HXKs基因在香蕉果實后熟過程中功能初探

李成梁 馮仁軍 盧利方 云天艷 張恒 張銀東 張錫炎

摘 要 香蕉是世界主要水果之一，對乙烯非常敏感，屬于呼吸躍變型果實。目前，香蕉果實后熟機理還未完全探明，后熟過程中己糖激酶（HXK）與乙烯的關(guān)系還不清楚。通過BLAST比對從香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)HXK基因家族的11個成員，經(jīng)克隆獲得這些基因的序列，并研究HXKs基因在香蕉果實自然后熟過程中的轉(zhuǎn)錄表達譜，重點研究乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP對HXKs基因表達、HXK酶活和內(nèi)源乙烯生物合成的影響。結(jié)果表明：在香蕉果實后熟過程中HXKs基因呈現(xiàn)差異性表達，乙烯利上調(diào)大多數(shù)HXKs基因的表達和HXK酶活，1-MCP的作用正好相反，這表明外源乙烯正作用于HXK。另一方面，甘露糖加快內(nèi)源乙烯生物合成，NAG卻推遲內(nèi)源乙烯生物合成，這說明HXK正作用于內(nèi)源乙烯生物合成。所以，在香蕉果實后熟過程中乙烯和HXK之間存在相互促進的關(guān)系。這將為進一步闡明香蕉果實后熟機制提供理論依據(jù)，也將為香蕉果實保鮮新技術(shù)的挖掘提供新思路。

關(guān)鍵詞 香蕉果實后熟；HXKs基因；表達分析；酶活；乙烯生物合成

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Abstract Banana is one of the staple fruit in the world that belongs to the respiratory climacteric fruit and is very sensitive to ethylene. The mechanism of banana fruit ripening is not fully proved at present， and the relationship between hexokinase（HXK）and ethylene during banana fruit ripening is not clear yet. In this study， the 11 members of the HXK gene family were retrieved from the banana genomic database by Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）， and the sequences of HXKs genes were obtained by cloning. Simultaneously， the expression profiles of the HXKs genes were researched on transcriptional level in naturally ripened banana fruit. Then， it was mainly studied how ethephon， mannose， N-acetylglucosamine（NAG）and 1-methylcyclopropene（1-MCP）affected the expression of HXKs genes， HXK activity， and ethylene content in the treated banana fruit with the four reagents. The results showed that the expression profiles of HXKs genes were differential during the ripening process of banana fruit. The expression of most HXKs genes and HXK activity increased by ethephon during ripening porcess， although 1-MCP having the contrary effect， which indicated that ethylene positively affected the functions of HXK. On the other hand， mannose induced ethylene biosynthesis， but NAG suppressed ethylene biosynthesis， which implied that HXK also promoted ethylene biosynthesis. Those results suggest that there was a positive interaction between ethylene and HXK during ripening process of banana fruit. It would provide a theoretical basis for further elucidating the mechanism of banana fruit ripening and also help us discover a novel strategies to dig new methods of fresh-keeping for banana fruit.

Key words banana fruit ripening； HXKs genes； expressional analysis； enzymic activity； ethylene biosynthesis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.012

香蕉（Musa spp.）作為世界主要水果之一，鮮果銷售量達到了全球第一[1]。但香蕉果實不耐貯藏的特性嚴重影響香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。其主要原因之一就是香蕉果實是一種呼吸躍變型果實，采摘后會出現(xiàn)內(nèi)源乙烯大量產(chǎn)生，呼吸速率急劇升高，并快速完全后熟的現(xiàn)象[3]。香蕉果實對乙烯非常敏感[4]，乙烯在香蕉果實后熟過程中起著重要作用，因為外源乙烯能誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯的提早釋放[5]。剛采收的香蕉果實中淀粉約占鮮重的20%，約占干重的85%[6]。在香蕉果實后熟過程中，淀粉合成相關(guān)的酶活性降低，分解相關(guān)的酶活性增加，大部分淀粉被轉(zhuǎn)變成可溶性糖[7]，然后可溶性糖主要通過糖酵解途徑被分解成為丙酮酸和乳酸[8]。因此，糖酵解在香蕉果實后熟糖分解代謝過程中起著重要作用。己糖激酶（hexokinase，HXK）是在動物、植物和微生物中普遍存在的一種酶[9]。HXK是生物體內(nèi)葡萄糖進行糖酵解的啟動酶，同時也是糖酵解途徑的限速酶[10]。在糖酵解的活化階段，HXK在Mg2+參與下催化葡萄糖磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖[11]，此外，他還對葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖等己糖均具有磷酸化的作用，是生物體內(nèi)的糖感受器[12]。植物體HXK亞細胞定位顯示，其主要存在于線粒體和葉綠體等細胞器膜上和細胞質(zhì)中，另外，細胞核和高爾基體中也有分布[13]。己糖激酶通常存在多個功能位點，在生物體內(nèi)發(fā)揮的功能極為復(fù)雜，能夠介導(dǎo)植物體內(nèi)的多種糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[14-19]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，許多植物中內(nèi)源乙烯生物合成與糖信號途徑存在諸多聯(lián)系[20-23]，但香蕉果實中己糖激酶與乙烯信號途徑之間的關(guān)系仍不明確。

為了探明香蕉果實中己糖激酶與乙烯信號途徑之間的關(guān)系，本研究應(yīng)用乙烯利（乙烯供體）、甘露糖（HXK底物）、N-乙酰葡糖胺（N-acetylglucosamine，NAG，HXK酶活抑制劑）、1-甲基環(huán)丙?。?-methylcyclopropene，1-MCP，乙烯功能抑制劑）4種藥劑分別處理香蕉果實，研究這些處理對HXKs基因轉(zhuǎn)錄表達、HXK酶活和內(nèi)源乙烯含量的影響。通過上述研究，以期明確在香蕉果實采后成熟過程中己糖激酶與內(nèi)源乙烯生物合成的關(guān)系，從而闡明香蕉HXK基因家族在果實后熟過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本試驗所采用的植物材料為巴西蕉，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所試驗基地，所采收的香蕉果實來自同一束香蕉花序，八成熟。挑選發(fā)育良好、無外傷、長勢相近的香蕉果實作為試驗材料。

1.1.2 試劑 乙烯利購于安陽全豐生物科技有限公司（LS20071780）；1-MCP購于美國AgroFresh公司；NAG和甘露糖購于上海寶曼生物科技有限公司；RevertAidTM Premium Reverse Transcriptase購于Fermentas公司；熒光定量PCR（qRT-PCR）中使用的SYBRR Select Master Mix試劑盒購于Life公司；己糖激酶試劑盒購于蘇州科銘生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗材料的處理 0.1 g/kg的乙烯利和0.12 mmol/L的甘露糖水溶液在不傷害香蕉果實的前提下對香蕉果實分別具有最佳的催熟和保鮮作用；0.08 mmol/L的NAG水溶液在不傷害香蕉果實的前提下對香蕉果實具有最佳的保鮮作用；AgroFresh公司的1-MCP預(yù)裝包對香蕉果實具有良好的保鮮效果。首先，對挑選出來的香蕉果實進行快速的表面消毒和清洗，等表面水漬風(fēng)干后將其分成5組：1個對照（CK）組，4個處理（乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP）組；然后將上述濃度的藥品溶液均勻地涂抹在香蕉果實的表面，待其表面水漬風(fēng)干后裝入密閉的保鮮袋，置于培養(yǎng)箱中（溫度25 ℃、濕度85%、光照12 h）保存；從處理時開始計算，每隔1 d（第0，2，4，6，8……天）取一次樣品，直至香蕉果實腐爛；對取得的樣品按果皮、果肉進行分開收集，貯于-80 ℃待用。

1.2.2 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 本試驗采用改良CTAB法提取處理組和對照組香蕉果肉和果皮的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，利用紫外分光光度計檢測其純度。參照試劑盒說明書，采用Fermentas公司RevertAidTM Premium Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒對消化過DNA的總RNA進行cDNA第一鏈的合成，以香蕉Actin基因為參照（引物見表1），通過PCR方法檢測反轉(zhuǎn)錄效果。

1.2.3 HXKs基因在香蕉果實自然后熟過程中和不同處理下的表達分析 通過在The Banana Genome Hub（http：//banana-genome.cirad.fr/）上進行在線BLAST分析，獲得了香蕉HXKs基因；利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計這些基因的PCR引物，采用對PCR產(chǎn)物測序的方法驗證引物是否有效；以反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，Actin基因為內(nèi)參，參照試劑盒說明書，利用Life公司SYBRR Select Master Mix qRT-PCR試劑盒檢測HXKs基因在自然后熟過程中和不同處理條件下香蕉果肉和果皮中的表達情況。采用2-△△Ct（Cycle threshold，Ct）法計算處理組與對照組的表達差異[24]，計算公式為：目的基因相對表達量為2-△△Ct；△△Ct=△Ct（CK組）-△Ct（處理組）；△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）。

1.2.4 HXK酶活力測定 參照試劑盒說明書，采用蘇州科銘生物技術(shù)公司生產(chǎn)的己糖激酶試劑盒對香蕉果實的己糖激酶進行提取和酶活力檢測。每隔1 d（第0，2，4，6，8……天）檢測一次酶活力，直至香蕉果實腐爛。

1.2.5 內(nèi)源乙烯含量測定 本試驗采用島津GC2010氣相色譜儀測量處理組及對照組香蕉果實的內(nèi)源乙烯產(chǎn)量，每隔1 d（第0，2，4，6，8……天）檢測一次內(nèi)源乙烯含量，直至香蕉果實腐爛。

1.3 統(tǒng)計分析

本試驗對各個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，處理與對照數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，以p值<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

提取各樣品的總RNA后，并對其進行質(zhì)量檢測。總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，28S、18S條帶清晰，且前者亮度大概是后者的2倍，說明提取的總RNA未出現(xiàn)降解。用紫外分光光度計對總RNA進行檢測，OD260/OD280在1.8～2.0之間，說明多糖和蛋白等雜質(zhì)含量較低，總RNA質(zhì)量符合后續(xù)試驗的要求。反轉(zhuǎn)錄后，利用Actin基因的引物對合成的cDNA進行PCR檢測，結(jié)果表明，本試驗獲得了Actin基因的特異性條帶，這說明合成的DNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)的qRT-PCR試驗。

2.2 香蕉HXKs基因的克隆

通過The Banana Genome Hub在線BLAST分析后，獲得了11個香蕉HXKs基因。根據(jù)這11個HXKs基因的序列特征設(shè)計了相應(yīng)的PCR引物（表1）。引物合成后，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板對HXKs基因進行了PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物回收后委托生工生物工程上海（股份）有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)過BLAST對比后，方可確認為目的基因。HXB1和HXA1基因經(jīng)過多對引物的PCR反應(yīng)均未能擴增出目的片段，因此，這2個基因可能在香蕉果實中低表達或不表達。

2.3 香蕉HXKs基因的分組和染色體定位

根據(jù)HXKs基因的序列特征，將其分成A、B和C 3個組。A組包括HXA1、HXA2和HXA3，B組由HXB1、HXB2、HXB3和HXB4組成，C組包含HXC1、HXC2、HXC3和HXC4。11個香蕉HXKs基因在染色體上的位置見表2。

2.4 各種處理對香蕉果實表觀形態(tài)的影響

乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP處理香蕉果實后，隨著時間推移，香蕉果實的表觀形態(tài)變化不同。由圖1可知，乙烯利處理的香蕉果實已經(jīng)完全變軟，果皮已經(jīng)變黑，果實開始腐爛（處理后第8天）；甘露糖處理的香蕉果實才剛后熟，果皮變黃，果實變軟；NAG和1-MCP處理及對照的香蕉果實仍然生硬，果皮為綠色。通過多天的表觀觀察后發(fā)現(xiàn)，乙烯利、甘露糖對香蕉果實有催熟作用，且乙烯利的催熟作用效果顯著優(yōu)于甘露糖；NAG和1-MCP對香蕉果實具有保鮮作用，且1-MCP的保鮮作用效果明顯優(yōu)于NAG。

2.5 香蕉果實自然后熟過程中HXKs基因的轉(zhuǎn)錄表達譜

在香蕉果實自然后熟（未使用任何藥劑）過程中HXKs基因的表達存在差異（圖2）?？傮w來看，果皮中，HXC3的表達量最高，其次是HXB2，然后是HXB4和HXA2，而HXA3、HXB3、HXC1、HXC2和HXC4的表達處于很低的水平或未檢測到；在果肉中，HXC3的表達量也是最高，其次是HXB4和HXB2，然后是HXC4、HXA2、HXC2、HXC1，其余基因的表達處于很低的水平或檢測不到。

2.6 各種處理對香蕉果實HXKs基因轉(zhuǎn)錄表達的影響

各種處理對香蕉果實HXKs基因轉(zhuǎn)錄表達的影響不同。由圖3可知，在果皮中，乙烯利誘導(dǎo)HXB2、HXC1、HXC2、HXC3、HXC4、HXA2和HXB4的表達，抑制HXA3的表達，基本不影響HXB3的表達；甘露糖上調(diào)HXB2、HXC2、HXC3、HXC4、HXA2和HXB4的表達，下調(diào)HXA3的表達，對HXC1和HXB3的表達影響不大；NAG抑制HXC2、HXC3和HXA2的表達，對HXB2、HXC1、HXB3、HXC3、HXC4、HXA3和HXB4的表達影響不大；1-MCP僅誘導(dǎo)HXC1的表達，抑制HXB2、HXB3、HXC2、HXC3、HXA2和HXA3的表達，基本不影響HXC4和HXB4的表達。由圖4可知，在果肉中，乙烯利誘導(dǎo)HXB2、HXC4和HXA3的表達，抑制HXC1、HXB3、HXC3和HXB4的表達，基本不影響HXC2和HXA2的表達；甘露糖上調(diào)HXC1和HXB3的表達，下調(diào)HXC3的表達，對HXB2、HXC2、HXC4、HXA2、HXA3和HXB4的表達影響不大；NAG誘導(dǎo)HXB3和HXB4的表達，抑制HXB2、HXC3、HXC4和HXA3的表達，對HXC1、HXC2和HXA2的表達影響不大；1-MCP誘導(dǎo)HXC1和HXB4的表達，抑制HXB2、HXC2、HXC3、HXC4和HXA3的表達，基本不影響HXB3和HXA2的表達。這些結(jié)果表明，乙烯利和甘露糖在香蕉果皮中誘導(dǎo)了大部分HXKs基因的表達，而1-MCP和NAG在香蕉果皮中卻抑制了大部分HXKs基因的表達；果肉中的情況恰好與果皮相反。乙烯利和1-MCP的作用較強，甘露糖和NAG的作用較弱。結(jié)合香蕉果實的表觀特征，發(fā)現(xiàn)果皮中HXKs基因的高水平表達出現(xiàn)的先后與各個處理對香蕉果實后熟快慢的影響呈正相關(guān)。

2.7 各種處理對香蕉果實中HXK酶活的影響

4種處理對香蕉果實中HXK酶活的影響見圖5。在香蕉果實自然后熟（CK組）過程中，HXK酶活力逐漸升高，到第8天出現(xiàn)一個酶活平臺期，從第10天開始酶活再次升高，到第12天時酶活達到峰值，為初始酶活的7倍，然后迅速下降。前8 d，乙烯利和甘露糖處理香蕉果實的HXK酶活顯著上升，且乙烯利處理香蕉果實的HXK酶活高于甘露糖處理香蕉果實的HXK酶活；此時NAG和1-MCP處理香蕉果實的HXK酶活僅維持在初始水平。以上結(jié)果表明，乙烯利和甘露糖誘導(dǎo)HXK酶活的升高，1-MCP和NAG卻抑制HXK酶活的升高。乙烯利和1-MCP的作用較強，甘露糖和NAG的作用較弱。結(jié)合香蕉果實的表觀特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HXK高水平酶活出現(xiàn)時間的早晚與各個處理對香蕉果實后熟快慢的影響呈正相關(guān)。

2.8 各種處理對香蕉果實中內(nèi)源乙烯含量的影響

為了探明4種處理對香蕉果實中內(nèi)源乙烯含量的影響，對不同處理的香蕉果實進行了內(nèi)源乙烯含量跟蹤監(jiān)測（圖6）。各處理檢測到內(nèi)源乙烯的時間存在先后差異，乙烯利處理的香蕉果實在第4天就檢測到內(nèi)源乙烯，甘露糖處理的香蕉果實第6天檢測到內(nèi)源乙烯，自然后熟香蕉果實（CK組）第10天檢測到內(nèi)源乙烯，NAG處理的香蕉果實第12天檢測到內(nèi)源乙烯，1-MCP處理的香蕉果實直到第16天才檢測到微量內(nèi)源乙烯。以上結(jié)果表明，乙烯利和甘露糖促進內(nèi)源乙烯生物合成，1-MCP和NAG卻抑制內(nèi)源乙烯生物合成。乙烯利和1-MCP的作用較強，甘露糖和NAG的作用較弱。結(jié)合香蕉果實的表觀特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量內(nèi)源乙烯生物合成的先后與各個處理對香蕉果實后熟快慢的影響結(jié)果一致。

3 討論

HXK是植物體內(nèi)糖酵解的啟動酶，同時也是糖酵解途徑的限速酶[10]，他不僅參與糖的代謝，同時也參與糖信號感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[13]，在香蕉果實后熟過程中發(fā)揮著重要作用。本試驗研究了HXKs基因在香蕉果實后熟過程中的表達變化規(guī)律，重點研究了乙烯利、甘露糖、NAG和1-MCP對HXKs基因表達、HXK酶活和內(nèi)源乙烯生物合成的影響，結(jié)果表明，HXKs基因在香蕉果實后熟過程中呈現(xiàn)差異性表達。乙烯利和甘露糖在香蕉果皮中誘導(dǎo)了大部分HXKs基因的表達，而1-MCP和NAG在香蕉果皮中卻抑制了大部分HXKs基因的表達；果肉中的情況恰好與果皮相反。乙烯利和甘露糖促進HXK酶活的升高和內(nèi)源乙烯生物合成，1-MCP和NAG卻抑制HXK酶活的升高和內(nèi)源乙烯生物合成。結(jié)合香蕉果實的表觀特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙烯利和甘露糖促進香蕉果實后熟，1-MCP和NAG卻抑制香蕉果實后熟。在各種處理對HXKs基因表達的影響試驗中，發(fā)現(xiàn)部分HXKs基因在果皮和果肉中的表達模式相反，這與Inaba等[25]的研究結(jié)果一致。Inaba等[25]發(fā)現(xiàn)香蕉果皮中基因的表達特征與果實后熟進程呈正相關(guān)，然而，由于負反饋抑制作用的影響，果肉中基因的表達特征與果實后熟進程呈負相關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在香蕉果實后熟過程中乙烯利上調(diào)大多數(shù)HXKs基因的表達和HXK酶活，1-MCP的作用正好相反，這表明外源乙烯正向作用于HXK。另一方面，甘露糖加快內(nèi)源乙烯生物合成，NAG卻推遲內(nèi)源乙烯生物合成，這說明HXK正向作用于內(nèi)源乙烯生物合成。因此，在香蕉果實后熟過程中乙烯和HXK之間存在相互促進的關(guān)系。但在擬南芥生長過程中卻發(fā)現(xiàn)，葡萄糖通過其感應(yīng)子己糖激酶加快EIN3（ethylene-insensitive 3）的降解，從而拮抗乙烯信號途徑[26]。其原因可能為：首先，香蕉果實后熟過程與擬南芥生長過程是完全不同的兩個過程，因此，乙烯信號途徑和葡萄糖信號途徑在這兩個過程中的作用可能不同；其次，香蕉果實是光合作用“庫”，而擬南芥的葉和根是光合作用“源”，所以，乙烯信號途徑和葡萄糖信號途徑在“源”和“庫”中的作用也可能不同。當(dāng)然，這些還需要進一步的試驗證實。

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