constructed by using NTsys analysis software. 4 groups （10 varieties） were suspected to be of the same breed， and the 7 groups （20 varieties） were approximate varieties. Finally， a comparative analysis was made on similar varieties and similar varieties of SSR identification.

Key words： cucumber； SSR； varieties authenticity； fingerprinting data； cluster analysis

黃瓜（Cucumis Sativus L.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis），一年生蔓性或攀援草本植物，在我國已有1500多年的栽培歷史[1]。作為世界十大蔬菜之一，黃瓜在全球的栽培面積僅次于番茄[2]，我國的黃瓜生產(chǎn)總面積與總產(chǎn)量在世界位居榜首，且黃瓜還是我國保護(hù)地栽培作物中第一大蔬菜作物[3]。黃瓜肉質(zhì)脆嫩、汁多味甘，早已實(shí)現(xiàn)周年供應(yīng)，其育種研究多次列入國家級(jí)項(xiàng)目[4]，我國在黃瓜育種工作中不斷獲得重大進(jìn)展。黃瓜產(chǎn)業(yè)是天津市的技術(shù)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，種植面積達(dá)每年1.2×104 hm2，每年產(chǎn)量76×104 t。隨著黃瓜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展以及國家政策的不斷放開，大量種子公司不斷涌現(xiàn)，造成了目前黃瓜種業(yè)市場秩序混亂，小、散、亂現(xiàn)象特別突出，嚴(yán)重危害了品種所有企業(yè)的利益，導(dǎo)致國內(nèi)黃瓜主導(dǎo)企業(yè)優(yōu)勢地位和市場占有率下降，影響了黃瓜種業(yè)的有序發(fā)展，給生產(chǎn)造成極大損失。

國際植物品種權(quán)保護(hù)組織（UPOV， 2005）在BMT測試指南草案中，將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP，其中SSR具有按照孟德爾遺傳方式分離、共顯性遺傳、位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、試驗(yàn)程序簡單等優(yōu)點(diǎn)[5]，在農(nóng)作物品種鑒定的研究上得到了廣泛的應(yīng)用。在黃瓜品種真實(shí)性的鑒定方法中，田間種植鑒定方法直觀、可靠，但是費(fèi)時(shí)、費(fèi)工、成本高，需要2～3個(gè)月才能出結(jié)果，周期長、工作量大、且易受環(huán)境因素的影響[3]。2009年，黃瓜全基因測序的完成[6]，分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，使得利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種的真實(shí)性鑒定成為可能。2014年4月，《NY/T 2474—2013 黃瓜品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法》實(shí)施，為我國規(guī)范黃瓜種業(yè)提供了標(biāo)準(zhǔn)支撐。本研究旨在對搜集到的150個(gè)品種進(jìn)行田間品種對比試驗(yàn)，并隨機(jī)選擇44個(gè)品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建、真實(shí)性鑒定和遺傳距離分析等實(shí)驗(yàn)室研究工作。

1 材料和方法

1.1 材 料

以天津市優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)單位天津科潤黃瓜研究所、天津德瑞特種業(yè)有限公司研發(fā)的新品種為主要對象，同時(shí)搜集北京、廣東、山東、上海等地市場上各種類型的黃瓜栽培品種，共收集到黃瓜新品種150個(gè)。對收集的樣品分類整理、編號(hào)，進(jìn)行品種真實(shí)性鑒定標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用研究，同步安排田間比對試驗(yàn)。

35對SSR引物序列來自于NY/T 2474—2013，編號(hào)依次為CU01-CU35，全部由ABI公司合成。PCR反應(yīng)中的dNTP和Taq酶購自北京柏樹美生物技術(shù)有限公司（Genacea）。

1.2 方 法

1.2.1 田間試驗(yàn) 對項(xiàng)目收集的150個(gè)黃瓜品種樣品安排田間對比試驗(yàn)。試驗(yàn)地點(diǎn)為天津市科潤黃瓜研究所，2016年3月28日大棚直播，每品種播一行，對照品種為津優(yōu)35。田間調(diào)查記載性狀為節(jié)位、瓜長、把長、色澤、抗病性、產(chǎn)量等。

1.2.2 DNA提取 黃瓜干種子DNA提取方法：隨機(jī)數(shù)取30粒種子，加入適量石英砂，德國Restech研磨儀，頻率29 frequency·s-1，時(shí)間30 s至粉末狀，取樣100 mg左右至離心管，利用天根植物DNA提取試劑盒，按照步驟提取，所提DNA經(jīng)K5500超微量分光光度計(jì)測量DNA的濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增采用384孔板12 μL體系進(jìn)行（表1）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；16 ℃保存。

1.2.4 等位基因檢測 將35對黃瓜SSR引物根據(jù)等位基因變異范圍和顏色將其分成8組（表2），同一組內(nèi)引物PCR產(chǎn)物混合，將每一對PCR產(chǎn)物稀釋13倍。從混合液中吸取1 μL加入到DNA分析儀（ABI 3500XL）深孔板中。板中各孔加入0.1 μL LIZ500分子量內(nèi)標(biāo)和8.9 μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95 ℃變性5 min，4 ℃保存。瞬間離心10 s后上機(jī)電泳。

1.3 數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計(jì)分析

（1）數(shù)據(jù)記錄。使用DNA分析儀3500XL的片段分析軟件Genemapper，編寫Panel，讀出每個(gè)位點(diǎn)每個(gè)樣品的等位基因擴(kuò)增片段大小數(shù)據(jù)。

（2）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。利用NTSYS-pc 軟件（Version 2.10e）計(jì)算Dice遺傳相似性系數(shù)GS=2a/（2a+b+c）。其中：a為任意兩品種共享譜帶數(shù)；b和c為相應(yīng)兩品種間的差異條帶。用UPGMA（Unweighted pair grouping method with arithmetic mean）法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間調(diào)查結(jié)果

2016年5月12日至6月29日共摘瓜21次。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，篩查出30個(gè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃瓜新品種進(jìn)入下一輪田間種植試驗(yàn)（表3），同時(shí)通過田間性狀比對發(fā)現(xiàn)部分品種類型相似（表4）。

2.2 44份黃瓜品種指紋數(shù)據(jù)

使用DNA片段大小分析軟件，讀出每個(gè)位點(diǎn)每個(gè)樣品的等位基因擴(kuò)增片段大小數(shù)據(jù)，利用SSR數(shù)據(jù)處理宏程序DataTrans1.0[7]將片段大小數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為1和0，構(gòu)建品種的指紋數(shù)據(jù)（表5）。

2.3 44份品種聚類分析

利用NTSYS-pc 軟件（Version 2.10e）計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。44個(gè)品種在遺傳相似系數(shù)為0.81的時(shí)候聚為一類（圖1），品種整體上遺傳基礎(chǔ)狹窄。品種間的遺傳距離較近也反映了黃瓜育種種質(zhì)間遺傳距離狹窄，黃瓜育種若在遺傳基礎(chǔ)狹窄的種質(zhì)基礎(chǔ)上增大品種間的特異性困難就很大。提高黃瓜育種種質(zhì)本身的遺傳多樣性，加大不同地區(qū)的黃瓜種質(zhì)材料的交換使用，加強(qiáng)不同育種單位之間育種工作的合作，是提高黃瓜品種特異性的一條重要途徑。

在遺傳相似系數(shù)為1時(shí)，10個(gè)品種分為4組：①②③④。津綠30-8和博杰616為①組，指紋數(shù)據(jù)完全相同，疑為同品種，依次類推其他3組。在遺傳相似系數(shù)大于0.98時(shí)，20個(gè)品種分為7組：I～VII，指紋數(shù)據(jù)僅有1個(gè)位點(diǎn)差別，為近似品種（圖2）。

2.4 田間性狀相似品種和SSR鑒定相似品種比較分析

在隨機(jī)選擇的44份用于SSR指紋分析的品種中，有17個(gè)品種為田間性狀相似品種。17個(gè)品種分別為德瑞特8-9B，博耐E02，金胚98，津綠21-10，盛豐908，蔬春寶秀，騰達(dá)黃瓜，乾德二號(hào)，佳育908，中研二十一優(yōu)，中華518，大澳001，盛美186，瑞新金寶，中研十九，妙收冠軍，佳育18。

17個(gè)田間性狀相似品種中，SSR指紋數(shù)據(jù)分析結(jié)果為近似品種的有11個(gè)，分別為德瑞特8-9B，博耐E02，金胚98，津綠21-10，盛豐908，蔬春寶秀，乾德二號(hào)，中研二十一優(yōu)，中華518，瑞新金寶，妙收冠軍。

SSR指紋數(shù)據(jù)分析結(jié)果為近似品種中的9個(gè)品種，在2016年田間性狀比較中未被記錄為相似品種，分別為津綠30-8，博杰616，博杰100，津優(yōu)301號(hào)，津優(yōu)35號(hào)，津綠1900，盛美190，博杰105和華夏617。

在2017年的田間性狀觀察中，應(yīng)重點(diǎn)記錄上述9個(gè)品種的田間數(shù)據(jù)，進(jìn)一步加強(qiáng)SSR在品種真實(shí)性鑒定中的作用。

3 結(jié) 論

本研究對搜集到的150個(gè)品種進(jìn)行田間品種對比試驗(yàn)，于2016年篩查出30個(gè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃瓜新品種進(jìn)入下一輪田間種植試驗(yàn)，同時(shí)通過田間性狀比對發(fā)現(xiàn)有24個(gè)品種類型相似。利用SSR技術(shù)構(gòu)建了44個(gè)品種的指紋圖譜，應(yīng)用NTsys分析軟件構(gòu)建了品種聚類圖，發(fā)現(xiàn)20個(gè)品種為相似品種。分析表明，17個(gè)田間性狀相似品種中，使用SSR指紋數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)為近似品種的有11個(gè)。SSR指紋數(shù)據(jù)分析結(jié)果為近似品種的9個(gè)品種，在2016年田間性狀比較中未被記錄為相似品種，在2017年的田間觀察中應(yīng)詳細(xì)記錄并分析研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]周長久.蔬菜種質(zhì)資源概論[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1995：163.

[2]李懷智.我國黃瓜的栽培現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢[J].蔬菜，2003（8）：3-4.

[3]程周超.黃瓜SSR遺傳圖譜的構(gòu)建及黃瓜重要農(nóng)藝性狀的QTL定位[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，2010.

[4]顧興芳，張圣平，王燁.我國黃瓜育種研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，2005（12）：1-7.

[5]EUJAY L，SLEDGE M K ，WANG L. Medicago truncatula EST-SSRs reveal cross-species genetic markers for medicago spp[J].Theor appl genet，2004，108（3）：414-422.

[6]REN Y， ZHANG Z H， LIU J H. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome[J].Plos one，2009，4（6）：e5795.

[7]蓋紅梅，任民. SSR 數(shù)據(jù)處理宏程序 DataTrans 1.0[J].分子植物育種，2011（9）：48.